实验十、模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定

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t-DNA插入突变体检测

2.2.3.6.点样完成后，加上110v电压，跑胶大约30-40分钟，直到DNA大概跑到凝胶的三分之二处；
2.2.3.7.取出凝胶，放入EB（溴乙锭，强突变剂，剧毒慎碰）染液中染色10-15分钟；
2.2.3.8.之后放入凝胶成像仪中，观察DNA跑胶的情况。
3.结果
3.1.第一次
TPS法提取44号样品DNA，以DL2000为Marker。
DNA含有PO43-基团，在pH8.0 Buffer（本实验中为TAE）中带负电, 在电场中向正极移动。自由电泳时，由于不同大小的DNA片段的电荷密度大致相同，各核酸分子难以分开；选用适当浓度的琼脂糖凝胶作为支持物，使之具备一定的孔径，即可发挥分子筛效应，使大小不同的核酸片段迁移率出现较大差异，达到分离的目的；同样条件对Marker电泳；起到鉴定的作用。不同浓度的琼脂糖凝胶对应线状DNA分子分离范围不同。（如下图）
本次实验中，采用液CTAB（或者TSP法）提取拟南芥植株的DNA，然后PCR将所获DNA扩增，在之后采用琼脂糖凝胶电泳技术，分离处长度不一的DNA带，以确东样品是否为T-DNA插入突变纯和体。
PCR（Polymerase Chain Reaction），即聚合酶链式反应是体外核算扩增技术，具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断。（PCR基本原理如右图）
4.2.实验分析
4.2.1.加液氮碾磨叶片时，最好保持离心管中始终有液体氮存在，如果碾磨一段时间后中途要加液氮继续碾磨，一定注意，液氮沸腾时极易将已经碾磨好的叶片吹走；另一点，碾磨时要迅速，避免空气中的水汽在离心管上凝结。
4.2.2.DNA有一定的物理脆性，所以在提取过程中混匀时一定要缓慢的摇晃，切忌剧烈震荡。

T-DNA插入鉴定实验报告

T-DNA插入突变体的鉴定时明辉同组者：薛敏学号：201000220069摘要 Ti质粒是上有一段特殊的DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移进植物细胞，并插入植物染色体DNA中。

所以Ti质粒上的这一段能转移的DNA被叫做T-DNA。

将感兴趣的基因改造插入到T-DNA区段中，通过农杆菌侵染植物细胞，实现外源基因对植物的遗传转化，得到含有突变的植株。

通过本实验，我们将学习如何用PCR的方法检测所得植株是否为T-DNA的插入突变体。

1.引言T-DNA作为一种实验常用的遗传转化方法，在插入突变过程中，插入到植物染色体上的位置是随机的。

如果T-DNA插入进某个功能基因的内部，特别是插入到外显子区，将造成基因功能的丧失。

所以利用农杆菌Ti质粒转化植物细胞，是获得植物突变体的一种重要方法。

农杆菌Ti质粒转化植物细胞后，在获得的后代分离群体中，有T-DNA 插入的纯合突变体，杂合突变体，和野生型。

在突变体研究中，需要的材料是纯合突变体，所以必须从分离群体中将纯合突变体鉴定出来。

本次实验中，采用液CTAB（或者TSP法）提取拟南芥植株的DNA，然后PCR将所获DNA扩增，在之后采用琼脂糖凝胶电泳技术，分离处长度不一的DNA带，以确定样品是否为T-DNA插入突变纯和体。

PCR（Polymerase ChainReaction），即聚合酶链式反应是体外核算扩增技术，具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断。

（PCR基本原理如右图）DNA含有PO43-基团，在pH8.0 Buffer（本实验中为TAE）中带负电, 在电场中向正极移动。

自由电泳时，由于不同大小的DNA片段的电荷密度大致相同，各核酸分子难以分开；选用适当浓度的琼脂糖凝胶作为支持物，使之具备一定的孔径，即可发挥分子筛效应，使大小不同的核酸片段迁移率出现较大差异，达到分离的目的；同样条件对Marker电泳；起到鉴定的作用。

拟南芥TDNA插入突变体的鉴定

遗传学实验报告拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定一、实验目的：1、学习和掌握基本的植物DNA的CTAB提取法，掌握PCR、琼脂糖凝胶电泳等基本实验操作技能2、了解T-DNA插入突变体的鉴定原理，掌握其方法。

二、实验原理1、拟南芥（Arabidopsis thaliana）十字花科，植物遗传学、发育生物学和分子生物学的模式植物。

植株形态个体小，高度只有30cm左右；生长周期快，从播种到收获种子一般只需8周左右；种子多，每株可产生数千粒种子；形态特征简单，生命力强，用普通培养基就可作人工培养；遗传转化简单，转化效率高；基因组小，只有5对染色体，125MB；在2000年，拟南芥成为第一个基因组被完整测序的植物。

