酶制剂的发酵(培养)生产

酶浓 度 (U)
浓度
同步合成型
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细胞浓度 酶浓度
中期合成型
细胞浓度 酶浓度
延续合成型
酶浓度 细胞浓度
滞后合成型
酶浓度
细胞浓度
时间(h)
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影响酶生物合成的模式的主要因素是：
（1）mRNA的稳定性； （2）培养基中阻遏物存在与否。
规律：
（1）mRNA稳定性高，细胞停止生长后继续合成其所对应的酶； （2）mRNA稳定性差，酶的合成随着细胞停止生长而终止； （3）受某些物质阻遏，细胞生长一段时间或在平衡期后（解除 阻遏），开始合成酶。 （4）不受某些物质阻遏，酶的合成随着细胞生长而同步增长。
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3、微生物发酵法
是20世纪50年代以来生产酶的主要方法。
利用微生物细胞的生命活动合成所需酶的方法称 为发酵法。 酶的发酵生产是现在酶生产的主要方法。 经过预先设计，通过人工操作控制，利用细胞 （包括微生物细胞、动植物细胞）的生命活动， 产生人们所需的酶的过程，称为酶的发酵生产。
R
T
LacZ
LacY
Laca
T 基 因 表 达
mRNA
RNA 聚合酶
mRNAZ
mRNAY
mRNAa
CAP
cAMP -CAP
葡萄糖降解物与cAMP的关系
ATP 葡萄糖
降低cAMP浓度 cAMP 使CAP呈失活状态
腺苷酸 环化酶 cAMP
抑制
CAP：降解物基因活化蛋白（catabolic gene activation protein）
第三章 酶制剂的发酵（培养）生产
本章主要内容： 酶生物合成的基本理论； 发酵产酶的工艺条件及控制； 酶发酵动力学；
固定化细胞和原生质体发酵产酶。
重点： 酶生物合成的基本理论； 微生物发酵产酶工艺。 难点：
酶生物合成的诱导和阻遏；
发酵过程细胞生长与酶合成之 间的关系。
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选择与改造
（1）选择最理想的酶合成模式——延续合成型； （2）改造非理想模式 A、同步合成型：适当降低发酵温度，尽量提 高相应的mRNA的稳定性； B、滞后合成型：尽量减少甚至解除分解代谢 物阻遏，使酶合成提早开始； C、中期合成型：努力提高mRNA稳定性，解 除代谢物阻遏物。
调节基因
启动基因 操纵基因
结构基因
阻遏蛋白阻挡操纵基因 结构基因不表达
酶 的 诱 导 和 阻 遏 操 纵 子 模 型
A.有活性阻遏蛋白
阻遏蛋白 (有活性)
诱 导
B.有活性阻遏蛋白加诱导剂
mRNA 酶蛋白 诱导物 诱导物与阻遏蛋白结合,使阻遏蛋白不能起 到阻挡操纵基因的作用,结构基因可以表达
C.无活性阻遏蛋白
诱导物
酶的阻遏 无活性 － 阻遏物
－
转录， 继而翻译
乳糖操 纵子
＋
不转录， 色氨酸 继而不翻译 操纵子
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3.分解代谢物阻遏
指细胞内同时有两种分解底物（碳 源或氮源）存在时，利用快的那种 分解底物会阻遏与利用慢的底物的 分解有关的酶的合成的现象。
A1 B1 E A2 × B2
1、酶的合成受产物的反 馈阻遏或分解代谢物阻遏。 2、所对应的mRNA是不稳 定的。
细胞 浓 度(OD500) 酶浓 度(U/mL)
0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0
细胞 浓 度 酶浓 度
0
2
4
6
8
10
时 间 (h)
枯草杆菌碱性磷酸酶合成曲线
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3.延续合成型（又称部分生长偶联型）
实验：细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基上生长，优
先利用葡萄糖。待葡萄糖耗尽后才开始利用乳糖，产 生了两个对数生长期中间隔开一个生长延滞期的“二 次生长现象”(diauxie或biphasic growth）。
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分解代谢物阻遏
CAP 基因 CAP结 合部位
结构基因
P O
转录
RNA聚合酶 翻译
（ -） （+） 转录
mRNA 翻译
阻遏蛋白
蛋白质
诱导剂
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(二) 酶合成调节的类型
1.诱导 (induction)
组成酶：细胞固有的酶类。 诱导酶：是细胞为适应外来底物或其结构类似
物而临时合成的一类酶。
2.阻遏 (repression)
分解代谢物阻遏(catabolite repression) 反馈阻遏(feedback repression)
