高效液相色谱法测定维生素的研究
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在 我 国 现 行 的 《食 品 中 维 生 素 的 国 家 标 准 检 测 方 法》中 ＶＥ 的分析方法为 ＨＰＬＣ 法。该法现已成为各 国 ＶＥ 检测的首选分析方法， 可以对不同型的 ＶＥ 进 行测定。有的试样， 如蔬菜、水果类等低脂肪样品可免 去皂化，直接提取后进行测定。而其它试样经皂化后， 将其不可皂化的部分提取到有机溶剂中， 用 ＨＰＬＣ 法 测定。高效液相色谱法能够简便地分离和定量 α、β、 γ、δ型 ＶＥ ，具 有 准确 、分 辨率 高、被 测 物损 失 少 的 优 点。但当食物中的 β型或 γ型 ＶＥ 含量较少时，β型和 γ型 ＶＥ 的两峰重叠， 该重叠峰用 γ型 ＶＥ 进行定量 计算，在这种情况下会低估有效 ＶＥ 的含量。
谢和金等在测定酵母中麦角固醇含量时采用高 效液相色谱法， ＨＹＰｅｒｓｉｌＢＤＳＣ１８５ｕ 反相柱， 流动相为 甲醇： 水为 ９７： ３（体积比），紫外检测波长为 ２．８３ ｎｍ。 酵母样加碱乙醇（乙醇溶液中含 ２５％氢氧化钾）皂化、 提 取 、洗 涤 、蒸 干 、定 量 测 定 。 结 果 为 标 准 曲 线 范 围 ０．０２～０．８ ｍｇ／ｍｌ， 线性良好， 最 低限 量 为 ０．０１ ｍｇ／ｍｌ，回 收率为 ９６．０％～９８．０％。此方法操作简便、准确、可靠。 ２．１．３ ＶＥ 的测定
ＶＣ 是 人 体 易 缺 乏 而 在 营 养 上 又 必 需 的 维 生 素， 在 体 液 免 疫 和 细 胞 免 疫 中 均 有 重 要 作 用 。它 能 将 胆 固
Hale Waihona Puke Baidu
过氧化枯烯（ Ｃｕｍｅｎｅ ｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄｅ， ＣＨＰＯ） ， 这种过氧 化物能在细胞色素 Ｐ４５０ 介导的代谢中产生多种自由 基，并作为谷胱甘肽过氧化物酶的作用底物而使此酶 消耗， 导致细胞脂质过氧化损伤。有试验表明， 在高脂 膳 食 条 件 下 ＶＥ 可 以 提 高 对 冷 暴 露 红 细 胞 膜 Ｎａ、 Ｋ２ＡＰＴａｓｅ 活性。该酶活性的提高可能与体内脂质过 氧化水平下降有关。
ＶＥ 作为抗氧化剂在对抗心肌细胞脂质过氧化损 伤 中 起 着 重 要 作 用 。关 于 脂 质 过 氧 化 作 用 引 起 心 肌 细 胞 ＶＥ 含 量下 降 及膜 流 动性 降低 的 机理 尚 不清 楚，可 能 是 细 胞 中 含 有 能 产 生 多 种 自 由 基 的 引 发 剂— ——氢
机溶剂，如庚烷、乙烷、二氯甲烷等。此法对脂溶性维生 素的几何异构体分离十分有效。 ２．１．４ ＶＫ 的测定
维 生 素（ｖｉｔａｍｉｎ）是 维 持 人 体 正 常 物 质 代 谢 和 某 些 特殊生理功能不可缺少的低分子有机化合物，主要参
邵桃玉，江苏扬州大学动物科学与技术学院，２２５００９，江苏扬 州大学文汇东路 １８ 号动物科学与技术学院反刍动物营养组。
