串联质谱

串联质谱技术在新生儿疾病筛查中的应用

遗传性代谢病( inborn error of metabolism，IEM)是一类涉及氨基酸、有机酸、脂肪酸、尿素循环、碳水化合物、类固醇等多种物质代谢的疾病。其种类繁多，是儿科临床的疑难杂症。虽然其单一病种患病率较低，但总体发病率较高，对人口素质、家庭乃至社会的发展构成了极大的威胁。其诊断主要依赖实验室的特异性检查。我国每年出生约2200万新生儿，仅高苯丙氨酸血症（包括苯丙酮尿症）这类疾病，每年就新增患儿1600~1800例。LC-MS/MS 技术的发展使得这类疾病在发病前进行干预成为可能。即在新生儿出生后体内某些代谢产物出现异常,而尚未出现临床症状或者症状不明显时就早期明确诊断，并进行及时而有效的对症治疗，以避免患儿的重要脏器出现不可逆性损害，进而保障儿童正常的体格发育和智能发育。这就是新生儿疾病筛查（neonatal screening）。国际新生儿疾病筛查发展趋势逐步提高到以串联质谱（MS/MS）技术为中心的筛查，如欧美等国目前已经广泛采用LC-MS/MS法对新生儿遗传疾病筛查。串联质谱即两个质谱仪串联后一次进行二级质谱检测,利用超敏性、高特异性、高选择性和快速检验的串联质谱技术，能在2~3 min内对1个标本进行几十种代谢产物分析，通过对这些产物的分析,可以对40种左右遗传性代谢病(包括氨基酸代谢紊乱、有机酸代谢紊乱和脂肪酸代谢紊乱性疾病)进行筛查和诊断。2004年12月美国食品药品管理局（FDA）专门制订了“用串联质谱法分析新生儿氨基酸,游离肉毒碱和酰基肉碱筛选检测系统”的指导性文件。串联质谱技术不仅实现了“一项实验检测一种疾病”向“一项实验检测多种疾病”的转变，提高了检测的效率,同时使筛查过程中常见的假阳性或者假阴性的发生率显著降低,使新生儿疾病筛查在内容和质量上都提高到一个新的水平。串联质谱在临床遗传性代谢病高危患儿选择性筛查方面也发挥着重要作用，上海第二医科大学附属新华医院新生儿筛查中心检测了1000多例全国各地送检的遗传性代谢病高危标本，发现阳性标本达9% ~10%，在22700例新生儿中筛查出阳性病例6例。因此，串联质谱技术是目前开展新生儿筛查和临床遗传性代谢病高危患儿筛查诊断较好的方法和发展方向。目前，LC-MS/MS技术检测相对发生率比较高的一些新生儿代谢疾病如下：中链脂肪酸脱氢酶缺乏症、短链脂肪酸脱氢酶缺乏症、长链脂肪酸代谢异常、卡尼丁（肉碱）吸收障碍、卡尼丁结合酶缺乏、卡尼丁穿透障碍、丙酸血症、甲基丙二酸血症、异戊酸血症、戊二酸血症、3-hydroxy-3-methylglutaric aciduria、中链槭糖尿症(MCAD)、短链槭糖尿症(SCAD)、长链槭糖尿症(LCAD)、超长链槭糖尿症(VLCAD)、瓜氨酸血症、酪氨酸代谢紊乱、高胱氨酸尿、高苯丙氨酸血症、精氨酸酶缺乏症、精氨琥铂酸尿症、高甲硫氨酸血症、苯丙酮尿症、Argininosuccinic acidemia、非酮性高甘胺酸血症、Glutaric Acidemia、3-Hydroxy-3-methylglutaryl-CoA-lyase Deficiency、ß-Ketothiolase Deficiency、Multiple Carboxylase Deficiency等。检测方法与原理：方法一，衍生化法：通过把样品进行“一步法”衍生，可以减少干扰，提高灵敏度。取1~2个滤纸血点(直径3 mm的干血滤纸片，相当于3.2 µL全血)，置于96孔过滤板中，每孔加入含氨基酸和酰基肉碱同位素内标的无水甲醇100 µL，室温放置20 min，以提取血片中的氨基酸和酰基肉碱，然后离心至另一个96孔板中，氮气保护下50℃吹干，加入60 µL正丁醇（（含3 mol/L HCl），密封，65℃孵育15 min进行衍生化。氨基酸衍生反应：