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胞浓度 (g/L) 细
酶
40
37.5
特点：可受诱导，一般不受分解代谢物阻遏。 所对应的mRNA相当稳定。 但存在阻遏物时，合成模式转为滞后型。
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4.滞后合成型（又称非生长偶联型）
只有当细胞生长进入平衡期以后，酶才开始合成 并大量积累。许多水解酶的生物合成都属于这一类型。
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-半乳糖苷透过酶
硫代半乳糖苷转乙酰酶
调节 基因 R
启 动 操纵 子 基因
P O LacZ
乳糖结构基因
LacY Laca
mRNA
基
阻遏蛋白 （有活性）
因
关
闭
诱 导
A乳糖操纵子的结构
启 动 操纵 子 基因 P O 乳糖结构基因 LacZ LacY Laca
调节 基因
胞内
胞外
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二、酶生物合成的调节
按酶生物合成的速度把细胞中合成的酶分为两类： 组成酶—恒定（速度、浓度） 诱导酶—
(适应型酶、 调节型酶)
在外界环境因素诱导下合成速 度急增，酶浓度成百上千倍增 加
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基因操纵子调节系统示意图
操纵子 控制区 调节基因 启动基因 操纵基因 信息区 结构基因 DNA
4、固定化原生质体发酵（80年代中期发展）
原生质体是指除去了细胞壁的微生物细胞或植物细胞。
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第一节 酶生物合成的基本理论 一、酶生物合成的基本过程
DNA
转录
RNA
翻译
蛋白质（新生多肽链）
酶合成的 调节控制
加工 转录水平的调节 ：基因调控 转录产物的加工调节 成熟蛋白质（酶） 翻译水平的调节 分泌或定位 翻译产物的加工调节 酶降解调节
mRNA
阻遏蛋白(无活性)
酶蛋白 阻遏蛋白不能跟操纵基因结合, 结构基因可以表达
阻 遏
D.无活性阻遏蛋白加辅阻遏剂
代谢产物与阻遏蛋白结合,从而使阻遏蛋 白能够阻挡操纵基因,结构基因不表达
代谢产物
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酶合成的诱导与阻遏操纵子模型调控作用对比
调控方式 阻遏蛋白 添加物 与操纵基 阻遏效应 因结合 酶的诱导 有活性 － ＋ 不转录， 继而不翻译 举例
5'-AMP
磷酸二酯 酶 激活
分解代 谢产物
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三、酶生物合成的模式
细胞浓度 (g/L)
O
A
B
C
D
E
培养 时间 (h)
细胞生长曲线
O-A 延迟期 A-B指数生长期 B-C减速期 C-D 静止期 D-E 衰亡期
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根据酶的合成与细胞生长之间的关系，可将 酶的生物合成分为四种模式(三大类型)，即： 同步合成型 生长偶联型—— 中期合成型 部分生长偶联型——延续合成型 非生长偶联型 —— 滞后合成型
3、霉菌
黑曲霉：糖化酶、α -淀粉酶、酸性蛋白酶、果胶酶、葡 萄糖氧化酶、过氧化氢酶、核糖核酸酶、橙皮苷酶等。 米曲霉：氨基酰化酶、磷酸二酯酶、果胶酶等。 红曲霉：α -淀粉酶、糖化酶、麦芽糖酶、蛋白酶等。 青霉：葡萄糖氧化酶、苯氧甲基青霉素酰化酶、纤维素酶 等。 木霉：纤维素酶。 根霉：糖化酶、蔗糖酶、碱性蛋白酶，脂肪酶、果胶酶、 纤维素酶、半纤维素酶等。 毛霉：蛋白酶、糖化酶、α -淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、 凝乳酶等。
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第二节 产酶微生物的特点
（一）产酶菌种的要求
（1）产酶量高； （2）繁殖快，发酵周期短；
（3）产酶稳定性好，不易退化，不 易被感染；
（4）能够利用廉价原料，容易培养 和管理； （5）安全性可靠，非致病菌。
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（二）、常用的产酶微生物 1、细菌
50 50 40 30 20
细胞 或酶浓 度
细胞 酶
细胞 浓 度 (g/L)
40 30 20 10 0
酶浓 度 细胞 浓 度
0 20 40 60 80
10 0
c
时 间
时 间 (h)
黑曲霉酸性蛋白酶合成曲线
特点：受分解代谢物的阻遏作用。 所对应的mRNA稳定性高。
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R mRNA