2、突变体突变体是遗传学研究的最重要材料。

突变体可以通过自然突变和人工诱变的方法获得。

拟南芥诱变常用方法有EMS诱变、T-DNA插入突变、激活标签。

由于T-DNA插入突变体便于对突变基因进行追踪，目前拟南芥、水稻中已经有大量的T-DNA插入突变体；SALK中心提供的拟南芥T-DNA插入突变体超过十万种。

3、T-DNA插入突变原理T-DNA，转移DNA（transferred DNA ），是根瘤农杆菌Ti质粒中的一段DNA序列，可以从农杆菌中转移并稳定整合到植物基因组。

人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，获得转基因植株。

除用于转基因以外，T-DNA插入到植物的基因中可引起基因的失活，从而产生基因敲除突变体，T-DNA大多为单拷贝插入，使其利于进行遗传分析。

4、T-DNA插入突变体PCR鉴定图 1 结果鉴定图 2 PCR引物设计三、实验材料1、材料：T-DNA插入的突变拟南芥植株；2、仪器：离心管，离心机，水浴锅，移液枪，PCR仪，电泳槽等；3、试剂：液氮，CTAB提取液，氯仿/异戊醇（24：1），无水乙醇，70%乙醇，10xTaq buffer，MgCl2，引物，琼脂糖，溴化乙锭（EB）。

拟南芥atcwinv1基因T-DNA插入纯合突变体PCR鉴定及表型观察

拟南芥atcwinv1基因T-DNA插入纯合突变体PCR鉴定及表型观察阮燕晔;张莹;王波【摘要】以拟南芥atcwinvl 基因T-DNA插入纯合突变体和野生型植株为材料,比较研究了2种基因型植株在营养期和生殖期的形态差异.结果表明:拟南芥atcwinvl 基因T-DNA插入纯合突变体(简称突变体)较野生型萌发率平均下降5.88个百分点;突变体在44 d抽薹,较野生型延后4d;分支数平均4支,较野生型下降20.84%;果荚开裂时间6d左右,较野生型延长2d;单株果荚数平均62.27个,较野生型降低11.00%;单株果荚种粒数平均45.87粒,较野生型降低21.46%;突变体的单果荚长度平均14.52 cm,较野生型降低10.24%;单株果质量平均50.83mg,较野生型降低23.70%.拟南芥突变体在营养生长时期的株高平均10.44 cm,较野生型下降21.03%;主根长平均7.62 cm,较野生型下降14.96%;单株莲座叶面积平均3.16 cm2,较野生型下降13.90%;单株地上部分鲜质量平均81.81mg,较野生型下降11.11%;单株根鲜质量平均6.21mg,较野生型下降17.64%;单株地上部分干质量平均6.17 mg,较野生型下降15.60%;单株根干质量平均0.55mg,较野生型下降6.78%.拟南芥突变体在生殖生长时期的株高平均18.78 cm,较野生型增加4.22%;主根长平均16.48 cm,较野生型下降5.88%;单株莲座叶面积平均6.80 cm2,较野生型下降6.21%;单株地上部分鲜质量平均129.85 mg,较野生型下降9.69%;单株根鲜质量平均9.97 mg,较野生型下降13.23%;单株地上部分干质量平均9.22 mg,较野生型下降4.16%;单株根干质量平均0.70mg,较野生型下降6.67%.以上研究结果表明,atcwinvl 基因T-DNA插入突变影响了拟南芥植株正常的生长发育.%In the research, homozygous mutant (atcwinvl) and wild type of Arabidopsis were used to compare plant morphological differences in the period ofvegetative growth and reproductive growth. The results showed that compared to the wild type the germination rate of atcwinvl averagely decreased by 5.88 percentage points; compared to the wild type, bolting time of atcwinvl was 44 d, delayed 4 days;branch number of atcwinvl was 4, decreased by 20. 84 ％ ;cracking time of the pod of atcwinvl was 6,delayed 2 days;fruit pod number per plant of atcwinvl was 62.27,decreased by11.00％ ,fruit number of a pod of atcwinvl was 45.87,decreased by21.46％;length of a fruit pod of atcwinvl was 14.52cm,decreased by 10. 24％fruit weight of a plant of atcwinvl was 50. 83mg,decreased by 23.70％. In the period of vegetative growth,compared to the wild type, plant height of atcwinvl was 10.44cm, decreased by 21. 03％; root length of atcwinvl was 7.62cm, average decreased by 14. 96％; area of rosette leaf of atcwinvl was 3. 16 cm2 ,decreased by 13.90％ ;aboveground fresh weight of per plant was 81.81 mg, decreased by 11.11％ ;fresh weight of root per plant was6.21mg, decreased by 17.64％ ;aboveground dry weight of per plant was 6.17 mg, decreased by 15.60 ％ ;dry weight of root per plant was 0. 55mg,decreased by 6. 78 ％ ;In the period of reproductive growth, compared to the wild type, plant height of atcwinvl was 18. 78cm,increased by4.22％ ;root length of atcwinvl was 16.48cm,averagely decreased by5.88％; area of rosette leaf of atcwinvl was6.80 cm2, decreased by 6.21％; fresh weight of a plant of atcwinvl was 129.85 mg,decreased by 9.69％ ;fresh weight of root per plant was 9. 97 mg,decreased by 13.23％ ;aboveground dry weight of per plant was 9.22 mg, decreased by 4. 16％ ;dry weight of root per plant was 0. 70mg,decreased by 6.67％. The results obtainedshowed that growth of Arabidopsis was influenced by T-DNA insertional mutagenesis of atcwinvl gene.【期刊名称】《河南农业科学》【年(卷),期】2011(040)005【总页数】5页(P62-66)【关键词】拟南芥;atcwinvl基因;T-DNA插入突变;基因功能【作者】阮燕晔;张莹;王波【作者单位】沈阳农业大学,生物科学技术学院,辽宁沈阳110866;沈阳农业大学,生物科学技术学院,辽宁沈阳110866;沈阳农业大学,生物科学技术学院,辽宁沈阳110866【正文语种】中文【中图分类】Q789蔗糖是高等植物体内光合产物运输与分配的主要形式,其在植株中定向运输和分配的方式不仅调控植株的整个生长和发育进程,也决定作物的产量和品质。

拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定

拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定09生工吴超 200900140129一、实验原理T-DNA插入法是反向遗传学研究的重要手段。

T-DNA是农杆菌的一个大质粒，长度在25kb左右。

野生型农杆菌的T-DNA上带有激素合成基因，感染植物后会导致植物细胞快速增殖形成愈伤组织，失去分化能力。

所以一般实验使用改造后的农杆菌——T-DNA中导入了卡那霉素抗性基因和抗除草剂基因。

因此在农杆菌感染植物后可用除草剂来筛选转化子。

在转化子培养到F2代出现分离后，就需要对其基因型进行鉴定。

T-DNA插入突变体鉴定方法主要有两种：三引物法和双引物法。

在本实验中使用三引物法。

三引物法的原理如图1所示，即采用三引物（LP、RP、BP）进行PCR扩增。

野生型植株目的基因的两条染色体上均未发生T-DNA插入，所以其PCR产物仅有1种，分子量约900bp（即从LP到RP）；纯合突变体植株目的基因的两条染色体上均发生T-DNA插入，T-DNA本身的长度约为25kb，过长的模板会阻止目的基因特异性扩增产物的形成，所以也只能得到1种以BP与LP或RP为引物进行扩增的产物，分子量约为400-700bp；杂合突变体植株只在目的基因的一条染色体上发发生了T-DNA插入，所以PCR扩增后可同时得到两种产物。

上述3种情况的电泳结果差异明显，能有效区分不同基因型的植株。

此法优点是可同时鉴定出纯和突变体并确证T-DNA的插入情况。

图1 T-DNA插入示意图CATB，即十六烷基三甲基溴化铵，是一种离子型表面活性剂。

能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。

并且CATB可在高离子强度的溶液里与蛋白质和大多数多聚糖形成复合物进而形成沉淀，但不沉淀核酸。

本实验使用CATB抽提DNA。

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是体外核酸扩增技术。

它具有特异性高、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至几万倍，使肉眼能直接观察和判断。

拟南芥T-DNA插入突变纯合体的鉴定

拟南芥T-DNA插入突变纯合体的鉴定余振洋（高山山、潘红芳）、09级生技1班、200900140156、2011/12/14摘要本实验通过CTAB法提取目的拟南芥的DNA，再用三引物法PCR扩增所需的目的基因后，用电泳检测该拟南芥是否为转基因的拟南芥，并判断其是纯合突变还是杂合突变。

关键词拟南芥;T-DNA；突变纯和体1．引言T-DNA是根癌农杆菌Ti质粒上的一段DNA序列，它能稳定地整合到植物基因组中并稳定地表达。

T—DNA在植物中一般都以低拷贝插入，多为单拷贝。

单拷贝T-DNA一旦整合到植物基因组中，就会表现出孟德尔遗传特性，在后代中长期稳定表达，且插入后不再移动，便于保存。

T—DNA插入突变在反向遗传学和功能基因组学研究中发挥着重要作用。

，T—DNA插入突变能方便地进行正向和反向遗传学研究，因而受到重视。

同时，基因组测序工作的完成使得从位点到表型的反向遗传学研究成为可能，从而使通过T—DNA插入技术构建突变体来研究功能的反向遗传学技术逐渐取代了传统的化学诱变、图位克隆等技术。