赵国琦（通讯作者）， 单位及通讯地址同第一作者。 收稿日期： ２００６－ ０７－ ０２
５６
邵桃玉等： 高效液相色谱法测定维生素的研究
检测技术
Ｂ 族维生素是水溶性维生素中重要的一类， 其中 多种是酶的辅基和酶的组成部分。当人体内缺乏 Ｂ 族 维生素时，便可导致多种疾病的产生，而机体自身又无 法合成这些化合物，必须通过食物链或添加维生素制 剂给予补充。随着人们对生活品质要求的提高，复合 维生素制剂及高档营养品的出现，同时测定食物中或 药物中 Ｂ 族维生素的含量引起人们的广泛关注。Ｂ 族 维生素的检测方法已有很多，如在我国食品卫生标准 分析方法中 ＶＢ１ 采用荧光法， 烟酸采用微 生 物法 ； 在 药典中 ＶＢ１、ＶＢ６、烟酰胺采用分光光度法，烟酸采用滴 定法； ＡＯＡＣ 方 法中 ＶＢ１ 采 用荧 光法，烟 酸 、烟 酰 胺 采 用比色法和自动测定法， ＶＢ６ 采用微生物法 和 生物 生 长测定法等。日本卫生试验法中 ＶＢ１ 采用荧光法和高 压 液 相 色 谱 法，烟 酸 、烟 酰 胺 采 用 柯 尼 希 反 应 定 量 和 微生物法，ＶＢ６ 采用微生物法。这些方法多数是针对某 个单一维生素的测定，而且耗费时间较长，有些还是半 定量的。近年来国内外学者对多种 Ｂ 族维生素的同 时测定进行了大量研究，出现了许多分析方法，其中以 高效液相色谱分析法较为突出。具体工作如下： ２．２．２．１ 药品中 Ｂ 族维生素的测定
ＶＡ 除了以往人们所知的对人体的视觉具有调节 功能外，近来发现其对人体的免疫功能也具有一定的 作用，在大鼠细胞免疫功能的试验中发现， ＶＡ 严重缺 乏 会 使 大 鼠 的 胸 腺 、脾 脏 明 显 萎 缩，轻 度 缺 乏 将 不 同 程度损害免疫器官， 进一步导致淋巴细胞 的 成熟 、活 化产生障碍。ＶＡ 对免疫功能的调节有很大一部分是 通过细胞因子网络来 实 现的，ＶＡ 是 Ｔ 细 胞 活化 的 重 要参与因子，ＶＡ 缺乏，Ｔ 细胞 活 化障 碍。临 床 上还 发 现， 亚临床型 ＶＡ 缺乏的儿童感染性疾病的发病率远 大于正常儿童。
与各种酶的组成，因其结构和理化性质不同，使其各具 特殊的生理功能。维生素种类很多，在化学结构上并 无共性，它们 可 分为 胺类（ＶＢ１）、醛 类（ＶＢ６）或 醇 类（ＶＡ）； 根据其物理性质可分为两大类， 即脂溶性维生素和水 溶性维生素。脂溶性维生素包括 ＶＡ（视黄醇）、ＶＤ（骨 化醇）、ＶＥ（生育酚）、ＶＫ（甲萘醌）和 β－ 胡萝卜素等。水 溶 性 维 生 素 包 括 Ｂ 族 维 生 素 （ＶＢ１、ＶＢ２、ＶＢ６、ＶＢ１２、ＰＰ 等 ）、ＶＣ、叶 酸 、泛 酸 和 生 物 素 等 。 ２．１ 脂溶性维生素的测定 ２．１．１ ＶＡ 的测定
《饲料工业》·２００７ 年第 ２８ 卷第 １８ 期
检测技术
高效液相色谱法测定维生素的研究
邵桃玉 赵国琦
１ 高效液相色谱的分析原理及特点 高效液相色谱的基本原理是将经过提纯的试样
