克罗诺氏菌检测-甘辛

当评价结果低于good identification时，需要重复试验。对于结果的判 定采用标准为非阴即阳，与阴性不同的都属于阳性。
第二法 阪崎肠杆菌的计数
1mL 100g 900mL
10mL
1mL
10g 90mL 1mL 1g 9mL
10mL
10mL
结果报告
第一法：综合菌落形态和生化特征，报告每100g（mL） 样品中检出或未检出克罗诺杆菌属。 第二发：综合菌落形态和生化特征，根据证实为克罗 诺杆菌属的阳性管数，查MPN检索表，报告每100g （mL）样品中克罗诺杆菌属的MPN值（见附录B中的 表B.1）。
1mL 100g 900mL 10mL
三、分离和鉴定
1、混匀mLST-Vm肉汤培养物，各取增菌液1环， 分别划线接种于两个DFI平板，36℃±1℃培养 24h±2h。 2、从DFI培养基上挑取1个~5个蓝绿色可疑菌落， 划线接种于TSA平板。25 ℃±1℃培养48h±4h。
mLst-Vm利用克罗诺杆菌属耐渗透压的能力通过0.5M的氯化钠在 保证克罗诺杆菌属良好生长的同时，抑制其他肠杆菌科细菌。克 罗诺杆菌属对万古霉素天然耐药，因此可以有效抑制G+菌的生长。
从TSA平板上挑取菌落接种生化鉴定培养基（国标采用生化培养 基），保证无杂菌生长后可以将菌落制备为0.5-0.62个麦氏浓度的 菌悬液后滴加，也可以直接穿刺接种，设臵阳性对照。
API 20E和VITEK 2 GN鉴定卡： 目前这两种生化条已在国内外得到广泛应用，在BAM 中也收录作为克罗诺杆菌属鉴定的方法。
阪崎克罗诺杆菌（C.sakazakii） 丙二酸盐克罗诺杆菌（C.malonaticus） 苏黎世克罗诺杆菌（C.turicensis） 莫金斯克罗诺杆菌（C.muytjensii） 克罗诺杆菌基因种1（C.genomospecies 1） 都柏林克罗诺杆菌（C.dublinensis） 都柏林亚种（C.dublinensis subsp.dublinensis） 洛桑亚种（ C.dublinensis subsp.lausannensis） 奶粉亚种（ C.dublinensis subsp.lactaridi）
四、快检方法
PCR法和荧光PCR法： 1、从液体增菌肉汤中提取DNA：目前美国USFDA BAM 2012年版方法和SN/T 1632.2-2013以及SN/T 1632.32013都是将增菌肉汤离心后直接提取DNA。该方法的 优点是可以快速提示克罗诺杆菌属阳性的样品，但 缺点因为PCR法无法区别死菌和活菌，因此可能出现 PCR结果阳性但无法分离出菌落的情况。
2002年国际食品微生物标准委员会（(International Commission of Microbiological Specializations on Food， ICMSF）将阪崎肠杆菌列为“严重危害特定人群生命、 引起长期慢性实质性后遗症的一种致病菌”。 2004年世界粮农组织和WHO经过风险性评估将阪崎肠 杆菌和沙门氏菌共同列为婴幼儿配方粉A类致病菌。
API 20E反应编码 3345 373 3305 173 3305 363 3305 373
API 20E结果评价 Excellent identification Excellent identification Very good identification Good identification
＋
－ ＋ ＋ ＋ － ＋ －
(＋)
(－ ) － v v － － (＋ )
＋
－ － ＋ － － ＋ －
注：＋ ：90-100％；(＋) ：75-89%； V ：25-74％；(－)：10 -24％；－ ：0-9％
分布及致病性
我国对婴幼儿食品中该菌的规定
乳品安全标准（报批稿） 婴儿配方食品 特殊医学用途配方食品 0-6个月龄
食品中克罗诺杆菌属（ Cronobacter, 原阪崎肠杆菌）检测
国家食品安全风险评估中心 甘 辛
命名演变
产黄色素阴沟肠杆菌
Yellow-pigmented E. cloacae
1980
阪崎肠杆菌 Enterobacter sakazakii
2007
克罗诺杆菌属 Cronobacter spp.