借助于农杆菌介导的遗传转化技术，T—DNA插入技术已被广泛应用于拟南芥等模式植物的突变体库构建中。

以T—DNA作为插入元件，不但能破坏插入位点基因的功能，而且能通过插入产生的功能缺失突变体的表型及生化特征的变化，为该基因的研究提供有用的线索。

由于插入的T—DNA序列是已知的，因此可以通过已知的外源基因序列，利用反向PCR、TAIL-PCR、质粒挽救等方法对突变基因进行克隆和序列分析，并对比突变的表型研究基因的功能。

还可以利用扩增出的插入位点的侧翼序列，建立侧翼序列数据库，对基因进行更全面的分析。

由此可见，T—DNA 插入标签技术已成为发现新基因、鉴定基因功能的一种重要手段。

CTAB法提取植物叶片中的DNA是我们常用的方法。

通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。

实验十、模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定-23页精选文档

基础上，通过对靶基因进行特定的加工和修饰，如定点突变、插入、缺失、置换等，再研究这些修饰对生物体的表型、性状可能有何种影响，从而了解基因和其编码蛋白质在生物体内的功能。
模式植物拟南芥
拟南芥（Arabidopsis thaliana ）又称为阿拉伯芥，是一种十字花科植物，广泛用于遗传、发育和分子生物学的研究，已成为一种典型的模式植物。该植物具有以下特点：
植株形态个体小，高度只有30cm左右，1个茶杯可种植好几棵；生长周期快，每代时间短，从播种到收获种子一般只需8周左右；种子多，每株可产生数千粒种子；形态特征简单，生命力强，用普通培
养基就可作人工培养；基因组小，只有5对染色体。拟南芥是严格的闭花自花受粉植物，
基因高度纯合。易获通过理化处理获得各种功能的突变体。
外成像仪
实验步骤-拟南芥的栽培
一.在播种前将种子进行消毒，然后置于4℃冰箱中，使种子在湿润条件下春化2至3天。
二.将春化好的种子播种于有麦氏培养基（MS培养基）的培养皿中，置于培养室内培养。
三.待幼苗长出后，再选择茁壮的幼苗移栽到土壤中，置于培养室内培养。
实验步骤-拟南芥T-DNA插入突变体PCR鉴定法
1. CATB法提取DNA：液氮、2×CTAB抽提缓冲溶液、氯仿：异戊醇 =24：1、无水乙醇、70%乙醇、TE
2. PCR：ddH2O、Buffer、MgCl2、dNTP、引物（LP、RP、BP）、DNA模版、Taq DNA聚合酶
3. 电泳：琼脂糖、Maker、Buffer、EB、TAE
❖ 仪器：离心机，水浴锅，移液器，PCR仪，电泳槽，紫
每小组按10倍准备混合体系；每个同学需做一颗植株的鉴定（两管PCR）。
LP: JDM17-1NR2 RP: JDM17-1F2 BP: LBb1.3

植物DNA提取——拟南芥

【实验目的】1、采用CTAB法从植物叶片中提取基因组DNA，并用PCR方法鉴定T-DNA插入纯合突变体和琼脂糖凝胶电泳。

2、掌握CTAB法从植物叶片中提取DNA的原理和方法。

3、掌握应用PCR技术扩增目的基因的原理和方法。

4、掌握琼脂糖凝胶电泳的操作和原理及分析方法。

【实验原理】DNA是分子生物学研究的基本材料，依不同实验目的采取相应的抽提DNA方法，获取数量、质量不等的DNA。

CTAB(十六烷基三甲基溴化铵，也称六癸基三甲基溴化铵)是一种非离子去污剂，用CTAB法抽提植物总DNA，操作简便、快速、产量高，但纯度稍次，适用于一般分子生物学操作。

在DNA提取过程中，第一步就是使组织细胞破裂后释放出DNA，第二步就是DNA与其他细胞组分如蛋白质、碳水化合物、膜和细胞壁相分离。

在这个方法中，植物细胞首先在液氮中冰冻，然后用研钵或植物粉碎机研磨，使组织细胞破裂后释放出D14A。

研磨好的组织置于预热的1．5×CTAB(高盐1．05mol/L NaCl)缓冲溶液中，加热至65℃。

此时CTAB可与核酸形成复合物，这种复合物在高盐(＞0．7mol/L)溶液中是可溶的，并且可以稳定存在，而细胞壁纤维和大部分变性蛋白质则沉淀，从而从DNA中去除污染物，而部分蛋白质及多糖(酶抑制剂)仍溶于溶液中。

