模块5 常见植物组培的关键技术

模块5 常见植物组培的关键技术

一、知识目标

掌握外植体培养要素

能利用植物组织培养的基础知识分析植物组织培养过程中常见的异常现象

掌握XXX的组培方法的特点

二、技能目标

能够根据不同植物特点选择合适的外植体进行启动培养

熟练修整和处理外植体

能够分析和解决组培过程中出现的污染、褐变、玻璃化等异常现象

能够针对不同各类的植物科学设计培养方案并进行有效的组培工作

三、态度目标

牢牢树立自主创新意识，为我国植物组培以生产基地向研发基地转变贡献力量

学会尊重别人和尊重自己

单元Ⅰ植物组培过程中的常见问题及解决措施

一、污染的原因及其预防措施

（一）污染的原因

污染是指在组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌，导致培养失败的现象。污染的原因，从病原菌方面来分析主要有细菌及真菌两大类；污染的途径，主要是外植体带菌、培养基及器皿灭菌不彻底、操作人员未遵守操作规程等。造成污染的病原主要分为细菌和真菌两大类.

真菌性污染主要指霉菌引起的污染，一般接种后3~8d可发现。真菌性污染，一般多由接种室内的空气不清洁，超净工作台的过滤效果不理想，操作不慎等原因引起。此类污染可通过完善操作，控制培养环境,严格操作程序来克服。

细菌性污染的主要症状是培养材料附近出现黏液状和发酵泡沫状物体，或在材料附近的培养基中出现混浊和云雾状痕迹。一般在接种后1～2d即可发现.细菌性污染除外植体带菌或培养基灭菌不彻底外，主要是操作人员的不慎造成。要求操作人员严格按照无菌操作程序操作。

（二）污染的预防措施

1．防止材料带菌的措施

外植体带菌引起的污染与外植体的种类，取材季节，部位，预处理方法及消毒方法等密切相关。因此，取材以春夏生长旺季，当年生的嫩梢为佳，应尽量选择晴天中午进行，或取离体枝梢在洁净空气条件下抽芽，然后从新生组织中取材接种。

2. 外植体的灭菌

外植体的彻底消毒是控制污染的前提，应根据不同材料选择合适的消毒剂和消毒方法，有些特殊材料还需进行预处理，以达到最佳消毒效果。对于材料内部带菌的组织，有时还需在培养基中加入适量抗生素。

多次灭菌法；多种药液交替浸泡法。

3. 器皿与金属器械的灭菌

二、外植体的褐变及其防止措施

褐变是指外植体在培养过程中，体内的多酚氧化酶被激活，使细胞里的酚类物质氧化成棕褐色的醌类物质，这种致死性的褐化物不但向外扩散致使培养基逐渐变成褐色，而且还会抑制其他酶的活性，严重影响外植体的脱分化和器官分化，最后变褐而死亡的现象。

（一）褐变的原因

①植物品种

研究表明，在不同品种间的褐变现象是不同的。由于多酚氧化酶活性上的差异，因此，有些花卉品种的外植体在接种后较容易褐变，而有些花卉品种的外植体在接种后不容易褐变。因此，在培养过程中应该有所选择，对不同的品种分别进行处理。

②生理状态

由于外植体的生理状态不同，所以在接种后褐变程度也有所不同。一般来说，处于幼龄期的植物材料褐变程度较浅，而从已经成年的植株采收的外植体，由于含醌类物质较多，因此褐变较为严重。一般来说，幼嫩的组织在接种后褐变程度并不明显，而老熟的组织在接种后褐变程度较为严重。

③培养基成分

浓度过高的无机盐会使某些观赏植物的褐变程度增加，此外，细胞分裂素的水平过高也会刺激某些外植体的多酚氧化酶的活性，从而使褐变现象加深。

④培养条件不当

如果光照过强、温度过高、培养时间过长等，均可使多酚氧化酶的活性提高，从而加速被培养的外植体的褐变程度。

（二）褐变的防止措施

为了提高组织培养的成苗率，必须对外植体的褐变现象加以控制。可以采用以下措施防止、减轻褐变现象的发生。

1.选择合适的外植体：一般来说，最好选择生长处于旺盛的外植体，这样可以使褐变现象明显减轻。

2.合适的培养条件：无机盐成分、植物生长物质水平、适宜温度、及时继代培养均可以减轻材料的褐变现象。

3.使用抗氧化剂：在培养基中，使用半胱氨酸、抗坏血酸等抗氧化剂能够较为有效地避免或减轻很多外植体的褐变现象。

4.连续转移：对容易褐变的材料可间隔12-24h的培养后，再转移到新的培养基上，这样经过连续处理7-l0d后，褐变现象便会得到控制或大为减轻。

5.加活性炭：0.1%~0.5%的活性炭对吸附酚类氧化物的效果很明显。在许多热带树木的组织培养中均曾观察到活性炭防止外植体褐变的明显效果。

三、培养物的玻璃化现象及其预防措施

（一）玻璃化现象及其产生原因

实践表明，当植物材料不断地进行离体繁殖时，有些培养物的嫩茎、叶片往往会呈水晶透明或半透明状，这种现象通常称为玻璃化。它的出现会使试管苗生长缓慢、繁殖系数有所下降。玻璃化为试管苗的生理失调症。