用微量进样器注入加样系统，起动高压泵，试样被流动 相带入色谱柱内，在一定高压下，样品在色谱柱内的填 料（固定 相）与 流 动相 之 间经 过 无数 次的 交 换，并 按 物 质 在 两 者 之 间 的 分 配 系 数 、分 子 极 性 的 大 小 以 及 所 带 电荷数的多少等进行分离，通过检测器检测，根据峰高 或 峰 面 积 精 确 地 计 算 出 所 测 物 质 的 含 量 。高 效 液 相 色 谱 仪 器 设 备 复 杂 ，但 分 析 操 作 省 时 、省 力 、省 试 剂 ，还 具 有以下突出特点：
关于 食品 和 乳品 中 ＶＫ１ 的 测 定 方 法 在 国 家 标 准 中已经有规定，但较复杂，保留时间长（约 ５５ ｍｉｎ），样品 干扰峰分不开，检出限高（每 １００ ｇ 大于 １０ μｇ）。赵建 国等通过改进流动相和样品处理方法，确定了最佳的 流动相配比，缩短了分析时间（Ｒｔ＝１１ ｍｉｎ 左右），降低了 检出限， ＶＫ１ 的最小检出浓度 每 １００ ｇ 达 到 ０．２０ μｇ。 施杏芬等用高效液相色谱法测定饲料添加剂 ＶＫ３， 结 果 表 明， 其 重 复性 好， 变 异 系数 在 １．０％左 右 ， 对 标 准 品和不同样品进行相同处理后， 分别在高效液相色 谱仪和紫外分光光度仪上进行测定， 高效液相色谱 仪测得的回收率在 ９９．２９％～１００．４％之间， 比紫外法高 １％～２％。 ２．２ 水溶性维生素的测定 ２．２．１ ＶＣ 的测定
虽然反相 ＨＰＬＣ 法是 ＶＥ 的国标分析方法， 它包 括短链烷基（如 Ｃ８）反相系统和长链烷基（如 Ｃ１８）反相 系统， 但在同时分析其它维生素时， β型 ＶＥ 与 γ型
醇 转 化 为 胆 酸，具 有 降 低 血 胆 固 醇 浓 度 、减 缓 动 脉 粥 样 硬 化 的 作 用 。有 资 料 表 明 ，食 管 癌 、胃 癌 高 发 区 居 民 ＶＣ 摄入量不足，癌症的发病率与人群的 ＶＣ 摄入量呈 负相 关， 其 原 因可 能 与 ＶＣ 阻 断 体 内 Ｎ－ 亚 硝 基 化 合 物合成作用有关。在水果和蔬菜中含有较丰富的 ＶＣ， 它也是保健食品中常见的活性成分。测定 ＶＣ 的方法 主要有 ２，６－ 二氯靛酚钠盐滴定法、２，４－ 二硝基苯肼比 色法、荧光光度分析法等。由于 ＶＣ 具有 较强 的 还原 性， 在中性和碱性条件下不稳定，遇热容易破坏，上述 方 法 灵 敏 度 低 ，操 作 繁 琐 、费 时 ，测 定 值 往 往 偏 低 。而 高 效 液 相 色 谱 法 具 有 高 速 、高 效 、高 灵 敏 度 的 特 点 。雍 莉 等 采 用 ＨＰＬＣ 法 快 速 测 定 保 健 食 品 和 果 蔬 中 ＶＣ 含 量， 用 ５ ｇ／ｌ 草酸超声提取样品，以 ０．０１０ ｍｏｌ／ｌ ＮＨ４Ａｃ－ ＨＡｃ 缓冲溶液（ｐＨ 值为 ４．５）作流动相， 经 Ｃ１８ 色谱柱 分 离， 用 紫 外检 测 器 在 ２６２ ｎｍ 波 长 下 测 定 ＶＣ 的 吸 光度值，并与标准系列比较，测定结果线性范围为 ０．５０～ １ ０００ μｇ／ｍｌ，检出 限 为 ５０ ｎｇ／ｍｌ，样 品 的加 标回 收 率为 ８８．５７％～９９．１２％， 相对标准偏差为 １．３１％～２．８２％。此方 法灵敏度高，选择性好， 操作简便、快速，５ ｍｉｎ 即可完 成定量检测， 具有实用价值。 ２．２．２ Ｂ 族维生素的测定
