体外哺乳动物细胞染色体畸变试验
体外哺乳动物细胞染色体畸变试验
九、体外哺乳动物细胞染色体畸变试验In Vitro Mammalian Cells Chromosome Aberration Test1 范围本规范规定了体外哺乳动物细胞染色体畸变试验的基本原则、要求和方法。
本规范适用于检测化妆品原料及其产品的致突变性。
2 规范性引用文件OECD Guidelines for Testing of Chemicals ( No.473, July 1997)3试验目的本试验是用于检测培养的哺乳动物细胞染色体畸变，以评价受试物致突变的可能性。
4 定义染色体型畸变(Chromosome-type aberration)：染色体结构损伤，表现为在两个染色单体相同位点均出现断裂或断裂重组的改变。
染色单体型畸变(Chromatid-type aberration)：染色体结构损伤，表现为染色单体断裂或染色单体断裂重组的损伤。
染色体数目改变(Numerical aberration)：所用细胞株的正常染色体数目的变化。
结构畸变(Structural aberration)：在细胞分裂的中期相阶段，用显微镜检出的染色体结构改变，表现为缺失、断片、互换等。
有丝分裂指数(Mitotic index)：中期相细胞数与所观察的细胞总数之比值；是一项反映细胞增殖程度的指标。
5 试验基本原则在加入和不加入代谢活化系统的条件下，使培养的哺乳动物细胞暴露于受试物中。
用中期分裂相阻断剂（如秋水仙素或秋水仙胺）处理，使细胞停止在中期分裂相，随后收获细胞，制片，染色，分析染色体畸变。
6 试验方法6.1 试剂和受试物制备6.1.1 阳性对照物：可根据受试物的性质和结构选择适宜的阳性对照物，阳性对照物应是已知的断裂剂，能引起可检出的、并可重复的阳性结果。
当外源性活化系统不存在时，可使用甲磺酸甲酯（methyl methanesulphonate (MMS)）、甲磺酸乙酯（ethyl methanesulphonate(EMS)）、乙基亚硝基脲(ethyl nitrosourea)、丝裂霉素C(mitomycin C)、4-硝基喹啉-N-氧化物（4-nitroquinoline-N-oxide）。
体外哺乳动物细胞染色体畸变试验技术指导原则
体外哺乳动物细胞染色体畸变试验技术指导原则1.实验设计与样本准备在进行体外哺乳动物细胞染色体畸变试验前，需要进行实验设计和样本准备。
首先，选择一种适合的哺乳动物细胞系，如小鼠淋巴细胞、人类淋巴细胞等。
然后，根据实验目的和要求，确定所需的化学物质浓度和处理时间，并准备相应的实验组和阴性对照组。
2.处理和培养将待测化学物质按照预定浓度加入培养基中，与细胞混合后，将细胞培养在适当的培养条件下，如温度、湿度和CO2浓度等。
处理时间的选择应根据化学物质的毒性和实验要求，常用的处理时间为3-24小时。
3.收集细胞和染色处理时间结束后，将细胞进行收集，并根据需要制备适当的悬浮液。
通常，使用低渗透性溶液，如KCl或NaCl，进行细胞溶解或悬浮，然后用冷甲醇或乙醇定性和定量固定细胞。
4.制备染色板和染色将固定的细胞悬液倒入预先制备的染色板中，并进行染色处理。
常用的染色方法包括古德林染色法和雅司染色法等。
染色后，需要对细胞进行镜检，检查染色体形态和结构的异常情况，如染色体片段、缺失、畸形、染色体对不分离等。
5.统计和分析根据镜检结果，统计和分析染色体结构和功能的异常情况。
常用的分析方法包括计算细胞中染色体畸变率和细胞中染色体畸变类型的分布情况。
通过比较实验组和阴性对照组的差异性，可以评估其中一种化学物质对细胞染色体结构和功能的影响。
总结起来，体外哺乳动物细胞染色体畸变试验技术具有重要的遗传毒性评价意义，通过合理的实验设计和操作流程，可以评估其中一种化学物质对细胞染色体结构和功能的影响，为毒性评价提供科学的依据和参考。
生活饮用水输配水设备及防护材料卫生安全评价规范
生活饮用水输配水设备及防护材料卫生安全评价规范1范围本规范规定了生活饮用水输配水设备和防护材料的卫生安全评价。
生活饮用水输配水设备是指与生活饮用水接触的输配水管、蓄水容器、供水设备、机械部件（如阀门、水泵、水处理剂加入器等）；防护材料是指与生活饮用水接触的涂料、内衬等。
本规范同样适用于与饮用水接触的水处理材料（如水质处理器滤芯、膜组件、活性炭等）的卫生安全评价。
2引用资料生活饮用水水质卫生规范（2001）生活饮用水检验方法规范（2001）3卫生要求3.1 凡与饮用水接触的输配水设备、水处理材料和防护材料不得污染水质，出水水质必须符合《生活饮用水水质卫生规范》（2001）的要求。
3.2 生活饮用水输配水设备、水处理材料和防护材料应按附录A和附录B的规定进行浸泡试验。
3.3浸泡水需按附录A和附录B的方法处理。
检测结果必须分别符合表1和表2的规定。
表1 浸泡试验基本项目的卫生要求项目卫生要求色增加量≤5度浑浊度增加量≤0.2度（NTU）臭和味浸泡后水无异臭、异味肉眼可见物浸泡后水不产生任何肉眼可见的碎片杂物等pH 改变量≤0.5溶解性总固体增加量≤10mg/L耗氧量增加量≤1（以O2计，mg/L）砷增加量≤0.005 mg/L镉增加量≤0.0005 mg/L铬增加量≤0.005 mg/L铝增加量≤0.02 mg/L铅增加量≤0.001 mg/L汞增加量≤0.0002 mg/L三氯甲烷增加量≤0.006 mg/L挥发酚类增加量≤0.002 mg/L3.4 防护涂料的浸泡水尚需进行下列毒理学试验3.4.1 急性经口毒性（LD50）不得小于10g/kg体重。