分类变化
2002年Dennison从1名64岁的外周血管病患者的伤口分离了克罗诺 杆菌 2002年Ongradi报道了1名26岁女性感染克罗诺杆菌
临床表现
新生儿： 脑膜炎、坏死性小肠结肠炎和菌血症 死亡率高达40%—80% 长期的并发症包括迟发型神经发育、脑积水和永久性 的神经损伤等 成年人： 脑卒中、骨髓炎、腹泻、急性胆囊炎、伤口感染以及 脓样伴随有导尿管留臵和尿路感染患者出现脓毒症、 结膜炎和吸入性肺炎
克罗诺杆菌属的易感人群
新生儿（低出生体重等免疫力低下） 早产儿 老年人 免疫功能低下的成年人
新生儿感染克罗诺杆菌病例
1961年Franklin首次报道了2例新生儿感染克罗诺杆菌导致脑膜炎并死亡 1965年丹麦报道了1例新生儿感染克罗诺杆菌引发脑膜炎 1979年Monroe报道了1例新生儿感染克罗诺杆菌引发菌血症 1981年美国印第安纳州1名婴儿感染克罗诺杆菌引发脑膜炎 1983年Muytjens报道了8例婴儿感染克罗诺杆菌引发脑膜炎，6例死亡 1984年Arseni报道了12例早产儿感染克罗诺杆菌引发菌血症,4例死亡 1985年Naqvi报道了1例婴儿感染克罗诺杆菌 1990年Clark报道了2起不相关的院内暴发的新生儿克罗诺氏菌感染事件 1994年法国爆发克罗诺杆菌感染，17例新生儿中8例无临床症状、7例坏死性结肠炎、1例脑膜炎、 1例败血症，共3例死亡 2001年4月美国田纳西州发生克罗诺氏菌感染事件 2001年比利时一家医院报道1例新生儿感染克罗诺杆菌引发坏死性小肠结肠炎 2002年耶路撒冷一家医院发生了1例克罗诺杆菌感染事件 2004年法国发生婴幼儿感染克罗诺杆菌，9例病例中2例死亡 2006年美国新生儿感染克罗诺杆菌的比率为8.7/100 000 2010年日本报道了1例克罗诺杆菌导致的新生儿死亡 WHO统计1961-2008年共有120例0-3岁感染克罗诺杆菌的病例，目前国内克罗诺杆菌临床感染病例罕 见报道，与我们监测覆盖不够全面有很大关系。
选择性增菌
一、样品取样
将袋装奶粉用75%酒精棉球涂抹消毒袋口，无菌操作开
封取样，如使用剪刀和勺子需要提前高压灭菌。称取 100g，加入提前预热至45℃的BPW 900mL，振荡或拍 打使奶粉充分溶解和混匀。
左图：未混合
右图：混合后
二、前增菌和选择性增菌
1、将混匀后的样品36℃±1℃培养18h±2h。 2、将培养后的样品充分混匀，取1mL至10mL mLST-Vm肉汤中，混匀，44℃±0.5℃培养 24h±2h。
DFI平板利用克罗诺杆菌属α-葡萄糖苷酶水解5-溴-4-氯-吲哚-α-D吡
喃葡萄苷（Xa-GLC），释放的糖苷配基5-溴-4-氯-吲哚在氧存在时
形成色素溴-氯-吲哚，从而使菌落呈现出特异性的蓝绿色。
TSA： 25℃培养后 典型菌落：黄色 阴性对照E. coli ATCC 25922：白色菌落
生化鉴定
Байду номын сангаас
国内外检测方法
1、GB 4789.40-2010 食品卫生微生物学检验 阪崎肠杆菌检验
2、SN/T 1632-2013 中华人民共和国进出口商品检验行业标准 出口奶粉 中阪崎肠杆菌（克罗诺杆菌属）检验方法 —SN/T 1632.1-2013 分离与计数 —SN/T 1632.1-2013 PCR方法 —SN/T 1632.1-2013 荧光PCR方法 3、ISO/TS 22964 Milk and milk products—Detection of Enterobacter sakazakii 2006 4、USFDA Bacteriological Analytical Manual, Chapter 29:Cronobacter
克罗诺杆菌在乳粉中的分布