③ 重复性好。此项技术对操作者技巧的依赖程 度小， 避免了常规化学分析中手工操作所带来的误 差。
④ 高效液相色谱柱可以多次使用而无需再生，改 变了经典液相色谱中薄板一次使用的浪费状况，大大 节约了财力。
⑤ 精确度高。由于它分辨率高，具有很高的选择 性，且自动化程度高； 又由于其方法先进，结果可靠，适 用范围广，故已受到人们的关注。 ２ 利用高效液相色谱测定维生素
① 分辨率高。由于高效液相色谱选用的载体（固 定相） 是直径仅为 １０ μｍ 和 ５ μｍ 的填料，组分在几十 甚至几百个大气压力下通过色谱柱， 不断地在流动相 与固定相之间交换，分辨率大大高于经典液相色谱。
② 分析速度快。一般的化学分析往往需要几小 时到十几小时，而高效液相色谱分析一般在十几分钟 到 几 十 分 钟 内 就 能 完 成 。以 往 测 定 维 生 素 常 用 的 化 学 方法，只能进行单独测定一种维生素，测试过程繁琐， 需配制多种化学试剂，费工又费时，而且灵敏度低，分 析的试样需求量大， 既不利于采集， 也不利于远途携 带，给工作带来诸多的不便。
２．１．２ ＶＤ 的测定 ＶＤ 在调节钙、磷代谢方面的作用已经明确，最近
其在抑制肿瘤方面的作用已引起人们的关注。１， ２５－ 二羟 基 ＶＤ３［１，２５（ＯＨ）２Ｄ３］对 一 些肿 瘤 细胞 的 生 长 和 化 学 致 癌 诱 发 的 动 物 皮 肤 、乳 腺 肿 瘤 有 抑 制 作 用，即 通 过作用于细胞膜， 使细胞内 Ｃａ２＋流入增多而发挥生物 学作用。
随 着 ＨＰＬＣ 法 在 食 品 分 析 中 的 应 用 ， 现 已 成 为 ＶＡ 主要的分析方法， 具有快速、准确、精密等优点。适 合 于 天 然 食 物 和 ＶＡ 强 化 剂 等 各 种 食 物 中 ＶＡ 的 测 定，特别是对于低含量的样品测定的精确度也较高，最 小的检出限为 ０．８ ｎｇ。ＶＡ 在食物中常以酯类形式存 在，用氢氧化钾－ 乙醇溶液加热皂化后， 可使其转化为 游离的 ＶＡ［由于 ＶＡ 容易被氧化， 因此， 在试样处理过 程中需加抗氧化剂（ＢＴＨ）保护］， 使用高效液相色谱仪 Ｃ１８ 反相柱， 并由紫外检验器定量测定。
５５
检测技术
邵桃玉等： 高效液相色谱法测定维生素的研究
卜素与其它成分分离。在 ４５０ ｎｍ 波长下进行 ＨＰＬＣ 分析检测，计算出各种类胡萝卜素的含量。本方法较 适合于羟基类胡萝卜素的分析测定，对氧合羟基类胡 萝 卜 素 的 分 离 、分 析 效 果 较 差 。
ＶＥ 不易分离。只有采用正相 ＨＰＬＣ 法才能很好地分 离 ＶＥ 的 ８ 种同分异构体。正相 ＨＰＬＣ 法也称为吸附 ＨＰＬＣ 法，其固定相为极性固定相，如硅胶、氧化铝以及 氨基、氰基等键合固定相。流动相为非极性或弱极性有
在类胡萝卜素的分 析中 ， ＨＰＬＣ 法是 较 纸层 析 法 更为灵敏的方法，可以分离测定 α－ 胡萝卜素、β－ 胡萝 卜素、γ－ 胡萝卜素、番茄红素和斑螯黄素等不同形式 的类胡萝卜素。ＨＰＬＣ 法是目前国外测定各种类胡萝 卜素的最常用方法， 但也是较昂贵和较复杂的方法。 ＨＰＬＣ 法的原理、适用范围、试样前处理及操作与纸层 析法相同， 只是浓缩定容后的试样不是经过纸层析， 而是进入 ＨＰＬＣ 的 Ｃ１８ 柱， 经 流 动相 洗脱 后 ， 用紫 外 分 光 光 度 计 检 测 。称 取 一 定 量 类 胡 萝 卜 素 配 制 成 标 准 液， 试样以丙酮－ 石油醚混合溶剂反复萃取， 使类胡萝