mRNAZ 乳糖 阻遏蛋白 （有活性） 阻遏蛋白 （无活性）
mRNAY
mRNAa
基 因 表 达
武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室 B、乳糖酶的诱导
2.末端产物阻遏
由某代谢途径末端产物的过 量累积引起的阻遏 酶合成阻遏的现象：
× E A→→ →→ →B
实验：
（1）大肠杆菌生长在无机盐和葡萄糖的培养基上时， 检测到细胞内有色氨酸合成酶的存在； （2）在上述培养基中加入色氨酸，检测发现细胞内 色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。 （3）表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成， 现了菌体生长的经济原则:不需要就不合成。
酶的生产方法
一、酶的生产方法 1、提取法
牛胃→凝乳酶 胰脏→胰酶 血液→凝血酶 木瓜→木瓜蛋白酶
采用各种技术，直接从动、植物细胞或组织中将 酶提取出来。提取法虽简单易行，但受原材料来源的 限制。 2、化学合成法 是20世纪60年代中期出现的新技术。 只能合成那些已知化学结构的酶；成本比较高。 目前仍然停留在实验室内合成的阶段。
大肠杆菌 谷氨酸脱羧酶、天冬氨酸酶、青霉素酰化酶、天冬酰胺 酶、β -半乳糖苷酶、限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、DNA连 接酶、核酸外切酶等。 枯草杆菌 α -淀粉酶、蛋白酶、 β -葡聚糖酶、5‘-核苷酸酶、碱 性磷酸酶。
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2、放线菌
链霉菌：葡萄糖异构酶、青霉素酰化酶、纤维素酶、碱 性蛋白酶、中性蛋白酶、几丁质酶等。
酶的合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进 入平衡期后，酶还可以延续合成较长一段时间。
黑曲霉聚半乳糖醛酸酶合成曲线 例如：
60
细胞 或酶浓 度
细胞
50.0
酶浓度 (单位 /ml)
细 胞浓度 酶浓度
25.0 20 12.5
b
时 间
0
0
40
时间 (h)
80
120
0.0
特点：可受诱导，一般不受分解代谢物阻 遏。所对应的mRNA相当稳定。
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1.同步合成型（又称生长偶联型）
酶的生物合成与细胞生长同步。
细胞
特点：
酶
细胞 或酶浓 度
1、酶的合成可以诱导，但不受 分解代谢物阻遏和末端产物阻遏。
a
2、mRNA很不稳定。
时 间
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2、中期合成型(生长偶联型中的特殊形式)
酶的合成在细胞生长一段时间后才开始，而在细胞 生长进入平衡期以后，酶的合成也随着停止。 特点：
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三、酶发酵生产的类型 1、液体深层发酵：
液体培养基，经灭菌、冷却后，接入产酶细胞，在一定条件 下发酵。
2、固体培养发酵
培养基以麸皮、米糠等为主要原料，经灭菌后，接入产酶菌 株，在一定条件下发酵。
3、固定化细胞发酵（70年代后期发展）
将细胞固定在载体上后，进行发酵生产。
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色氨酸操纵子——酶的阻遏
结构基因 调节基因 操纵基因 调节基因
操纵基因
结构基因
mRNA
阻遏蛋白 阻遏蛋白
酶蛋白
辅阻遏物
代谢产物与阻遏蛋白结 阻遏蛋白不能与操纵基因结合， 合，使之构象发生变化 与操纵基因结合，结构基 结构基因表达 因不能表达 武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
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二、应用微生物来开发酶的优点 1、微生物种类多，酶种丰富； 2、微生物生长繁殖快，易提取酶，特别是胞外酶； 3、微生物培养基来源广泛，价格便宜； 4、可采用微电脑等新技术，控制酶发酵生产过程； 5、可利用以基因工程为主的近代分子生物学技术选 育菌种，增加酶的产率和开发新酶种。
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（三）酶合成的调节机制
1. 酶合成的诱导
加进某种物质，使酶生物合成开始或加速进行。
已知分解利用乳糖的酶有： -半乳糖苷酶
酶合成诱导的现象：
实验： （1）大肠杆菌生长在葡萄糖 培养基上时，细胞内无上述 三种酶合成； （2）大肠杆菌生长在乳糖培 养基上时，细胞内有上述三 种酶合成； （3）表明菌体生物合成的经 济原则：需要时才合成。