β-琉基乙醇可抑制多酚氧化酶的氧化，防止植物组织发黄变褐。

经过初次保温后，氯仿／异戊醇抽提就可除去仍溶于溶液中的蛋白质、多糖，最后用乙醇沉淀DNA(CTAB-核酸复合物在低盐溶液中因溶解度降低而沉淀)，并洗去CTAB。

分离纯化核酸总的原则，一是要保证核酸一级结构的完整性；二是要排除其他分子的污染。

抽提的DNA中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子，且其他生物大分子的污染应降到最低程度。

Ti质粒和T-DNA：Ti质粒是土壤农杆菌的天然质粒，该质粒上有一段特殊的DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移进植物细胞，并插入植物染色体DNA中。

模式植物拟南芥T

模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定摘要当农杆菌侵染植物细胞时，土壤农杆菌的天然质粒—Ti质粒上T-DNA区段能自发转移进植物细胞，并插入染色体DNA中。

拟南芥的T-DNA插入变异是反向遗传学进行植物生物学研究的重要手段之一，在获得的Ti质粒转化植物细胞后代分离群体中，有T-DNA插入的纯合突变体，杂合突变体，和野生型，在突变体研究中，需要的材料是纯合突变体，所以必须从分离群体中将纯合突变体鉴定出来。

本实验以拟南芥植株的特定基因突变体作为实验材料，提取DNA，并通过PCR扩增及SDS-PAGE电泳分离检测鉴定，检测该拟南芥是否为转基因的拟南芥，并判断其是纯合突变还是杂合突变。

本次实验目的在于了解拟南芥T-DNA插入突变体鉴定的原理，掌握DNA提取技术、PCR技术以及电泳鉴定技术，对拟南芥的基因型做出判断。

关键词T-DNA插入突变体拟南芥 PCR 琼脂糖凝胶电泳1.引言1.1遗传研究途径（1）正向遗传学研究杂交或诱变→表型观察→遗传规律→确定存在的基因及数目→基因的功能及作用性质。

（2）反向遗传学研究在已知DNA序列的基础上，通过DNA重组、定点突变、插入/缺失等遗传修饰手段创造突变体并研究突变所造成的表型效应，从而研究基因的生物学功能，阐明生命的本质现象与规律。

拟南芥的T-DNA插入变异是反向遗传学进行植物生物学研究的重要手段之一。

1.2模式生物——拟南芥拟南芥广泛用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学的研究，已成为一种典型的模式植物，其原因主要基于该植物具有以下特点：①植株形态个体小，高度只有30cm左右，1个茶杯可种植好几棵；②生长周期快，每代时间短，从播种到收获种子一般只需6周左右；③种子多，每株每代可产生数千粒种子；④形态特征简单，生命力强，用普通培养基就可作人工培养；⑤基因组小，只有5对染色体；⑥拟南芥是自花受粉植物，基因高度纯合，用理化因素处理突变率很高，容易获得各种代谢功能的缺陷型。

实验五拟南芥T DNA插入突变纯合体的鉴定

一ml 一三五三’引物[一0 mmol/L] 一ml 一三五三’引物[一0 mmol/L]
三0ml反应体系二：
三0ml反应体系四：
二ml 植物基因组DNA样品[WT]
二ml 植物基因组DNA样品[一一一]
三ml 一0×扩增缓冲液
三ml 一0×扩增缓冲液
0.五 ml Taqase [五U/ml]
0.五 ml Taqase [五U/ml]
0.五 ml dNTP[一0 mmol/L]
0.五 ml dNTP[一0 mmol/L]
一ml 一三五三’引物[一0 mmol/L] 一ml 一三五三’引物[一0 mmol/L]
一ml LBa 引物[一0 mmol/L]
一ml LBa 引物[一0 mmol/L]
电泳检测
• 每个大组选两个人点样,电泳结果扫描保存, 下次课看结果,
• LBa一 of pBIN-pROK二 for SALK lines： TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG
植物基因组DNA的快速提取
[一]取植物叶片[拟南芥一片叶子],置于一.五ml离心管中,加入四00 ml提取缓冲液;
[二]用研磨棒研磨植物材料,直至缓冲液变为绿色; [三]在台式离心机上一三000 rpm离心五分钟; [四]离心后将上清三00 ml转移至一个新的一.五 ml离心管中; [五]在上清中加入三00 ml异丙醇,混匀后于室温下一三000 rpm条
用无菌水补足体积,
PCR反应条件
八四℃ 三min 三0循环 [八四℃/一min,五五℃/一min,七二℃/一min]; 七二℃ 延伸一0min,
注：反应条件需根据所要扩增产物的大小和引物的性质进行合适的调整,
PCR安排