谢和金等在测定酵母中麦角固醇含量时采用高 效液相色谱法， ＨＹＰｅｒｓｉｌＢＤＳＣ１８５ｕ 反相柱， 流动相为 甲醇： 水为 ９７： ３（体积比），紫外检测波长为 ２．８３ ｎｍ。 酵母样加碱乙醇（乙醇溶液中含 ２５％氢氧化钾）皂化、 提 取 、洗 涤 、蒸 干 、定 量 测 定 。 结 果 为 标 准 曲 线 范 围 ０．０２～０．８ ｍｇ／ｍｌ， 线性良好， 最 低限 量 为 ０．０１ ｍｇ／ｍｌ，回 收率为 ９６．０％～９８．０％。此方法操作简便、准确、可靠。 ２．１．３ ＶＥ 的测定
ＶＣ 是 人 体 易 缺 乏 而 在 营 养 上 又 必 需 的 维 生 素， 在 体 液 免 疫 和 细 胞 免 疫 中 均 有 重 要 作 用 。它 能 将 胆 固
Hale Waihona Puke Baidu
过氧化枯烯（ Ｃｕｍｅｎｅ ｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄｅ， ＣＨＰＯ） ， 这种过氧 化物能在细胞色素 Ｐ４５０ 介导的代谢中产生多种自由 基，并作为谷胱甘肽过氧化物酶的作用底物而使此酶 消耗， 导致细胞脂质过氧化损伤。有试验表明， 在高脂 膳 食 条 件 下 ＶＥ 可 以 提 高 对 冷 暴 露 红 细 胞 膜 Ｎａ、 Ｋ２ＡＰＴａｓｅ 活性。该酶活性的提高可能与体内脂质过 氧化水平下降有关。
ＶＥ 作为抗氧化剂在对抗心肌细胞脂质过氧化损 伤 中 起 着 重 要 作 用 。关 于 脂 质 过 氧 化 作 用 引 起 心 肌 细 胞 ＶＥ 含 量下 降 及膜 流 动性 降低 的 机理 尚 不清 楚，可 能 是 细 胞 中 含 有 能 产 生 多 种 自 由 基 的 引 发 剂— ——氢
机溶剂，如庚烷、乙烷、二氯甲烷等。此法对脂溶性维生 素的几何异构体分离十分有效。 ２．１．４ ＶＫ 的测定
维 生 素（ｖｉｔａｍｉｎ）是 维 持 人 体 正 常 物 质 代 谢 和 某 些 特殊生理功能不可缺少的低分子有机化合物，主要参
邵桃玉，江苏扬州大学动物科学与技术学院，２２５００９，江苏扬 州大学文汇东路 １８ 号动物科学与技术学院反刍动物营养组。
赵国琦（通讯作者）， 单位及通讯地址同第一作者。 收稿日期： ２００６－ ０７－ ０２
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邵桃玉等： 高效液相色谱法测定维生素的研究
检测技术