3.4.2两项致突变试验：Ames试验和哺乳动物细胞染色体畸变试验两项均应为阴性。
3.5 当用新材料制备输配水设备、水处理材料和防护材料时，应测定在水中的溶出物及其浓度，并根据国内外相关标准评价其安全性。
无标准可依的，按附录C进行毒理学试验确定限值。
4检验4.1所有样品应检验表1的全部项目，并根据样品的种类、性质按表3确定输配水设备浸泡试验增测检验项目；按表4确定防护材料浸泡试验选测检验项目；按表5确定水处理材料浸泡试验选测检验项目。
医疗器械生物相容性试验方案
医疗器械生物学试验方案我公司委托贵检验中心对我公司的×××××××××××产品，按照下列方法进行生物相容性试验：1.细胞毒性（1）（显微镜观察法）取××产品/部件，按□0.1g/mL；□0.2g/mL；□1.25cm2/mL；□3cm2/mL；□6cm2/mL的比例（浸提比例见样品制备方法说明），浸提介质为含血清培养基， (37±1)℃， (24±2)h制备试验液，取试验液按照GB/T16886.5-2017中8.2规定的浸提法进行。
细胞毒性分级不大于□ 1；□ 2；□ 3；□4（分级大于2时被认为有细胞毒性）（2）浸提液试验（MTT法）取××产品/部件，按 0.2g/mL 的比例，浸提介质为含血清培养基， (37±1)℃， (24±2)h制备试验液，取试验液按照GB/T16886.5-2017中附录C规定的浸提法进行。
细胞存活率应不小于70%。
（3）直接接触试验取××产品/原液直接使用，按照GB/T16886.5-2017中8.3规定的直接接触法进行。
(适用于液体，凝胶，单一材质的片状产品)细胞毒性分级不大于□ 1；□ 2；□ 3；□4（分级大于2时被认为有细胞毒性）（4）间接接触试验——琼脂扩散法细胞毒性分级不大于□ 1；□ 2；□ 3；□4（分级大于2时被认为有细胞毒性）2. 致敏试验（1）取××产品/部件，按 0.2g/mL 的比例，浸提介质0.9%氯化钠注射液和植物油；(37±1)℃，(72±2) h制备试验液,按照GB/T16886.10-2017中7.5规定的最大剂量试验方法进行。
或者（2）××产品/部件，按照GB/T16886.10-2017中7.6规定的封闭贴敷试验方法进行。
体外哺乳动物细胞基因突变试验
十、体外哺乳动物细胞基因突变试验In Vitro Mammalian Cell Gene Mutation Test1 范围本规范规定了体外哺乳类细胞基因突变试验的基本原则、要求和方法。
本规范适用于检测化妆品原料及其产品的致突变性。
2 规范性引用文件OECD Guidelines for Testing of Chemicals (No. 476, 1997)3 试验目的该测试系统用于检测化妆品原料及其产品引起的突变，包括碱基对突变、移码突变和缺失等，从而评价受试物引起突变的可能性。
4 定义正向突变（Forward mutation）：从原型至突变子型的基因突变，这种突变可引起酶和功能蛋白的改变。
突变频率（Mutant frequency）：所观察到的突变细胞数与存活细胞数之比值。
5试验原理在加入和不加入代谢活化系统的条件下，使细胞暴露于受试物一定时间，然后将细胞再传代培养，突变细胞在含有6-硫代鸟嘌呤（6-thioguanine，6-TG）或三氟胸苷（trifluorothymidine，TFT）的选择性培养液中能继续分裂并形成集落。
基于突变集落数，计算突变频率以评价受试物的致突变性。
6 试验方法6.1 试剂和受试物制备6.1.1 受试物6.1.1.1 受试物的配制：固体受试物需溶解或悬浮于溶剂中，用前稀释至适合浓度；液体受试物可以直接加入试验系统/或用前稀释至适合浓度。
受试物应在使用前新鲜配制，否则就必须证实储存不影响其稳定性。
6.1.1.2 溶剂的选择：溶剂必须是非致突变物，不与受试物发生化学反应，不影响细胞存活和S9活性。
首选溶剂是水或水溶性溶剂。
二甲基亚砜（DMSO）也是常用溶剂，但使用时浓度不应大于0.5%。
6.1.1.3 受试物浓度设置6.1.1.3.1 最高浓度的选择：决定最高浓度的因素是细胞毒性、受试物在试验系统中的溶解度以及pH或渗克分子浓度（osmolality）的改变。
6.1.1.3.2 细胞毒性的确定：应使用指示细胞完整性和生长情况的指标，在活化系统存在或不存在两种条件下确定细胞毒性，例如相对集落形成率或相对细胞总生长情况（total growth）。
医疗器械生物相容性概述
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相关概念
生物相容性：
生命体组织对非活性材料产生反应的一种性能。
医疗器械：制造者专门或主要设计成为下列目的应用于人体的， 不论是单独使用还是组合使用的，包括使用所需软件在内的任 何仪器、设备、器具、材料或者其他物品。
预期用于人体的任何材料或器械的选择与评价需遵循一定的评价程
