小鼠胚胎冷冻方案

药品器材清单

PMSG 孕马血清促性腺激素

hCG 人绒毛膜促性腺激素

DPBS 杜氏磷酸缓冲液

M16 体外培养液

EG 乙二醇

蔗糖

塑料细管

1ml注射器

35mm培养皿若干

二氧化碳培养箱

小鼠胚胎的获取

控光（14h光照，10h黑暗）饲养1-2周后的4-6周龄小白雌鼠，腹腔注射10 IU/只PMSG，48h后腹腔注射10 IU/只hCG。注射hCG后（计时为0h）当晚与雄鼠（≥8周龄）合笼（雌：雄=2:1或1:1）。次日早晨检查阴道栓，见栓雌鼠于72-82h颈椎脱臼处死，采集桑椹胚。在DPBS中洗净后移入M16培养基，置于5 %CO2,95 %空气,相对湿度100 %的二氧化碳培养箱中待用。

小鼠胚胎的玻璃化冷冻

平衡液EG10，见附录溶液的配制。

玻璃化溶液EFS40 ，见附表2。或者EG40，亦见附录溶液的配制。

解冻稀释液用DPBS稀释而成的0. 5mol/L蔗糖溶液。

将室温调至25℃,经1～2小时将溶液及用具充分平衡后，用0. 25ml的塑料细管(Flance)

按顺序吸入解冻稀释液5cm———空气1㎝——1.5cm玻璃化溶液。

用吸管将胚胎移入平衡液平衡5分钟,而后导入细管内的玻璃化溶液中平衡30秒。这30秒接着吸入空气1cm——吸满解冻稀释液，封口后直接投入液氮中保存。

小鼠冷冻胚胎的解冻

将冻好保存于液氮中的细管,取出后直接投入25℃水中快速解冻。当解冻稀释液部分由乳白变为透明时取出,用吸水纸将细管水珠拭净,剪断细管两端的栓塞后,用含有解冻稀释液(0. 8ml)的注射器(带16号针头),将细管内容物冲洗于表面皿中，轻轻摇匀,置于实体显微镜下回收胚胎。回收的胚胎于解冻稀释液中平衡5分钟,以便脱出细胞内部乙二醇,再用PBS洗净后,移入M16溶液中于5 %CO2,95 %空气,相对湿度100 %的二氧化碳培养箱中培养。

小鼠胚胎的发育能力判定

体外培养回收的胚胎在M16中培养48小时以内恢复到囊胚或继续发育的胚胎视为有发育能力胚胎。

胚胎移植解冻后的胚胎,约经3小时培养,选择外形良好的胚胎移植于与结扎输精管的公鼠交配后即假妊娠第3天受体鼠的子宫中,一侧5～7枚,每只受体10～14枚胚胎为宜。妊娠19～22天观察产仔情况。