Ｂ 族维生素是水溶性维生素中重要的一类， 其中 多种是酶的辅基和酶的组成部分。当人体内缺乏 Ｂ 族 维生素时，便可导致多种疾病的产生，而机体自身又无 法合成这些化合物，必须通过食物链或添加维生素制 剂给予补充。随着人们对生活品质要求的提高，复合 维生素制剂及高档营养品的出现，同时测定食物中或 药物中 Ｂ 族维生素的含量引起人们的广泛关注。Ｂ 族 维生素的检测方法已有很多，如在我国食品卫生标准 分析方法中 ＶＢ１ 采用荧光法， 烟酸采用微 生 物法 ； 在 药典中 ＶＢ１、ＶＢ６、烟酰胺采用分光光度法，烟酸采用滴 定法； ＡＯＡＣ 方 法中 ＶＢ１ 采 用荧 光法，烟 酸 、烟 酰 胺 采 用比色法和自动测定法， ＶＢ６ 采用微生物法 和 生物 生 长测定法等。日本卫生试验法中 ＶＢ１ 采用荧光法和高 压 液 相 色 谱 法，烟 酸 、烟 酰 胺 采 用 柯 尼 希 反 应 定 量 和 微生物法，ＶＢ６ 采用微生物法。这些方法多数是针对某 个单一维生素的测定，而且耗费时间较长，有些还是半 定量的。近年来国内外学者对多种 Ｂ 族维生素的同 时测定进行了大量研究，出现了许多分析方法，其中以 高效液相色谱分析法较为突出。具体工作如下： ２．２．２．１ 药品中 Ｂ 族维生素的测定
ＶＡ 除了以往人们所知的对人体的视觉具有调节 功能外，近来发现其对人体的免疫功能也具有一定的 作用，在大鼠细胞免疫功能的试验中发现， ＶＡ 严重缺 乏 会 使 大 鼠 的 胸 腺 、脾 脏 明 显 萎 缩，轻 度 缺 乏 将 不 同 程度损害免疫器官， 进一步导致淋巴细胞 的 成熟 、活 化产生障碍。ＶＡ 对免疫功能的调节有很大一部分是 通过细胞因子网络来 实 现的，ＶＡ 是 Ｔ 细 胞 活化 的 重 要参与因子，ＶＡ 缺乏，Ｔ 细胞 活 化障 碍。临 床 上还 发 现， 亚临床型 ＶＡ 缺乏的儿童感染性疾病的发病率远 大于正常儿童。
与各种酶的组成，因其结构和理化性质不同，使其各具 特殊的生理功能。维生素种类很多，在化学结构上并 无共性，它们 可 分为 胺类（ＶＢ１）、醛 类（ＶＢ６）或 醇 类（ＶＡ）； 根据其物理性质可分为两大类， 即脂溶性维生素和水 溶性维生素。脂溶性维生素包括 ＶＡ（视黄醇）、ＶＤ（骨 化醇）、ＶＥ（生育酚）、ＶＫ（甲萘醌）和 β－ 胡萝卜素等。水 溶 性 维 生 素 包 括 Ｂ 族 维 生 素 （ＶＢ１、ＶＢ２、ＶＢ６、ＶＢ１２、ＰＰ 等 ）、ＶＣ、叶 酸 、泛 酸 和 生 物 素 等 。 ２．１ 脂溶性维生素的测定 ２．１．１ ＶＡ 的测定
《饲料工业》·２００７ 年第 ２８ 卷第 １８ 期
检测技术
高效液相色谱法测定维生素的研究
邵桃玉 赵国琦
１ 高效液相色谱的分析原理及特点 高效液相色谱的基本原理是将经过提纯的试样
用微量进样器注入加样系统，起动高压泵，试样被流动 相带入色谱柱内，在一定高压下，样品在色谱柱内的填 料（固定 相）与 流 动相 之 间经 过 无数 次的 交 换，并 按 物 质 在 两 者 之 间 的 分 配 系 数 、分 子 极 性 的 大 小 以 及 所 带 电荷数的多少等进行分离，通过检测器检测，根据峰高 或 峰 面 积 精 确 地 计 算 出 所 测 物 质 的 含 量 。高 效 液 相 色 谱 仪 器 设 备 复 杂 ，但 分 析 操 作 省 时 、省 力 、省 试 剂 ，还 具 有以下突出特点：