在加入和不加入代谢活化系统的条件下，使培养的哺乳动 物细胞暴露于受试物中。用中期分裂相阻断剂（如秋水仙 素或秋水仙胺）处理，使细胞停止在中期分裂相，随后收 获细胞，制片，染色，分析染色体畸变。
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体外哺乳动物细胞染色体畸变试验
测试系统：
中国地鼠卵巢（CHO）细胞株；中国地鼠肺（CHL）细胞株；
D6610
修复
urvBurvBurvB-
缺失
LPS VIT
rfa-
bio-
rfa-
bio-
rfa-
bio-
质粒
----pKM101
可检测的 突变类型
碱基置换 移码
移码
TA 98 TA 100
D3052 urvB-rvB- rfa-
bio-
TA 102
G428 urvB+ rfa-
处理条件：
包括代谢活化和非代谢活化条件 在处理后6和24小时收获细胞 代谢活化条件下，受试物处理时间为3小时
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体外哺乳动物细胞染色体畸变试验 读片分析：
有丝分裂指数－毒性 染色体结构畸变
染色体数目畸变
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a.染色单体断
裂
b. 三辐射体
c. 染色体断片
有杀菌作用，最高剂量可为最低抑菌浓度， 无杀菌作用的受试物，最高剂量可为原液，最低剂量 为0.1μg/皿。
体外哺乳动物细胞染色体畸变试验
九、体外哺乳动物细胞染色体畸变试验In Vitro Mammalian Cells Chromosome Aberration Test1 范围本规范规定了体外哺乳动物细胞染色体畸变试验的基本原则、要求和方法。
本规范适用于检测化妆品原料及其产品的致突变性。
2 规范性引用文件OECD Guidelines for Testing of Chemicals ( No.473, July 1997)3试验目的本试验是用于检测培养的哺乳动物细胞染色体畸变，以评价受试物致突变的可能性。
4 定义染色体型畸变(Chromosome-type aberration)：染色体结构损伤，表现为在两个染色单体相同位点均出现断裂或断裂重组的改变。
染色单体型畸变(Chromatid-type aberration)：染色体结构损伤，表现为染色单体断裂或染色单体断裂重组的损伤。
染色体数目改变(Numerical aberration)：所用细胞株的正常染色体数目的变化。
结构畸变(Structural aberration)：在细胞分裂的中期相阶段，用显微镜检出的染色体结构改变，表现为缺失、断片、互换等。
有丝分裂指数(Mitotic index)：中期相细胞数与所观察的细胞总数之比值；是一项反映细胞增殖程度的指标。
5 试验基本原则在加入和不加入代谢活化系统的条件下，使培养的哺乳动物细胞暴露于受试物中。
用中期分裂相阻断剂（如秋水仙素或秋水仙胺）处理，使细胞停止在中期分裂相，随后收获细胞，制片，染色，分析染色体畸变。
6 试验方法6.1 试剂和受试物制备6.1.1 阳性对照物：可根据受试物的性质和结构选择适宜的阳性对照物，阳性对照物应是已知的断裂剂，能引起可检出的、并可重复的阳性结果。
当外源性活化系统不存在时，可使用甲磺酸甲酯（methyl methanesulphonate (MMS)）、甲磺酸乙酯（ethyl methanesulphonate(EMS)）、乙基亚硝基脲(ethyl nitrosourea)、丝裂霉素C(mitomycin C)、4-硝基喹啉-N-氧化物（4-nitroquinoline-N-oxide）。
化妆品卫生规范
化妆品卫生规范Hygienic Standard for Cosmetics(2002年版)中华人民共和国卫生部二OO二年九月第一部分总则General Principle第二部分毒理学试验方法Methods of Toxicological Test第三部分卫生化学检验方法Methods of Hygienic ChemicalTest for Cosmetics第四部分微生物检验方法Methods of MicrobiologicalExamination for Cosmetics第五部分人体安全性和功效评价检验方法Methods of Safety and Functional Evaluation for Cosmeticson Human Body1范围本规范规定了对化妆品原料以及化妆品最终产品的卫生要求。
本规范适用于中华人民共和国境内销售的化妆品。
2 规范性引用文件欧盟化妆品规程（Dir．76／768／EEC 2000年3月版）（The Cosmetics Directive of the Council European Communities，Dir．76／768／EEC，March,2000）。
3 定义本规范采用下列定义化妆品是以涂抹，喷洒或其它类似方法，施于人体表面任何部位（皮肤、毛发、指甲、口唇、口腔粘膜等），以达到清洁、消除不良气味、护肤、美容和修饰目的的产品。
4 化妆品的一般要求4.1 化妆品不得对施用部位产生明显刺激和损伤。
4.2 化妆品必须使用安全，且无感染性。