植物组织DNA的提取和鉴定

拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定实验目的1.通过实验学习并掌握用CTAB来提取DNA的方法。

2.了解CTAB的成分及作用。

3.学习PCR的原理并掌握其方法。

4.学习琼脂糖凝胶电泳的原理与方法。

实验原理植物组织中绝大部分是核DNA，它和组蛋白、非组蛋白结合在一起，以核蛋白（即染色质或染色体）的形式存在于细胞核内。

CTAB(十六烷基三甲基溴化铵，简称CTAB)：是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中(0.7mol/L NaCl)是可溶的，当降低溶液盐的浓度到一定程度(0.3mol/L NaCl)时从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开，然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇中。

DNA是遗传信息的载体和基本遗传物质，它在遗传变异、代谢调控等方面起着重要作用，是分子生物学和基因工程研究的对象，但无论是研究植物DNA的结构和功能，还是开展外源DNA的转化、转导的研究，首先要做的就是从植物组织中提取天然状态的高分子量的纯化DNA。

T-DNA，转移DNA（transferred DNA ），是根瘤农杆菌Ti质粒中的一段DNA 序列,可以从农杆菌中转移并稳定整合到植物基因组。

人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，获得转基因植株。

除用于转基因以外，T-DNA插入到植物的基因中可引起基因的失活，从而产生基因敲除突变体；T-DNA大多为单拷贝插入，使其利于进行遗传分析。

PCR基本原理：聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于在体外快速扩增DNA，具有类似细胞内DNA的复制过程:由一对引物介导，通过温度的调节，使双链DNA变性为单链DNA、单链DNA能与引物复性（退火）成为引物-DNA单链复合物、以及在dNTPs存在下DNA聚合酶能使引物沿单链模板延伸成为双链DNA（引物的延伸）；这种热变性-复性-延伸的过程，就是一个PCR循环；一般通过20-30个循环之后，就可获得大量的要扩增的DNA 片段。

模式植物拟南芥TDNA插入突变体的鉴定

菌侵染植物细胞，实现外源基因对植物的遗传转化。
T-DNA插入到植物染色体上的位置是随机的。如果T-DNA插入某个功能基因的内部，特别是插入到外显子区，将造成基因功能的丧失。利用农杆菌Ti质粒转化植物细胞，是获得植物突变体的一种重要方法。
2012.11.28
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模式植物拟南芥
拟南芥全部基因组测序已经完成，每个单倍染色体组（n=5）的总长只有7000万个碱基对（只有小麦染色体组长的1/80），预测共有29,454个基因。这样科学家就可以准确定位插入DNA的位置。
DIFF_TM 0.55 LP TCTAGGAAATCGATCGGGTTC
Len 21 TM 60.40 GC 47.62 SELF_ANY_COMPL 0.55
3'_COMPL 0.00 RP GAGAGCATGTAAGGATGCTGG
Len 21 TM 59.85 GC 52.38 SELF_ANY_COMPL 0.55
模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定
201L2.O11G.2O8
目录
实验设计思路和原理
拟南芥的栽培
拟南芥T-DNA插入突变体的PCR鉴定
2012.11.28
1
实验设计的思路和原理
经典遗传学是从生物的性状、表型到遗传物质来研
究生命的发生与发展规律。
反向遗传学则是是在获得生物体基因组全部序列的
打开NCBI主页： http://www.ncbi.nl / 打开的页面如下：在上面的search内查找基因名称APETALA1：
从上面可以看到一共有19 个结果，其中第一个是拟南芥中的，点击AP1：
根据上面的信息我们可以
得到基因在拟南芥内的系
统名称：AT1G69120

T-DNA插入双突鉴定

DNA 提取液
上层溶液
洗涤干燥
细胞裂解
异丙醇沉淀
DNA 溶液
具体步骤
提取缓冲液：200mM Tris-Hcl(PH7.4);
25mM EDTA(PH8.0); 250mM Nacl; 0.5%SDS (1) 取拟南芥两片叶子，置于1.5ml离心管中，加入700ml 提取缓冲液；（2）用研磨棒研磨植物材料，直至缓冲液变为绿色；（3）在台式离心机上12000 rpm离心10分钟；（4）离心后将上清转移至一个新的1.5 ml离心管中；（5）在上清中加入700ml异丙醇，混匀后放入-20℃ 30分钟然后12000 rpm条件下，离心10分钟；（6）弃上清后，用70%乙醇润洗沉淀，并在室温过夜干燥；（7）100 ml dd H₂O
拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定
实验目的