关于 食品 和 乳品 中 ＶＫ１ 的 测 定 方 法 在 国 家 标 准 中已经有规定，但较复杂，保留时间长（约 ５５ ｍｉｎ），样品 干扰峰分不开，检出限高（每 １００ ｇ 大于 １０ μｇ）。赵建 国等通过改进流动相和样品处理方法，确定了最佳的 流动相配比，缩短了分析时间（Ｒｔ＝１１ ｍｉｎ 左右），降低了 检出限， ＶＫ１ 的最小检出浓度 每 １００ ｇ 达 到 ０．２０ μｇ。 施杏芬等用高效液相色谱法测定饲料添加剂 ＶＫ３， 结 果 表 明， 其 重 复性 好， 变 异 系数 在 １．０％左 右 ， 对 标 准 品和不同样品进行相同处理后， 分别在高效液相色 谱仪和紫外分光光度仪上进行测定， 高效液相色谱 仪测得的回收率在 ９９．２９％～１００．４％之间， 比紫外法高 １％～２％。 ２．２ 水溶性维生素的测定 ２．２．１ ＶＣ 的测定
虽然反相 ＨＰＬＣ 法是 ＶＥ 的国标分析方法， 它包 括短链烷基（如 Ｃ８）反相系统和长链烷基（如 Ｃ１８）反相 系统， 但在同时分析其它维生素时， β型 ＶＥ 与 γ型
醇 转 化 为 胆 酸，具 有 降 低 血 胆 固 醇 浓 度 、减 缓 动 脉 粥 样 硬 化 的 作 用 。有 资 料 表 明 ，食 管 癌 、胃 癌 高 发 区 居 民 ＶＣ 摄入量不足，癌症的发病率与人群的 ＶＣ 摄入量呈 负相 关， 其 原 因可 能 与 ＶＣ 阻 断 体 内 Ｎ－ 亚 硝 基 化 合 物合成作用有关。在水果和蔬菜中含有较丰富的 ＶＣ， 它也是保健食品中常见的活性成分。测定 ＶＣ 的方法 主要有 ２，６－ 二氯靛酚钠盐滴定法、２，４－ 二硝基苯肼比 色法、荧光光度分析法等。由于 ＶＣ 具有 较强 的 还原 性， 在中性和碱性条件下不稳定，遇热容易破坏，上述 方 法 灵 敏 度 低 ，操 作 繁 琐 、费 时 ，测 定 值 往 往 偏 低 。而 高 效 液 相 色 谱 法 具 有 高 速 、高 效 、高 灵 敏 度 的 特 点 。雍 莉 等 采 用 ＨＰＬＣ 法 快 速 测 定 保 健 食 品 和 果 蔬 中 ＶＣ 含 量， 用 ５ ｇ／ｌ 草酸超声提取样品，以 ０．０１０ ｍｏｌ／ｌ ＮＨ４Ａｃ－ ＨＡｃ 缓冲溶液（ｐＨ 值为 ４．５）作流动相， 经 Ｃ１８ 色谱柱 分 离， 用 紫 外检 测 器 在 ２６２ ｎｍ 波 长 下 测 定 ＶＣ 的 吸 光度值，并与标准系列比较，测定结果线性范围为 ０．５０～ １ ０００ μｇ／ｍｌ，检出 限 为 ５０ ｎｇ／ｍｌ，样 品 的加 标回 收 率为 ８８．５７％～９９．１２％， 相对标准偏差为 １．３１％～２．８２％。此方 法灵敏度高，选择性好， 操作简便、快速，５ ｍｉｎ 即可完 成定量检测， 具有实用价值。 ２．２．２ Ｂ 族维生素的测定
③ 重复性好。此项技术对操作者技巧的依赖程 度小， 避免了常规化学分析中手工操作所带来的误 差。
④ 高效液相色谱柱可以多次使用而无需再生，改 变了经典液相色谱中薄板一次使用的浪费状况，大大 节约了财力。
⑤ 精确度高。由于它分辨率高，具有很高的选择 性，且自动化程度高； 又由于其方法先进，结果可靠，适 用范围广，故已受到人们的关注。 ２ 利用高效液相色谱测定维生素