R = H , 氨基乙酸R = (CH2)2CO2H , 谷氨酸R = CH3 , 丙胺酸R = (CH2)2SCH3 , 蛋氨酸R = CH(CH3)2 , 缬氨酸R = CH2C6H5 , 苯基丙氨酸R = CH2CH(CH3)2 , 亮氨酸R = CH2C6H5OH , 酪氨酸R = CH2OH , 丝氨酸R = (CH2)3NH2 , 鸟氨酸R = CHOHCH3 ,苏氨酸R = (CH2)4NH2, 赖氨酸R = (CH2)3NHCONH2 , 瓜氨酸R=OH, 肉碱R=OCO(CH2)6CH3,辛基肉碱(MCAD), (MADD)R=OCOCH2CH3, 丙基肉碱(CMA) R=OCO(CH2)12CH3,十四烷基肉碱(LCAD), (LCHAD)R=OCO(CH2)2CH3,丁基肉碱(SCAD) R=OCO(CH2)16CH3,十八烷基肉碱R=OCO(CH2)4CH3,己基肉碱(MACD)衍生后的溶液，在氮气保护下50℃吹干。用100 µL 流动相(一般为80％乙睛＋20％水＋0.02%甲酸)再溶解残渣，取20 µL进样，进行FIA-MS/MS分析。方法二，非衍生化法。取1~2个滤纸血点(直径3 mm的干血滤纸片，相当于3.2 µL全血)，置于96孔板中，每孔加入含氨基酸和酰基肉碱同位素内标的无水甲醇100 µL，室温放置30 min，提取血片中的氨基酸和酰基肉碱，然后转移上清液至另一个96孔板中，取20 µL进样，进行FIA-MS/MS分析。新生儿疾病筛查的MS/MS分析，主要同步执行3个扫描模式：母离子扫描(PS)、中性丢失扫描(NL)和多反应检测扫描(MRM)。在母离子扫描中，第二级质谱选择特征的碎片离子，扫描检测第一级质谱中能产生该碎片的所有母离子，主要用于酰基肉碱的分析检测，经CAD后可产生相同的碎片离子(m/z 85)；在中性丢失扫描中，两级质谱分析监测那些产生相同中性碎片的母离子，主要用于氨基酸的分析检测，大多数氨基酸可以产生102u的中性碎片，也有少数例外(甘氨酸56u、精氨酸161u、鸟氨酸119u等)。因此，氨基酸分析一般采用中性丢失扫描，而在酰基肉碱的分析中，多采用母离子扫描。新生儿疾病筛查串联质谱分析所需的试剂：标准试剂。Set A：稳定同位素标记氨基酸对照品混合物，冻干粉，1管，12种/管；Set B：稳定同位素标记乙酰肉碱对照品混合物，冻干粉，1管，8种/管。标准溶液的配制、稀释和保存：浓缩储备液—用1 mL溶剂充分溶解，混匀，即为浓缩储备液；浓缩工作液—将1 mL浓缩储备液（Set A与Set B）混匀，密封保存在4℃。为保证溶液的活性，建议分装，1个月后丢弃。日常工作液—取浓缩工作液，稀释100倍，密封保存在4℃。为保证溶液的

9.1 最适新生儿疾病筛查平台

9.1.1 API 2000™、API 3000™、API 3200™系列任一台或多台质谱仪。

9.1.2 ChemoView™新生儿疾病筛查软件

符合GLP和其他相关的标准；

●可控制不同厂商的LC泵和自动进样；

●支持实时处理数据；

●可用于其他疾病标记物的筛查；

●从MRM、母离子扫描、中性丢失扫描数据自动生成浓度、离子强度或浓度比的定制报告