提取植物基因组DNA的方法 PCR操作方法琼脂糖凝胶分离核酸方法

鉴定纯ห้องสมุดไป่ตู้子为进一步实验做准备
Ti-质粒与植物基因组的相互作用
Ti质粒和T-DNA
Ti质粒毒性区基因激活及 T-DNA复合物生成
T-DNA插入鉴定的原理
（以拟南芥为例）
叶片研磨离心冰浴离心
PCR-引物设计
/tdnaprimers.2 .html
以salk_080951为例： LP： TTCACAGTTTCAACGTTGTGG RP： GTAGCGTGATTTCGAGTTTGG
BP：
PCR-原理与程序
Condition 94 ℃ 5 min 94 ℃ 15sec 56 ℃ 15sec 72 ℃ 1 min 72 ℃ 10min 4 ℃ forever

模式植物拟南芥tdna插入突变体的鉴定

模式植物拟南芥tdna插入突变体的鉴定姓名系年级学号日期科目遗传学实验题目模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定摘要：农杆菌Ti质粒转化植物细胞后，在获得的后代分离群体中，有T-DNA插入的纯合突变体，杂合突变体，和野生型。

在突变体研究中，需要的材料是纯合突变体。

本次实验意在对模式植物拟南芥T-DNA插入突变体进行鉴定。

实验中用到的主要实验方法有：CTAB法提取拟南芥基因组DNA、PCR扩增目的基因片段、琼脂糖凝胶电泳分离核酸。

PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程。

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成。

每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩增目的基因扩增放大几百万倍。

琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。

它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。

带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。

DNA经EB染色，EB可与核酸结合，在紫外光激发下产生荧光。

现广泛应用于核酸的研究中。

引言Ti质粒是土壤农杆菌的天然质粒，该质粒上有一段特殊的DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移进植物细胞，并插入植物染色体DNA中。

所以Ti质粒上的这一段能转移的DNA被叫做T-DNA。

将Ti质粒进行改造，将感兴趣的基因放进T-DNA区段中，通过农杆菌侵染植物细胞，实现外源基因对植物的遗传转化。

T-DNA插入基因内部导致基因突变：T-DNA插入到植物染色体上的位置是随机的。

如果T-DNA插入进某个功能基因的内部，特别是插入到外显子区，将造成基因功能的丧失。

所以利用农杆菌Ti质粒转化植物细胞，是获得植物突变体的一种重要方法。

农杆菌能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有感染能力。

这使农杆菌Ti 质粒转化系统的应用范围受到了一定的限制。

反向遗传学研究的首要条件是获得基因敲出突变体，建立可靠、有效、方便的T-DNA插入突变体的鉴定方法。

拟南芥At2g23470基因T-DNA插入突变体的鉴定

拟南芥At2g23470基因T-DNA插入突变体的鉴定李斯琪;宋欣;赵淑清【期刊名称】《山西农业科学》【年(卷),期】2017(045)005【摘要】At2g23470是拟南芥功能未知结构域DUF647蛋白家族的一个成员.为了研究At2g23470基因的功能,需要获得At2g23470功能缺失的突变体材料.根据拟南芥信息资源网站(The Arabidopsis Information Resource,TAIR)上公布的At2g23470基因可利用的T-DNA标签品系,从美国拟南芥生物资源中心(Arabidopsis Biological Resource Center,ABRC)购买了2套独立的At2g23470基因的T-DNA插入GABI-Kat株系种子,运用PCR法对这些T-DNA插入突变体进行了基因型分析和鉴定,结果获得了3个纯合的T-DNA插入位于RUS4启动子上的株系和1个T-DNA插入位于第2外显子的株系.RT-PCR分析表明,T-DNA插入位于第2外显子的株系中,At2g23470基因的表达完全缺失.该突变材料的获得为深入研究At2g23470基因的功能奠定了良好的基础.%At2g23470 is a member of the Domain of Unknown Function 647 protein family that is conserved in diverse eukaryotic organisms.To identify Arabidopsis T-DNA insertion mutants at the At2g23470 locus,we screened the ABRC collections.Two independent T-DNA lines carrying a T-DNA insertion either at the promoter or in the second exon,respectively,were genotyped using PCR-based analysis of genomic DNA.RT-PCR of homozygous T-DNA insertion mutants,using At2g23470-specifc primers,exhibited increasedAt2g23470 transcript levels in homozygous mutants with insertion at thepromoter;whilst At2g23470 transcripts could not be detected in the homozygous mutant with T-DNA insertion at the exon,indicating that it contains a null mutation in the At2g23470 gene.These homozygous mutants have laid a foundation for investigating the function of At2g23470 gene in Arabidopsis growth and development.【总页数】5页(P684-688)【作者】李斯琪;宋欣;赵淑清【作者单位】山西大学生物技术研究所,山西太原030006;山西大学生物技术研究所,山西太原030006;山西大学生物技术研究所,山西太原030006【正文语种】中文【中图分类】Q943.2【相关文献】1.拟南芥核苷磷酸化酶基因的组织表达及其T-DNA 插入突变体鉴定 [J], 徐文晶;程玉祥2.拟南芥atcwinv1基因T-DNA插入纯合突变体PCR鉴定及表型观察 [J], 阮燕晔;张莹;王波3.拟南芥花粉表面蛋白基因T-DNA插入突变体的鉴定 [J], 易素华;张丞;史志浩;杨仲南;张森4.拟南芥β-罗勒烯合成酶基因T-DNA插入突变体的鉴定 [J], 马泉芳;魏然;刘春林5.拟南芥At5g58100基因T-DNA纯合插入突变体PCR鉴定及表型观察 [J], 刘瑶; 刘春宏; 庞朝廷; 高菊芳因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

