石蜡切片及免疫荧光

一、石蜡切片

1. 固定：

将新鲜组织切成小块，固定于4%多聚甲醛过夜。凝固组织中的物质成分，尽可能保持其活体时的结构。同时能使组织硬化，有利于切片的进行。

2.脱水：

为了减少组织材料的急剧收缩，应使用从低浓度到高浓度递增的顺序进行经70%、85%、95%直至纯酒精（无水乙醇），每次时间为1小时。固定后的组织材料需除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀，否则会影响后期的染色效果。

3.透明：

常用的透明剂有二甲苯，二甲苯是石蜡的溶剂。纯酒精不能与石蜡相溶，还需用能与酒精和石蜡相溶的溶剂，替换出组织内的酒精。材料块在透明剂浸渍过程称透明。

4.浸蜡：

先把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍1小时。先后移入2个熔化的石蜡液中浸渍1小时左右。

5.包埋：

以少许热蜡液将其底部迅速贴附于包埋盒内上，然后置于速冻台，让石蜡固定。

6.切片：

切片刀的锐利与否、蜡块硬度是否适当都直接影响切片质量，可将蜡块至于冷水中改变蜡块硬度。通常切片厚度为3-5um，用毛笔轻托轻放在37度水浴中展片。

7.贴片与烤片：

一般使用恒温水浴锅，温度控制在37-40℃左右，有利于石蜡切片的展开，贴好的切片置于60℃恒温箱内干燥2小时，蛋白质凝固后即可染色。

8.切片脱蜡及水化：

干燥后的切片置于二甲苯中进行脱蜡，然后依次使用从高浓度到低浓度递减的顺序进行经纯酒精、95%、85%、70%进行水化。

9.染色：

经典的苏木精和伊红：细胞核被苏木精染成紫蓝色，多数细胞质及非细胞成分被伊红染成粉红色。实验操作简单。

免疫组化：指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应。

二、冰冻切片

1.取材：

应尽可能快地采取新鲜的材料，防止组织发生死后变化。

2.速冻：

1）将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内（直径约2cm）。

2）如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内。

3）当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮中，大约10-20s组织即迅速冰结成块。

4）在制成冻块后，即可置入恒冷箱切片机冰冻切片。

5）若需要保存，应快速以铝箔或塑料薄膜封包，立即置入-80℃冰箱贮存备用。

3.固定：

1）样品托上涂一层OCT包埋胶，将速冻组织置于其上，4℃冰箱预冷5-10min让OCT胶浸透组织。

2）取下组织置于锡箔或者玻片上，样品托速冻。

3）组织置于样品托上，其上再添一层OCT胶，以完全覆盖为宜，速冻架（PE）上30min。

4.切片：

1）恒温冰冻切片机为较理想的冰冻切片机，其基本结构是将切片机置于低温密闭室内，故切片时不受外界温度和环境影响，可连续切薄片至5-10μm。

2）切片时，低温室内温度以-15℃~ -20℃为宜，温度过低组织易破碎，抗卷板的位置及角度要适当，载玻片附贴组织切片，切勿上下移动。

5.免疫荧光染色：

1）冰冻切片室温晾干15min，可用含10%正常山羊血清的PBS室温封闭切片1小时（此步可不洗）。

2）滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液（抗体的量视组织大小而定，原则是可以均匀覆盖组织面，且保证整个过程中不会使组织干涸）。

3）将切片放在加了PBS的免疫组化湿盒，室温孵育2小时或4℃过夜。

4）第二天先将湿盒放到37℃回温1h，然后吸取片上的一抗进行回收，将切片插入到小染缸PBS冲洗。

5）滴加用PBS稀释好的二抗（避光）置于分子杂交箱中37℃孵育1小时。回收二抗，切片置于染缸内，PBS洗5min×3次。

6）滴加DAPI工作液染核，室温10-20min（工作浓度0.1%染色15min）。

7）回收DAPI，滴加5-10μl抗荧光衰减封片剂或中性树胶，用处理干净的盖玻片封片，即可到荧光显微镜或者共聚焦显微镜下观察拍照。

8）做好的切片放在切片盒内，置于4℃冰箱，可保存一周左右。

常见问题及解决方案

1.切片上卷且不能形成连续蜡带

原因：①切片刀不够锋利。②切片刀与蜡快的角度不当。③蜡块四周留蜡边太少。④石蜡硬度过大，黏度不够。

解决方法：①重新磨刀。②调整切片刀的角度。③可重新包埋或将蜡块四周熔化，再放入包埋框中补蜡，修理蜡块时组织块周围保留的石蜡以2mm左右为宜。④蜡块过硬可适当加些蜂蜡，或更换熔点较低的石蜡重新包埋。

2.切片弯曲且不能形成直带

原因：①蜡块上下或左右两边不平行。②蜡块与切片刀刀口不平行。

③组织块外形不整齐。④切片刀各处的锋利程度不一致。

解决方法：①将蜡块四边反复修平对称。②调节蜡块夹持器，使其与切片刀平行。③修整组织块时，注意修切整齐。④移动切片刀，更换刀口位置。

3.切片上出现裂纹

原因：①切片刀上有小缺口，或刀口不平整。②组织中可能含有较硬之物质，如固定液之结晶石灰质。③包埋时石蜡冻结太慢。

解决方法：①切片刀某处有缺口，可调换刀口部位或重新磨刀。刀口上缺口过多且不平整，可先将刀锋垂直在磨刀石上轻轻磨数次，然后按常规磨刀田。②组织中硬性物质太多，则不宜用。③纠正包埋时的缺点。一般待蜡块周围凝结一层，即可放入冷水中。

4.切片粘在切片刀不易取下

原因：切片时有静电作用，产生静电吸引，在冬季或气候干燥时常出现这种情况。

解决方法：可用加湿器。以增加空气中的水分，而减少静电作用。

5.切片厚薄不均

原因：①切片微动部分失灵，齿轮跳格。②蜡块太大，过硬，转动时刀刃受震动。

解决方法：①修理切片机失灵的部分，调整螺旋。加机油润滑零件，必要时需请专业技术人员调整切片机。②如蜡块过大，以后取材时注意取材的大小。蜡块组织过硬，可返回水中浸泡，再重新脱水和包埋。