1988年，Muytjens检测了35个国家的141种婴儿配方粉，其中13个国家的 20种抽检样品中分离到克罗诺杆菌，占全部样品的14.2%。 2001年4月美国田纳西州发生克罗诺氏菌感染来自于婴幼儿配方粉。 2004年Iversen等调查了82个婴幼儿配方乳粉和404个其他的食品中存在 克罗诺氏菌、沙门氏菌和其他肠杆菌的情况，结果发现在婴幼儿配方乳 粉、干婴儿食品、奶粉、干酪和其他产品中，克罗诺杆菌检出率分别为 2.4%、10.2%、4.1%、和3.2% 2002年香港食物环境卫生署从德国美乐宝HN25奶油粉检出克罗诺杆菌 2002年美国FDA从费蒙特工厂生产的婴幼儿配方粉中检出克罗诺杆菌
阪崎克罗诺杆菌（C.sakazakii） 丙二酸盐克罗诺杆菌（C.malonaticus） 苏黎世克罗诺杆菌（C.turicensis） 莫金斯克罗诺杆菌（C.muytjensii）
尤尼沃斯克罗诺杆菌（C. universalis）
都柏林克罗诺杆菌（C.dublinensis） 都柏林亚种（C.dublinensis subsp.dublinensis） 洛桑亚种（ C.dublinensis subsp.lausannensis）
克罗诺杆 菌属 －
阴沟 肠杆菌 －
产气 肠杆菌 ＋
成团 肠杆菌 －
日勾维 肠杆菌 ＋
精氨酸双水解酶
鸟氨酸脱羧酶 KCN生长 发酵:
＋
＋ ＋
＋
＋ ＋
－
＋ ＋
－
－ v
－
＋ ＋
蔗糖
卫矛醇 核糖醇 棉子糖 D-山梨醇 χ-甲基-葡萄糖甙 D-阿拉伯糖醇 黄色素
＋
－ － ＋ － ＋ － ＋
＋
(－ ) (－ ) ＋ ＋ (＋ ) (－ ) －
USFDA Bacteriological Analytical Manual, Chapter 29:Cronobacter
ISO/TS 22964 Milk and milk products—Detection of Enterobacter sakazakii 2006
SN/T 1632.1-2013 分离与计数
奶粉亚种（ C.dublinensis subsp.lactaridi）
康帝蒙提克罗诺杆菌(C.condimenti)
2008年
2011年
克罗诺杆菌属简介
兼性厌氧的革兰氏阴性杆菌 周生鞭毛、能运动 无芽孢 隶属于肠杆菌科
克罗诺杆菌属及亲缘关系较近的肠杆菌生化反应比较
生化反应
试验
赖氨酸脱羧酶
我国克罗诺杆菌污染情况
2004年，安徽阜阳发生劣质奶粉引发 “大头娃娃”事件，从87份阜阳劣质奶 粉样品中检测到11例克罗诺杆菌阳性产 品，污染率为12.6%。 2010-2011年各地疾控中心的食源性致病 菌监测报告中克罗诺杆菌属的检出情 况为，广西梧州市监测的175份食品中 检出率为5.26%，江苏宿迁市的891份样 品中检出率为2.6%，甘肃定西市对321 份市售食品监测中检出率为0.31%，湖 南长沙市监测的286份食品中检出率为 6.3%。 2013年董晓晖等对300份奶粉和50份非 奶粉食品中克罗诺杆菌属进行定量检 测，检出率达到6.6%，23个污染样品中 有4个样品的菌量大于100 MPN/100g。
成年人感染克罗诺杆菌病例
1982年Gimenez报道1名76岁老人感染克罗诺杆菌引起尿脓血症
1985年Pribyl从1名糖尿病患者足部溃疡部分分离出克罗诺杆菌 1991年Hawkins报道了1例克罗诺杆菌引起的成人菌血症
2001年Lai报道了马萨诸塞州立大学医学中心1995年~1996年4例成人 感染克罗诺杆菌，其中3名死亡
GB4789.40-2010
第一法：阪崎肠杆菌的检验 第二法：阪崎肠杆菌的计数
第一法 阪崎肠杆菌的检验
检验程序
检样 100 g/mL+稀释液 900 mL 36℃±1℃，18 h±2h
1mL + mLST-Vm 10mL 44℃±0.5℃，24 h±2h
DFI琼脂 36℃±1℃，24 h±2h 挑取蓝绿色菌落 TSA 25℃±1℃，48 h±4h 挑取黄色菌落 生化鉴定 报 告 生 化 鉴 定 选择性分离 前 增 菌