① 分辨率高。由于高效液相色谱选用的载体（固 定相） 是直径仅为 １０ μｍ 和 ５ μｍ 的填料，组分在几十 甚至几百个大气压力下通过色谱柱， 不断地在流动相 与固定相之间交换，分辨率大大高于经典液相色谱。
② 分析速度快。一般的化学分析往往需要几小 时到十几小时，而高效液相色谱分析一般在十几分钟 到 几 十 分 钟 内 就 能 完 成 。以 往 测 定 维 生 素 常 用 的 化 学 方法，只能进行单独测定一种维生素，测试过程繁琐， 需配制多种化学试剂，费工又费时，而且灵敏度低，分 析的试样需求量大， 既不利于采集， 也不利于远途携 带，给工作带来诸多的不便。
２．１．２ ＶＤ 的测定 ＶＤ 在调节钙、磷代谢方面的作用已经明确，最近
其在抑制肿瘤方面的作用已引起人们的关注。１， ２５－ 二羟 基 ＶＤ３［１，２５（ＯＨ）２Ｄ３］对 一 些肿 瘤 细胞 的 生 长 和 化 学 致 癌 诱 发 的 动 物 皮 肤 、乳 腺 肿 瘤 有 抑 制 作 用，即 通 过作用于细胞膜， 使细胞内 Ｃａ２＋流入增多而发挥生物 学作用。
随 着 ＨＰＬＣ 法 在 食 品 分 析 中 的 应 用 ， 现 已 成 为 ＶＡ 主要的分析方法， 具有快速、准确、精密等优点。适 合 于 天 然 食 物 和 ＶＡ 强 化 剂 等 各 种 食 物 中 ＶＡ 的 测 定，特别是对于低含量的样品测定的精确度也较高，最 小的检出限为 ０．８ ｎｇ。ＶＡ 在食物中常以酯类形式存 在，用氢氧化钾－ 乙醇溶液加热皂化后， 可使其转化为 游离的 ＶＡ［由于 ＶＡ 容易被氧化， 因此， 在试样处理过 程中需加抗氧化剂（ＢＴＨ）保护］， 使用高效液相色谱仪 Ｃ１８ 反相柱， 并由紫外检验器定量测定。
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检测技术
邵桃玉等： 高效液相色谱法测定维生素的研究
卜素与其它成分分离。在 ４５０ ｎｍ 波长下进行 ＨＰＬＣ 分析检测，计算出各种类胡萝卜素的含量。本方法较 适合于羟基类胡萝卜素的分析测定，对氧合羟基类胡 萝 卜 素 的 分 离 、分 析 效 果 较 差 。
ＶＥ 不易分离。只有采用正相 ＨＰＬＣ 法才能很好地分 离 ＶＥ 的 ８ 种同分异构体。正相 ＨＰＬＣ 法也称为吸附 ＨＰＬＣ 法，其固定相为极性固定相，如硅胶、氧化铝以及 氨基、氰基等键合固定相。流动相为非极性或弱极性有
在类胡萝卜素的分 析中 ， ＨＰＬＣ 法是 较 纸层 析 法 更为灵敏的方法，可以分离测定 α－ 胡萝卜素、β－ 胡萝 卜素、γ－ 胡萝卜素、番茄红素和斑螯黄素等不同形式 的类胡萝卜素。ＨＰＬＣ 法是目前国外测定各种类胡萝 卜素的最常用方法， 但也是较昂贵和较复杂的方法。 ＨＰＬＣ 法的原理、适用范围、试样前处理及操作与纸层 析法相同， 只是浓缩定容后的试样不是经过纸层析， 而是进入 ＨＰＬＣ 的 Ｃ１８ 柱， 经 流 动相 洗脱 后 ， 用紫 外 分 光 光 度 计 检 测 。称 取 一 定 量 类 胡 萝 卜 素 配 制 成 标 准 液， 试样以丙酮－ 石油醚混合溶剂反复萃取， 使类胡萝