5 对产品的要求5.1 化妆品的微生物学质量应符合下列规定5.1.1 眼部化妆品及口唇等粘膜用化妆品以及婴儿和儿童用化妆品菌落总数不得大于500CFU／mL 或500CFU／g。
5.1.2 其他化妆品菌落总数不得大于1000CFU／mL或1000CFU／g。
5.1.3 每克或每毫升产品中不得检出粪大肠菌群、绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌。
2000 化学品毒性鉴定管理规定-(卫生部,卫法监发〔2000〕420号)
化学品毒性鉴定管理规范（2000年11月27日卫生部发布）第一章总则第一条为了规范化学品毒性鉴定工作，保证毒性鉴定结论的真实、可靠，预防、控制化学品毒性危害，保护人体健康，依据《化学危险物品安全管理条例》和国家有关法律法规，制定本规范。
第二条本规范所称化学品，系指工业用和民用的化学原料、中间体、产品等单分子化合物、聚合物以及不同化学物组成的混合剂与产品。
食品、食品添加剂、化妆品、药品等法律法规已有规定的除外。
第三条从事化学品毒性鉴定，向社会出具化学品毒性鉴定报告的各类医疗卫生技术、科研和教学机构必须遵守本规范。
第二章毒性鉴定机构第四条从事化学品毒性鉴定的机构，应当经资质认证并取得《化学品毒性鉴定机构资格证书》(以下简称《资格证书》)。
毒性鉴定机构应当依照有关法律法规、技术规范和标准开展化学品毒性鉴定工作，对出具的化学品毒性鉴定报告承担法律责任。
第五条从事化学品毒性鉴定的机构，必须具备下列条件:(一)只有符合《化学品毒性鉴定实验室条件及工作准则》（GLP）要求的毒理实验室;实验室负责人应具有正高级以上职称并从事相关专业工作5年以上;(二)具有与其开展的检验类别和检验项目条件相适应的检验技术人员;(三)具备量值准确可靠、性能完好、与其检验类别和检验项目相适应的仪器设备;(四)具有相应的动物房，取得卫生部医药卫生系统二级以上《医学实验动物环境设施合格证书（动物实验条件）》，动物实验人员应取得《动物实验技术人员资格认可证》；(五)只有健全的技术和质量管理制度;(六)经省级以上人民政府计量行政部门计量认证合格;(七)具有独立承担民事责任的能力。
第六条申请毒性鉴定机构资质认证，应当提交下列资料:(一)化学品毒性鉴定机构资质认证申请表;(二)法人资格证书;(三) 计量认证合格证书;(四)实验动物房情况介绍及《医学实验动物环境设施合格证书》；(五) 与申请鉴定类别和项目有关的实验室情况介绍;(六)相关仪器设备名称、数量及状态;(七) 相关检验人员及负责人姓名、职称和从事相关专业的工作年限，医学实验动物技术人员资格认可证等资料;(八)曾经完成的相关工作总结报告，包括能代表申请机构技术水平的实验报告;(九)卫生部要求提供的其他有关资料。
药物遗传毒性研究技术指导原则
药物遗传毒性研究技术指导原则药物遗传毒性研究技术指导原则一、概述遗传毒性研究（GenotoxicityStudy）是药物非临床安全性评价的重要内容，与其他研究尤其是致癌性、生殖毒性等研究有着密切的联系，是药物进入临床试验及上市的重要环节。
拟用于人体的药物，应根据受试物拟用适应症和作用特点等因素考虑进行遗传毒性试验。
遗传毒性试验是指用于检测通过不同机制直接或间接诱导遗传学损伤的受试物的体外和体内试验，这些试验能检测出DNA损伤及其损伤的固定。
以基因突变、较大范围染色体损伤或重组形式出现的DNA 损伤的固定，通常被认为是可遗传效应的基础，并且是恶性肿瘤多阶段发展过程的重要因素（恶性肿瘤发展变化是一个复杂的过程，遗传学改变可能仅在其中起部分作用）。
染色体数目的改变也与肿瘤发生有关，并可提示生殖细胞出现非整倍体的可能性。
在遗传毒性试验中呈阳性的化合物为潜在的人类致癌剂和/或致突变剂。
由于在人体中已建立了某些致突变/遗传毒性化合物的暴露与致癌性之间的相关性，而对于遗传性疾病尚难以证明有类似的相关性，因此遗传毒性试验主要用于致癌性预测。
但是，因为生殖细胞突变与人类疾病具有明确的相关性，所以也应同样重视化合物引起潜在可遗传性效应的风险。
此外，遗传毒性试验结果可能对致癌性试验的结果分析有重要作用。
因此，在药物开发的过程中，遗传毒性试验的目的是通过一系列试验来预测受试物是否有遗传毒性，在降低临床试验受试者和药品上市后使用人群的用药风险方面发挥重要作用。
本指导原则重点阐述遗传毒性试验的基本原则，介绍标准试验组合方案，阐述体内外试验的基本原则，以及对试验结果的分析评价与追加研究策略。
本指导原则适用于中药、天然药物和化学药物。
二、基本原则（一）实验管理药物遗传毒性试验必须执行《药物非临床研究质量管理规范》（GLP）。
（二）具体问题具体分析遗传毒性试验的设计，应该在对受试物认知的基础上，遵循“具体问题具体分析”的原则。
应根据受试物的结构特点、理化性质、已有的药理毒理研究信息等选择合理的试验方法，设计适宜的试验方案，并试验结果进行全面的分析与评价。
化妆品申报注册备案时毒理学检验项目有哪些
化妆品备案申报应做的毒理学检验项目经常会有化妆品备案企业询问产品备案时都需要做些什么项目,但解释半天却又一头雾水。
因此，北京天健华成国际投资顾问有限公司化妆品注册部的同学工作之余就写一些文字，以期解惑。
