仔猪心肌细胞分离及培养方法研究

仔猪心肌细胞分离及培养方法研究吴旭颖,郭亮(天津农学院动物科学系,天津 300384)摘要:为探讨仔猪心肌细胞的分离及培养方法,采用胶原酶 型和胰酶同时消化心肌组织,用10%胎牛血清终止消化,并用100目细胞筛过滤后,1200r/min离心沉淀细胞,再加入培养液重悬细胞。

采用差速贴壁法纯化心肌细胞后置CO2培养箱孵育。

结果显示,未贴壁时心肌细胞呈圆形,培养12~24h心肌细胞开始贴壁生长,细胞伸出伪足呈梭形、多角形,3~4d后形成细胞簇,5~7d后细胞汇合成片。

因此,同时使用胶原酶 型和胰酶消化仔猪心肌可简便、快速地获得高活力的心肌细胞。

关键词:心肌细胞;细胞培养;仔猪中图分类号:S816.79 文献标识码:A 文章编号:1671-7236(2010)03-0052-03心肌细胞分离培养是一种研究心脏和心肌细胞的有效方法,也是简化分析心肌细胞功能的有效方法之一。

心肌细胞培养还有助于研究心脏疾病的病理机制,在哺乳动物上,人们利用小鼠的心肌细胞为模型研究人类相关的心血管疾病(Zhang等,2006;牛建立等,1997),关于小鼠心肌细胞原代培养的方法已较为成熟。

然而在猪上的相关研究,尤其是出生后仔猪心肌细胞培养的相关报道还较少。

随着对猪心脏显微解剖、细胞与分子生物学特性的不断深入研究,猪逐渐被认为是潜在的器官提供者。

Rose 等(2000)研究结果证明,向猪心内皮细胞转入DAP、MCP及CD59补体调节蛋白基因能克服人体对异种器官与组织的超急性排斥反应。

因而,猪心逐渐成为矫治人类各种心脏疾病的适宜材料来源,因此需要尽快探索出一种细胞分离培养方法来获得仔猪心肌细胞,以便对猪心脏进行更深入的研究。

1 材料与方法1.1 试验动物 试验动物均选取刚出生7日龄的健康原种仔猪,大约克夏 长白猪原种子一代,品种为二元长白种猪,出生时平均体重为1.32kg,购自天津国家级宁河原种猪场。

1.2 主要试剂和仪器 无钙镁PBS购自美国Cam brex公司;0.25%胰蛋白酶、0.1%胶原酶 购自美国M ediatech公司;IM DM培养基、胎牛血清(FBS)购自美国H y clo ne公司;青霉素、链霉素购自收稿日期:2009-08-28作者简介:吴旭颖(1983-),女,天津人,硕士生,研究方向:动物疾病病原学与免疫学。

通信作者:郭亮(1964-),女,山东人,教授,主要从事生物细胞研究。

E-mail:liangguo177@ 哈药集团制药总厂; -巯基乙醇、台盼蓝购自美国Sigm a公司;0.9%生理盐水购自华北制药股份有限公司;培养液组成:IM DM、10%胎牛血清、0.1 m mol/L -巯基乙醇、100U/mL青霉素G及100 g/mL链霉素。

M CO-17AIC CO2培养箱(日本三洋株式会社);倒置相差显微镜日本(OLYMPUS);电子分析天平、恒温磁力搅拌器、电热恒温水箱(北京长安科学仪器厂);电热鼓风干燥箱(天津市中环是验电炉有限公司);普通光学显微镜、数码照相机、手提式压力蒸汽消毒器、超净净工作台、高速台式离心机、超低温冰箱、滤器、培养皿、微量加样枪、100目细胞筛、血球计数板等。

1.3 试验方法1.3.1 采集心脏 取出生7d的仔猪,从养殖场运回实验室,放血致死,用含双抗生理盐水冲洗仔猪3次,每次5min。

固定仔猪,然后用75%的酒精消毒胸腹部皮肤。

用灭菌的手术刀将仔猪胸部皮肤切开,立即用酒精棉球擦拭胸腹部肌肉消毒。

用灭菌剪刀沿最后一根肋骨向前剪开胸腔,暴露心脏,用无菌剪刀剪开心包膜,取下心脏,立即放入盛有50mL 预冷的无钙镁PBS的烧杯中,洗去血细胞和血凝块。

放入4 冰箱保存,12h内处理。

1.3.2 分离心肌细胞 从冰箱取出样品,用镊子将心脏转移到无菌的平皿中,加入适量预冷的无钙镁PBS冲洗,剔除血管、脂肪和结缔组织,再用无钙镁PBS漂洗2~3次。

用眼科剪刀将转移到平皿内的心脏剪成1~2m m3的碎块,将剪碎的心肌组织转移到20m L离心管中,加入无钙镁PBS溶液充分漂洗组织碎块2~3次以洗去血细胞,自然沉淀后弃掉洗涤液留下组织块以备消化。

向离心管内加入52生理生化中国畜牧兽医 2010年第37卷第3期0.1%胶原酶 ,置磁力搅拌器上37 水浴60~80 r/min,消化20min。

消化完毕后用滴管轻轻吹打离心管中组织碎块数次,再加入0.25%胰蛋白酶到离心管中,继续消化约15min。

在显微镜下观察可见细胞变圆、浮起,则立即加入胎牛血清终止消化,消化产物用100目铜网过滤后,以1200r/m in,离心10min,弃去上清液后,用培养液洗涤细胞1次,并重悬细胞,调整细胞接种密度为2 105个/mL,接种于25cm2细胞培养瓶中,37 、5%CO2培养箱中连续2次差速贴壁60m in,分离纯化心肌细胞,并用台盼蓝进行活性鉴定。