拟南芥T-DNA插入突变

• 器材：离心机，离心管，PCR仪，点泳池，电泳现象仪
（3）筛选纯和突变体 3、实突验变原体理鉴定原理
三引物法
“三引物法”即采用三个引物（LP、RP、LB）进行PCR扩增。
野生型植株（WT）目的基因的两条染色体上均未发生T-DNA 插入，所以其PCR产物仅有1种，片段大小为基因的长度（即从LP到RP的长度）
The complex that comprises of the T-DNA bound to the binding protein then moves into the nucleus and is integrated into the nuclear genome.
2、反向遗传学的重要手段——T-DNA插入突变技术
• (1) 生长周期短, 6周内完成; • (2) 基因组小, 仅有5 条染色体,113 亿个碱基对,但是它的大多数基因与
其他“复杂”的植物基因具有很高的同源性，
• (3) 具有双子叶植物的所有特性
• (4) 有效的农杆菌介导转化途径,易获得大量的突变体和基因组资源; • (5) 在有限的空间内可大量种植，体形小, 占地少 • (6) 收获大量的种子，每株拟南芥可产生多达5000 粒种子； • (7) 生活力强，用普通培养基就可作人工培养。
研究基因功能的方法
• 1、转基因技术 • 2、基因敲除 • 3、基因敲入 • 4、基因诱导超表达 • 5、基因诱捕技术 • 6、 RNAi干扰 • 7、生物信息学分析 • 8、反义技术
2、反向遗传学的重要手段——T-DNA插入突变技术
农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有感染能力。
• 1.确定所要研究的基因通过生物信息学的方法推测出一些可能具有赤霉素糖基转移酶的基因。

拟南芥核苷磷酸化酶基因的组织表达及其T-DNA 插入突变体鉴定

拟南芥核苷磷酸化酶基因的组织表达及其T-DNA 插入突变
体鉴定
徐文晶;程玉祥
【期刊名称】《贵州农业科学》
【年(卷),期】2015(000)001
【摘要】为探明植物核苷磷酸化酶家族基因信息及生理功能，采用 PCR 扩增的方法，研究了模式植物拟南芥核苷磷酸化酶家族基因在不同组织中的表达，并对其核苷磷酸化酶基因 T-DNA 插入突变体进行鉴定。

结果表明：At4g24340和
At4g28940基因在根组织中大量转录表达，其他组织均微量检测到转录表达；
At4g24350在各个组织中均有少量转录表达；经T-DNA 插入结合转录表达鉴定，At4g28940和 At 4g24350基因为敲除突变体。

【总页数】4页(P16-19)
【作者】徐文晶;程玉祥
【作者单位】东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室，黑龙江哈尔滨150040;东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室，黑龙江哈尔滨 150040
【正文语种】中文
【中图分类】S503.52
【相关文献】
1.拟南芥atcwinv1基因T-DNA插入纯合突变体PCR鉴定及表型观察 [J], 阮燕晔;张莹;王波
2.拟南芥At2g23470基因T-DNA插入突变体的鉴定 [J], 李斯琪;宋欣;赵淑清
3.拟南芥花粉表面蛋白基因T-DNA插入突变体的鉴定 [J], 易素华;张丞;史志浩;杨仲南;张森
4.拟南芥β-罗勒烯合成酶基因T-DNA插入突变体的鉴定 [J], 马泉芳;魏然;刘春林
5.拟南芥At5g58100基因T-DNA纯合插入突变体PCR鉴定及表型观察 [J], 刘瑶; 刘春宏; 庞朝廷; 高菊芳
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