不许抄袭哦！一、化妆品涉及的常见毒理学检验项目（1）急性经口和急性经皮毒性试验（2）皮肤和眼刺激性试验（3）皮肤变态反应试验（4）皮肤光毒性试验（必要时）（5）Ames鼠伤寒沙门氏菌／回复突变试验（6）体外哺乳动物细胞染色体畸变试验二、不同类别化妆品成品的毒理学检验项目不同类别化妆品的检验项目一样吗？当然不一样，化妆品的类别是决定检验项目的关键。
我国将化妆品分为两大类，即：特殊用途化妆品和非特殊用途化妆品。
特殊用途化妆品按功能分为9类，即：育发、美乳、健美、防晒、祛斑、染发、烫发、脱毛、除臭。
非特殊用途化妆品（俗称普通化妆品）可分为：发用品、护肤品、彩妆品、指（趾）甲用品、芳香品。
下面就来分别看看它们对应的检验项目。
1、非特殊用途化妆品应进行的毒理学检验项目（1）发用品（2）护肤品（3）彩妆品（4）芳香品、指（趾）甲用品注： 1.免洗护发类不做急性眼刺激性试验。
2.不需进行试验。
3.进行急性皮肤刺激性试验，不需进行多次皮肤刺激性试验。
4.不需进行眼刺激试验。
5.对于紫外线吸收剂加入量≥0.5%的产品,还应进行皮肤光度试验和皮肤变态反应试。
表中未涉及的产品，在选择试验项目时应根据实际情况确定，可按具体产品用途和类别增加或减少检验项目。
多色号系列非特化妆品多色号系列化妆品是指：产品配方除色素(色调调整部分)种类或含量不同外，其余配方成分种类相同，且系列名称相同的普通化妆品。
该系列产品应作为一组产品同时申报。
抽样检验原则：抽样比例30%，不足10个，以10个计。
首选含有机色素和色素含量高的产品，如果含量相同，则选择色素种类最多的产品。
2、特殊用途化妆品应进行的毒理学检验项目注：3. 除育发类、防晒类和祛斑类产品外，紫外线吸收剂加入量≥0.5%的其他产品,还应进行皮肤光毒性试验。
生物学评价试验要求样板(2017)
公司名称样品名称生物学评价试验要求1. 要求1.1 细胞毒性：细胞毒性反应应不大于X级。
1.2 皮内反应：试验样品与溶剂对照平均记分之差应不大于X。
1.3 皮肤刺激：试验样品的原发性刺激指数应小于X。
1.4迟发型超敏反应：试验样品应无迟发型超敏反应。
1.5 热原：在试验条件下，3只家兔体温升高均应低于0.6℃，并且3只家兔体温升高总和应低于1.3℃，无热原反应。
1.6 与血液相互作用试验：1.6.1 血栓形成：样品与对照比，无统计学差异或优于对照，如有差异，样品与对照的百分比在85%-115%之间。
1.6.2 凝血：样品与对照比，无统计学差异或优于对照，如有差异，样品与对照的百分比在85%-115%之间。
1.6.3 血小板：样品与对照比，无统计学差异或优于对照，如有差异，样品与对照的百分比在85%-115%之间。
1.6.4 血液学：样品与对照比，无统计学差异或优于对照，如有差异，样品与对照的百分比在85%-115%之间。
1.6.5 补体系统：样品与对照比，无统计学差异或优于对照，如有差异，样品与对照的百分比在85%-115%之间。
1.6.6 溶血：试验样品的溶血率应小于5%。
1.7 急性全身毒性：在试验观察周期内，试验样品应无急性全身毒性反应。
1.8植入试验：植入后试验样品组和对照材料组的局部生物学反应相比较，应无显著性差异。
1.9亚急/亚慢/慢性毒性试验：试验样品应无亚急/亚慢/慢性毒性反应，且试验样品组和对照组相比较，应无显著性差异。
1.10 眼刺激：试验样品应不引起眼刺激反应。
1.11 口腔刺激：试验样品的刺激指数应不大于X。
1.12 阴道刺激：试验样品的刺激指数应不大于X。
1.13 阴茎刺激：试验样品的刺激指数应不大于X。
1.14 直肠刺激：试验样品的刺激指数应不大于X。
注：企业根据被检样品的性质和风险类别选择X值。
1.15 遗传毒性1.15.1 体外哺乳动物细胞基因突变试验：在试验条件下，试验样品的体外哺乳动物细胞基因突变试验结果应为阴性。
体外哺乳动物细胞TK基因突变试验原理及注意事项
体外哺乳动物细胞TK基因突变试验原理及注意事项TK基因突变试验的检测终点是TK基因的突变。
TK基因突变属于常染色体基因突变。
TK基因的产物胸苷激酶在体内催化从脱氧胸苷(TdR)生成胸苷酸(TMP)的反应。
在正常情况下，此反应并非生命所必需，原因是体内的TMP主要来自于脱氧尿嘧啶核苷酸(dUMP),即由胸苷酸合成酶催化的dUMP甲基化反应生成TMP。
但如在细胞培养物中加入胸苷类似物(如三氟胸苷,即trifluorothymidine,TFT)，则TFT在胸苷激酶的催化下可生成三氟胸苷酸，进而掺入DNA，造成致死性突变,故细胞不能存活。
若TK基因发生突变，导致胸苷激酶缺陷,则TFT不能磷酸化，亦不能掺DNA，故突变细胞在含有TFT的培养基中能够生长，即表现出对TFT的抗性。
根据突变集落形成数可计算突变频率，从而推断受试物的致突变性。
在TK基因突变试验结果观察中可发现两类明显不同集落，即大/小集落(L5178Y细胞)或正常生长/缓慢生长集落(TK6细胞)，有研究表明，大集落/正常生长集落主要由点突变或较小范围的缺失等引起，而小集落/缓慢生长集落主要由较大范围的染色体畸变，或由涉及调控细胞增殖的基因缺失引起。