24h后换液,换液时充分冲洗细胞以洗去血细胞和未贴壁的细胞,以后每2~3d换液1次。

1.3.3 心肌细胞的形态学观察 用倒置相差显微镜观察培养细胞的形态。

1.3.4 心肌细胞活性检测 台盼蓝染色法检测细胞活性:接种前取部分心肌细胞悬液稀释后,吸取0.5mL细胞悬液,加入0.5m L0.4%台盼蓝溶液混匀,染色3m in后,吸取一滴于血球计数板上,置显微镜下观察心肌细胞成活情况。

死细胞能被台盼蓝染上色,镜下可见深蓝色的细胞;活细胞不被染色,镜下呈无色透明状。

2 结果2.1 心肌细胞形态学的观察 心肌细胞在开始分离时,由于受到生物酶及机械作用的破坏,使刚分离的心肌细胞存在不同程度的皱缩,未贴壁前细胞为圆形,悬浮于培养液中(图1);12~24h后开始贴壁生长,贴壁后逐渐呈扁平形、梭形。

也有的细胞在贴壁后形成三角形,顶部突出,之后细胞展开,伸出伪足,形成不规则星形;随着细胞的生长,3~4d后形成细胞簇(图2),一般5~7d可汇合成单层。

图1 刚开始分离的心肌细胞(100 )2.2 心肌细胞的活性 经台盼蓝染色法检测发现,约有83%的心肌细胞呈杆状,92%的心肌细胞台盼蓝染色呈阴性。

因此,本试验方法获得了高活性的心肌细胞。

图2 培养4d的心肌细胞(100 )3 讨论在心肌细胞培养中,经常遇到杂细胞干扰的问题。

由于动物心脏组织由18种细胞组成(许秀芳, 2000),其中近75%是非心肌细胞,如成纤维细胞、血细胞、血管内皮细胞等,而心肌细胞不易贴壁且只占整个心脏组织细胞的25%(M in等,2002)。

新鲜消化离心后的细胞悬液中有大量成纤维细胞存在,分泌较多胶原,贴壁增殖快,因此在数量上抑制了心肌细胞的分化(Simpso n等,1982),但利用此特点进行差速贴壁,能降低其对心肌细胞的影响(To shiyu-ki等,2000)。

故本试验采用差速贴壁60m in去除其干扰,培养24h后存活的心肌细胞即可贴壁生长,而破坏严重的心肌细胞难于贴壁而悬浮于培养液中并逐渐肿胀、破裂而死,此时换液后可进一步获得高存活率的心肌细胞(王亭忠,2005)。

3.1 关于细胞分离 分离心肌细胞常用的酶有胰蛋白酶、胶原酶(Ko no等,1968)。

胰酶主要用于分解组织间质的蛋白成分,作用很强,容易造成心肌组织消化过度而无法获得足够的心肌细胞,同时对细胞膜也有较强的破坏作用,因此对其要求比较严格。

胰酶消化同时还需根据消化时心肌组织的形态、色泽及消化液的浑浊程度来判断心肌细胞分离的情况,并不断地在显微镜下取消化液来观察其消化程度,以便及时用胎牛血清来终止消化。

而胶原酶主要通过作用间质中的胶原纤维,达到释放心肌细胞的作用,其作用缓和,胶原酶 型较适合心肌细胞的分离(Clark等,1998),它可以和胰蛋白酶同时使用(Suzuki等,1989)或分开使用(Yonem ochi等, 1998;Baltoli等,1997),但应用效果国内外文献报道并不相同,且尚无一致意见。

试验中同时运用这两种酶,0.1%的 型胶原酶37 消化20min,同时再加0.25%的胰酶消化15min,结果能够较好的分离心肌细胞(葛建军等,2005;王娜等,2007)。

而离心速度超过1500r/min,易造成细胞机械损伤;过53中国畜牧兽医 2010年第37卷第3期生理生化小则会引起细胞沉淀不完全,一般不低于800r/min 。

本试验采用1200r /min,离心10m in 。

3.2 关于细胞培养 在细胞培养中,培养液的缓冲作用很关键。

打开培养瓶时,CO 2逸出易引起pH 升高。

为了避免培养液中溶解的CO 2和碳酸盐完全丢失,目前多采用4-羟乙基哌嗪乙磺酸(H EPES),控制pH 在7.2~7.6范围内。

对于消化后培养的心肌细胞的接种密度,国内外报道不一(陈妍等,2006),范围多在1 105~5 105个/mL,接种的细胞数不能太多,也不能太少。

细胞数过多,易发生细胞生长营养不良;而细胞数过少,细胞之间又无法进行信息交流,心肌收缩不易同步。

本试验中首次接种的心肌细胞密度为2 105个/m L,以利于细胞的生长,以后的接种密度比较低些。

4 小结综上所述,本试验认为胶原酶和胰酶共同作用心肌组织,用10%胎牛血清及时终止消化反应,同时又采用连续2次差速贴壁60min 去除成纤维细胞的干扰,可获得数量多、纯度高和活力高的心肌细胞。

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