玻璃化的起因是细胞生长过程中的环境变化。试管苗为了适应变化了的环境而呈玻璃状。产生玻璃化苗的因素主要有激素浓度、琼脂用量、温度、离子水平、光照时间、通风条件等。

1.激素浓度

激素浓度增加尤其是细胞分裂素浓度提高（或细胞分裂素与生长素比例提高），易导致玻璃花苗的产生。产生玻璃化苗的细胞分裂素浓度因植物种类的不同而异。细胞分裂素的主要作用是促进芽的分化，打破顶端优势，促进腋芽发生，因而玻璃化苗也表现为茎节较短、分枝较多的特点。使细胞分裂素增多的原因有以下几种：一是培养基中一次性加入了过多的细胞分裂素；二是细胞分裂素与生长素比例失调，细胞分裂素含量远远高于生长素，而使植物过多吸收细胞分裂素，体内激素比例严重失调，试管苗无法正常生长而导致玻璃化；三是在多次继代培养时愈伤组织和试管苗体内积累过量的细胞分裂素。在初代培养相同的培养基，最初的几代玻璃化现象很少，多次继代培养后，便开始出现玻璃化现象，通常是继代次数越多玻璃化苗的比例越大。

2.琼脂浓度

培养基中琼脂浓度低时玻璃化苗比例增加，水浸状严重，苗向上长。随着琼脂浓度的增加，玻璃化苗比例减少，但由于硬化的培养基影响了养分的吸收，试管苗生长减慢，分枝也减少。因此琼脂的浓度一定要适当。

3.温度

适宜的温度可以使试管苗生长良好，当温度低时，容易形成玻璃化苗，温度越低，玻璃化苗比例越高。温度高时玻璃化苗减少，且发生的时间较晚。

4.光照时间

不同的植物对光照的要求不同，满足植物的光照时间，试管苗才能生长正常。大多数植物在每天10~12h光照下都能生长良好，光照时数大于每天15h时，玻璃化苗的比例明显增加。

5.通风条件

试管苗生长期间，要求有足够的气体交换，气体交换的好坏取决于生长量、瓶内空

间、培养时间和瓶盖种类。在一定容量的培养瓶中，愈伤组织和试管苗生长越快，越容易形成玻璃化苗。如果培养瓶容量小，气体交换不良，易发生玻璃化。愈伤组织和试管苗长时间培养，不能及时转移，容易出现玻璃化苗。组织培养所用瓶盖有棉塞、锡箔纸、滤纸、封口纸、牛皮纸、塑料膜等，其中棉塞、滤纸、封口纸、牛皮纸通气性较好，玻璃化苗的比例较低；而锡箔纸不透气，影响气体交换，玻璃化苗增加。用塑料膜封口时，玻璃化苗剧增。

6.离子水平

植物生长需要一定的矿物质营养，但是，如果无机离子之间失去平衡，试管苗生长就会受到影响。植物种类不同，对矿物质的量、离子形态、离子间的比例要求不同。如果培养基中离子种类及其比例不适宜该种植物，玻璃化苗的比例就会增加。

（二）预防措施

1.适当控制培养基中无机营养成分

大多数植物在MS培养基上生长良好，玻璃化苗的比例较低，主要是由于MS培养基的硝态氮、钙、锌、锰的含量较高的缘故。适当增加培养基中钙、锌、锰、钾、铁、铜、镁的含量，降低氮和氯元素比例，特别是降低铵态氮浓度，提高硝态氮浓度，可减少玻璃化苗的比例。

2.适当提高培养基中蔗糖和琼脂的浓度

适当提高培养基中蔗糖的含量，可降低培养基中的渗透势，减少外植体从培养基中获得过多的水分。而适当提高培养基中琼脂的含量，可降低培养基的衬质势，使细胞吸水减少，也可降低玻璃化；如将琼脂浓度提高到1.1%时，洋蓟的玻璃化苗完全消失。

3.适当降低细胞分裂素和赤霉素的浓度

细胞分裂素和赤霉素可以促进芽的分化，但是为了防止玻璃化现象，应适当减少其用量，或增加生长素的比例。在继代培养时，要逐步减少细胞分裂素的含量。

4.增加自然光照，控制光照时间

在试验中发现，玻璃苗放在自然光下几天后茎、叶变红，玻璃化逐渐消失。这是因为自然光中的紫外线能促进试管苗成熟，加快木质化。光照时间不宜太长，大多数植物以每天8~12h为宜；光照度在1000~1800lxl之间，就此可以满足植物生长的要求。

5.控制好温度

培养温度要适宜植物的正常生长发育。如果培养室的温度过低，应采取增温措施。热击处理，可防止玻璃化的发生。如用40℃热击处理瑞香愈伤组织培养物可完全消除其再生苗的玻璃化，同时还能提高愈伤组织芽的分化频率。

6.改善培养器皿的气体交换状况

如使用棉塞、滤纸片或通气好的封口膜封口。

7.在培养基中添加其他物质

在培养基中加入间苯三酚或根皮苷或其他添加物，可有效地减轻或防治试管苗玻璃

化，如添加马铃薯可降低油菜玻璃苗的产生频率，在培养基中加入3%的活性炭可降低玻璃苗的产生频率，对防治产生玻璃化有良好作用。