北京汇智泰康医药技术有限公司针对小鼠淋巴瘤细胞TK基因突变试验开发染TK基因突变试剂盒，本试剂盒针对小鼠淋巴瘤细胞L5178Y开展TK基因突变试验，试剂盒省去了阳性底物成分、筛选培养基准备、诱导 S9 制备，可以直接使用，大大缩短了实验周期；试剂盒各成分均经过严格的质量检测，无杂菌污染，诱导 S9 活性均符合小鼠淋巴瘤细胞TK基因突变试验要求，实验结果准确、可靠、重现性高。
染色体畸变试验试剂盒应用广泛，可进行食品、化学品、农药、消毒剂、食品添加剂、药物残留、化妆品、容器与包装材料等多个方面的遗传毒理学检测。
TK基因突变试验导则1 范围本标准规定了体外哺乳类胸苷激旃(thymidine kinase TK)基因突变试验的基本试验方法与技术要求。
化学品毒理学评价程序和试验方法 第13部分：哺乳动物精原细胞∕初级精母细胞染色体畸变试验
多倍体ｐｏｌｙｐｌｏｉｄｙ 哺乳动物染色体数目正常是二倍体，在化学诱变剂的作用下，染色体数目成倍地增加成三倍体、四
ＧＢＺ／Ｔ ２４０．１３—２０１ １
倍体等。
３．８
染色体结构的畸变ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｂｅｒｒａｔｉｏｎ 通过显微镜可以直接观察到的发生在细胞有丝分裂中期的染色体结构变化。如染色体中间缺失和 断片，染色体互换和内交换等。
６．１．３ ６０％冰乙酸。
６．１．４固定液：甲醇与冰醋酸以３：ｌ混合，临用时现配。
６．１．５姬姆萨（Ｇｉｅｍｓａ）染液：
Ｇｉｅｍｓａ染料 甲醇
３．８ ｇ ３７５ ｍＬ
甘油
１２５ ｍＬ
配制：将Ｇｉｅｍｓａ染料和少量甲醇于乳钵里仔细研磨，再加入甲醇至３７５ ｍＬ，待完全溶解后，再加 入１２５ ｍＬ甘油，混合均匀。置３７℃恒温箱中保温４８ ｈ。保温期间振摇数次，促使染料的充分溶解。
３．４
染色体型畸变ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ－ｔｙｐｅ ａｂｅｒｒａｔｉｏｎ 在两个染色单体的相同位点均出现断裂或断裂重组等改变的结构性损伤。
３．５
裂隙ｇａｐ 染色体或染色单体损伤的长度小于一个染色单体的宽度，为染色单体的最小的错误排列。
３．６
染色体数目畸变ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｎｕｍｅｒｉｃａｌ ａｂｅｒｒａｔｉｏｎ 染色体数目发生改变，不同于正常核型。
２规范性引用文件
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ＧＢｚ／Ｔ ２２４职业卫生名词术语 ＧＢＺ／Ｔ ２４０．１化学品毒理学评价程序和试验方法第１部分：总则
３术语和定义
化妆品 体外哺乳动物细胞染色体畸变试验报告单(样式)(日化品 化妆品 护肤品 表单资料)
体外哺乳动物细胞染色体畸变试验报告检验受理编号：第页/ 共页样品中文名称检验开始日期检验项目体外哺乳动物细胞染检验完成日期色体畸变一、材料和方法1. 细胞株：名称，来源。
2. 代谢物活化系统：3. 阳性物：名称，批号，生产厂家，溶剂，浓度及用量。
4. 受试物：物态，溶剂、溶解度、配制方法，前处理方法。
剂量设计及最高剂量设计依据（说明受试物对细胞毒性、溶解情况等）。
5. 试验方法：包括对细胞毒性的测定方法，培养液和培养容器的种类，接种细胞数、中期阻断剂名称及终浓度、受试物与试验系统的接触时间；简述制片方法、分析的中期分裂相数目、结果评价方法等。
二、试验结果1.受试物最高剂量的确定及试验结果：溶解情况（见表1），细胞毒性的测定（见表2），对pH和渗克分子浓度的影响（如有影响）。
2.各处理组和对照组染色体畸变率及统计结果（见表3）：表1 受试物在所选溶剂中的溶解情况受试物浓度溶剂名称有否沉淀（轻微可见）（ g/mL）（本页以下空白）检验报告检验受理编号：第页/ 共页（接上页）表2 受试物对细胞的毒性受试物浓度（μg/mL）活细胞计数法分裂指数法细胞覆盖程度接种细胞数（/mL）活细胞（/mL）存活率（%）计数细胞数中期分裂相数分裂指数注：活细胞计数法、分裂指数法、细胞覆盖程度均可测定受试物对细胞的毒性，三选一即可。
表3 体外哺乳动物细胞染色体畸变试验结果组别终浓度（μg/mL）观察细胞数（个）畸变细胞数（个）畸变率（%）＋S9－S9＋S9－S9＋S9P －S9P阴性对照- - 阳性对照受试物注：用X2检验进行统计学分析，与阴性对照组比较，*P<0.05三、试验结论体外哺乳动物细胞染色体畸变试验结果：（本页以下空白）。
高中生物 体外哺乳动物细胞基因突变试验
十、体外哺乳动物细胞基因突变试验In Vitro Mammalian Cell Gene Mutation Test1 范围本规范规定了体外哺乳类细胞基因突变试验的基本原则、要求和方法。
本规范适用于检测化妆品原料及其产品的致突变性。
2 规范性引用文件OECD Guidelines for Testing of Chemicals (No. 476, 1997)3 试验目的该测试系统用于检测化妆品原料及其产品引起的突变，包括碱基对突变、移码突变和缺失等，从而评价受试物引起突变的可能性。
4 定义正向突变（Forward mutation）：从原型至突变子型的基因突变，这种突变可引起酶和功能蛋白的改变。
突变频率（Mutant frequency）：所观察到的突变细胞数与存活细胞数之比值。
5试验原理在加入和不加入代谢活化系统的条件下，使细胞暴露于受试物一定时间，然后将细胞再传代培养，突变细胞在含有6-硫代鸟嘌呤（6-thioguanine，6-TG）或三氟胸苷（trifluorothymidine，TFT）的选择性培养液中能继续分裂并形成集落。
基于突变集落数，计算突变频率以评价受试物的致突变性。
6 试验方法6.1 试剂和受试物制备6.1.1 受试物6.1.1.1 受试物的配制：固体受试物需溶解或悬浮于溶剂中，用前稀释至适合浓度；液体受试物可以直接加入试验系统/或用前稀释至适合浓度。
受试物应在使用前新鲜配制，否则就必须证实储存不影响其稳定性。
6.1.1.2 溶剂的选择：溶剂必须是非致突变物，不与受试物发生化学反应，不影响细胞存活和S9活性。
首选溶剂是水或水溶性溶剂。
二甲基亚砜（DMSO）也是常用溶剂，但使用时浓度不应大于0.5%。
6.1.1.3 受试物浓度设置6.1.1.3.1 最高浓度的选择：决定最高浓度的因素是细胞毒性、受试物在试验系统中的溶解度以及pH或渗克分子浓度（osmolality）的改变。
6.1.1.3.2 细胞毒性的确定：应使用指示细胞完整性和生长情况的指标，在活化系统存在或不存在两种条件下确定细胞毒性，例如相对集落形成率或相对细胞总生长情况（total growth）。
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九、体外哺乳动物细胞染色体畸变试验In Vitro Mammalian Cells Chromosome Aberration Test1 范围本规范规定了体外哺乳动物细胞染色体畸变试验的基本原则、要求和方法。
本规范适用于检测化妆品原料及其产品的致突变性。
2 规范性引用文件OECD Guidelines for Testing of Chemicals ( No.473, July 1997)3试验目的本试验是用于检测培养的哺乳动物细胞染色体畸变，以评价受试物致突变的可能性。
4 定义染色体型畸变(Chromosome-type aberration)：染色体结构损伤，表现为在两个染色单体相同位点均出现断裂或断裂重组的改变。
染色单体型畸变(Chromatid-type aberration)：染色体结构损伤，表现为染色单体断裂或染色单体断裂重组的损伤。
染色体数目改变(Numerical aberration)：所用细胞株的正常染色体数目的变化。
结构畸变(Structural aberration)：在细胞分裂的中期相阶段，用显微镜检出的染色体结构改变，表现为缺失、断片、互换等。
有丝分裂指数(Mitotic index)：中期相细胞数与所观察的细胞总数之比值；是一项反映细胞增殖程度的指标。
5 试验基本原则在加入和不加入代谢活化系统的条件下，使培养的哺乳动物细胞暴露于受试物中。
用中期分裂相阻断剂（如秋水仙素或秋水仙胺）处理，使细胞停止在中期分裂相，随后收获细胞，制片，染色，分析染色体畸变。
6 试验方法6.1 试剂和受试物制备6.1.1 阳性对照物：可根据受试物的性质和结构选择适宜的阳性对照物，阳性对照物应是已知的断裂剂，能引起可检出的、并可重复的阳性结果。
当外源性活化系统不存在时，可使用甲磺酸甲酯（methyl methanesulphonate (MMS)）、甲磺酸乙酯（ethyl methanesulphonate(EMS)）、乙基亚硝基脲(ethyl nitrosourea)、丝裂霉素C(mitomycin C)、4-硝基喹啉-N-氧化物（4-nitroquinoline-N-oxide）。
当外源性活化系统存在时，可使用苯并（a）芘[benzo(a)pyrene]、环磷酰胺(cyclophosphamide)。
6.1.2 阴性对照物：应设阴性对照，即仅含和受试物组相同的溶剂，不含受试物，其它处理和受试物组完全相同。
此外，如未能证实所选溶剂不具有致突变性，溶剂对照与本实验室空白对照背景资料有明显差异，还应设空白对照。
6.1.3 受试物6.1.3.1 受试物的配制：固体受试物需溶解或悬浮于溶剂中，用前稀释至适合浓度；液体受试物可以直接加入试验系统和/或用前稀释至适合浓度。
受试物应在使用前新鲜配制，否则就必须证实贮存不影响其稳定性。
6.1.3.2 溶剂的选择：溶剂必须是非致突变物，不与受试物发生化学反应，不影响细胞存活和S9活性。
首选溶剂是培养液（不含血清）或水。
二甲基亚砜（DMSO）也是常用溶剂，使用时浓度不应大于0.5%。
6.1.3.3 受试物浓度设置（1）最高浓度的选择：决定最高浓度的因素是细胞毒性、受试物在试验系统中的溶解度以及pH或渗克分子浓度(osmolality)的改变。
（2）细胞毒性的确定：应使用指示细胞完整性和生长情况的指标，在活化系统存在或不存在的两种条件下确定细胞毒性，例如细胞覆盖程度（degree of confluency）、存活细胞计数(viable cell counts)或有丝分裂指数(mitotic index)。
应在预试验中确定细胞毒性和溶解度。
（3）剂量设置：①至少应设置3个可供分析的浓度。
当有细胞毒性时，其浓度范围应包括从最大毒性至几乎无毒性；通常浓度间隔系数不大于2 ~10。
②在收获细胞时，最高浓度应能明显降低细胞覆盖程度、细胞计数或有丝分裂指数（均应大于50%）。
③对于那些相对无细胞毒性的化合物，最高浓度应是5μl/mL，5mg/mL或0.01mol/L。
④对于相对不溶解的物质，当浓度低于不溶解浓度时仍无毒性，则最高剂量应是，当处理期结束时，在最终培养液中溶解度限值以上的一个浓度。
在某些情况下（即仅当高于最低不溶解浓度时才发生细胞毒性），应使用一个以上可看见沉淀的浓度。
最好在试验处理开始和结束时均评价溶解度，因为由于细胞、S9等的存在，在试验系统内在暴露过程中溶解度可能变化。
不溶解性可用肉眼鉴别，但沉淀不能影响观察。
6.1.4培养液：采用MEM(Eagle)，并加入非必需氨基酸和抗菌素（青、链霉素，按100IU/mL），胎牛血清或小牛血清按10%加入。
也可选用其它合适的培养液。
6.1.5 活化系统通常使用的是S9混合物（S9 mix）。
S9是从经酶诱导剂（Aroclor 1254或苯巴比妥钠和β-萘黄酮联合使用）处理的啮齿动物肝脏获得的。
S9的制备同Ames试验。
S9的使用浓度为1%~10%（终浓度）。
S9 mix中所加辅助因子的量由各实验室自行决定，但需对S9mix的活性进行鉴定，必须能明显活化阳性对照物。
也可使用下述S90.125mlMgC12 （0.4 mol/L）0.02 mlKC1（1.65mol/L）0.02 ml葡萄糖-6-磷酸 1.791mg辅酶Ⅱ（氧化型，NADP） 3.0615mg用无血清MEM培养液补足至1mL.6.2 试验步骤6.2.1 细胞：使用中国地鼠卵巢（CHO）细胞株或中国地鼠肺（CHL）细胞株。
6.2.2 试验时，应同时设阳性对照物，阴性对照物和至少3个可供分析的受试物浓度组。
6.2.3 试验前一天，将一定数量的细胞接种于培养皿（瓶）中，放CO2培养箱内培养。
6.2.4 试验需在加入和不加入S9 mix的条件下进行。
试验时，吸去培养皿（瓶）中的培养液，加入一定浓度的受试物、S9 mix（不加S9 mix时，需用培养液补足）以及一定量不含血清的培养液，放培养箱中处理2h~6h。
结束后，吸去含受试物的培养液，用Hanks液洗细胞3次，加入含10%胎牛血清的培养液，放回培养箱，于24h内收获细胞。
于收获前2h~4h，加入细胞分裂中期阻断剂（如用秋水仙素，作用时间为4h，终浓度为1μg/mL）。
当受试物为原料时, 如果在上述加入和不加入S9 mix的条件下均获得阴性结果，则尚需补加另外的试验，即在不加S9 mix的条件下，使受试物与试验系统的接触时间延长至24h。
当难以得出明确结论时，应更换试验条件，如改变代谢活化条件、受试物与试验系统接触时间等重复试验。
6.2.5 收获细胞时，用0.25%胰蛋白酶溶液消化细胞，待细胞脱落后，加入含10%胎牛或小牛血清的培养液终止胰蛋白酶的作用，混匀，放入离心管以1000r/min~1200r/min的速度离心5min~7min，弃去上清液，加入0.075mol/L KC1溶液低渗处理，继而以新配制的甲醇和冰醋酸液（容积比为3:1）进行固定。
按常规制片，用姬姆萨染液染色。
6.2.6 作染色体分析时，对每一处理组选200个（阳性对照可选100个）分散良好的中期分裂相（染色体数为2n±2）进行染色体畸变分析。
在分析时应记录每一观察细胞的染色体数目，对于畸变细胞还应记录显微镜视野的坐标位置及畸变类型。
6.3 统计处理：对染色体畸变细胞率用X2检验，以评价受试物的致突变性。
6.4 结果评价：在下列两种情况下可判定受试物在本试验系统中具有致突变性：（1）受试物引起染色体结构畸变数的增加具有统计学意义，并有与剂量相关的增加。
（2）受试物在任何一个剂量条件下，引起具有统计学意义，并有可重复性的阳性反应。
在评价时应把生物学和统计学意义结合考虑。
7 试验报告试验报告应包括以下内容：（1）受试物名称、有关的理化性状、所用溶剂及其配制、剂量选择（应说明受试物对细胞毒性的测定方法、溶解情况等）;（2）细胞株名称;（3）实验条件和方法①代谢活化系统：制备S9时所用酶的诱导剂、选用的动物品种和来源、S9mix的配方；②对照物：阳性对照物名称和选用浓度；阴性（溶剂）对照物名称及使用浓度。
③培养液：所用培养液名称、血清类别和使用浓度；④接种时的细胞密度以及所用培养皿（瓶）的规格；⑤中期分裂阻断剂：名称、所用浓度、作用时间；⑥处理时间：受试物与试验系统的接触时间；⑦简述制片方法、分析的中期分裂相数目、结果评价方法。
（4）结果①受试物最高剂量的确定及试验结果：细胞毒性的测定（建议的表格见表1）；溶解情况（建议的表格见表2）；对pH和渗克分子（osmolality）浓度的影响（如果有影响）。
②各处理组和对照组染色体畸变率（建议的表格见表3）。
③本实验室的阳性对照组和阴性对照组（常用溶剂，如DMSO）在本实验室历史上的染色体畸变率范围、均值和标准差（说明样品数）。
（5）结论。
表1 受试物对细胞的毒性表2 受试物在所选溶剂中溶解情况记录表3 受试物的检测结果组别终浓度μg/mL观察细胞数畸变细胞数畸变率（%）+S9-S9+S9-S9+S9-S9阴性对照受试物阳性对照8 结果解释阳性结果表明受试物引起培养的哺乳动物体细胞染色体结构畸变。
阴性结果表明在本试验条件下，受试物不引起培养的哺乳动物体细胞染色体结构畸变。