小鼠胚胎冷冻方案
小鼠精子胚胎冻存保种
小鼠精子胚胎冻存保种
将活体品系保存于液氮中，减低活体保种的费用、表型丢失、繁育能力下降等风险。
做到随用随取的快捷操作方式。
胚胎冻存
方法：将超排后的雌鼠与目的雄鼠进行交配，第二天取2细胞进行慢速冷冻，存放于液氮中。
优势：慢速冷冻的胚胎复苏后成活率高（80%以上），且移植后的大小鼠怀孕率及产仔率高。
缺点：操作难度高，需要高昂的程序冷冻仪，操作时间达到6个小时。
精子冻存
方法：将雄鼠处死取出精子通过快速冷冻保存于液氮中
优势：操作速度快，精子保存量大。
缺点：复苏时需要进行体外受精，且受精率低（一般为15%-25%）。
小鼠8细胞期胚胎超低温(一1960G)冷冻保存1)
（ １６ ） 一 ９０ 中的镊子夹安瓶瓶外壁，使瓶内液 Ｃ
体晶化，然后用我们自己设计的简单降温装置 以 ０ －０ ０／ ． ．Ｃ 分降温到 一 ８０ ２ ３ ０ Ｃ，随即浸人液
氮内保存。
在我国， 超低温冷冻保存家兔、 羊和牛早期 胚胎已经成功。曾有报道用两步法快速冷冻保 存小鼠早期胚胎并在解冻后经培养证明有一定 存活率， 但未得到出生小鼠。 本文报告超低温 冷冻保存的／鼠 ８ Ｊ ＼ 细胞期胚胎，在解冻并移植 给受体母鼠后出生有正常繁殖能力的小鼠。
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胚胎冷冻技术
人类胚胎冷冻的应用现状
到目前为止,超低温冷冻人的体外受精(IVF)胚 胎,在国内外均获得成功。 2004年,意大利学者应用ICSI对慢速冷冻卵母 细胞与冻融睾丸精子受精后再次冻存多余胚胎,解 冻胚胎移植后分娩一健康女婴,为世界首例。 北京大学第三医院生殖医学中心应用冷冻精 液中精子、冷冻卵母细胞、冷冻胚胎即“三冻” 技术,成功获得世界第2例、我国第1例“三冻”婴 儿。并在卵母细胞冷冻技术方而,采用了与世界首 例不同的简捷的玻璃化冷冻卵母细胞的方法。
另外,从理论上讲,冷冻胚胎可长期 保存,但对于保存过程中胚胎细胞是否 发生老化的问题还缺乏直接的实践证 据;对于冷冻效果鉴定,主要采用形态学 方法鉴定冻胚质量,对其移植后的发育 潜力无法判断。
• 在多种冷冻方法中,现较多采用慢速冷 冻、快速溶解方法,但是其他方法也有 其自身优点。因此,在实验中应综合考 虑多方面因素,根据具体的胚胎情况选 择恰当的方法。
胚胎冷冻技术
发展历史
• 胚胎冷冻保存的研究起始于20世纪50年代， 当时Smith用甘油坐防冻剂，保存兔胚胎获 得成功。
• 1971年Whittingham用慢速冷冻方法获得小 鼠胚胎的成功保存。 • 1978年willadsen建立了快速冷冻方法。 1984年Takeda等采用一步冷冻方法首次冷 冻小鼠胚胎获得成功。
临床应用
应充分重视高浓度玻璃化冷冻溶液对胚 胎的毒性作用,合理选择玻璃化冷冻溶液,严 格控制胚胎和玻璃化冷冻溶液接触的总时间。 目前较简单的玻璃化溶液的组成是25%甘油、 25%PROH或25%乙二醇。 玻璃化冷冻技术正处于实验研究到临 床应用的过渡阶段,随着玻璃化冷冻方法的 逐渐成熟,有望成为程序冷冻方法外的另一 种选择。
医疗应用
• 若有剩余的质量较好的胚胎，可以冷冻保存，待 以后自然周期或人工周期解冻后植入子宫腔内， 将增加受孕的机会。 • 可用于一个超排卵周期得到的胚胎数量多，质量 好，不能一次全部移植，可将多余的胚胎冷冻保 存。 • 以及发生严重卵巢过度刺激综合征的患者，不宜 在治疗周期移植胚胎者，可将胚胎冷冻，待以后 的自然周期或人工周期进行胚胎复苏移植。
NIH-3T3 细胞使用说明书
NIH-3T3细胞使用说明书细胞基本信息产品货号YC-A013细胞名称NIH-3T3中文名称小鼠胚胎成纤维细胞细胞形态上皮样，贴壁细胞传代比例1:3~1:5培养体系90%DMEM+10%FBS源井细胞培养未加双抗，客户可视实际情况选择添加。
冻存液体系50%DMEM+40%FBS+10%DMSO特殊备注无细胞接收1)冻存细胞：如果是干冰运输的冻存细胞，收到后请立即转入液氮储存或短暂（24H)放至-80℃冰箱保存，或直接进行细胞复苏。
2)活细胞：如果是T25瓶活细胞运输，收到后用75%的酒精对T25瓶外表面进行消毒，之后放在5%CO2、37℃的细胞培养箱静置2h，静置后取出细胞瓶在显微镜下观察细胞贴壁情况和细胞汇合度，分别在200X和40X下各拍2个不同视野的细胞拍照记录。
如果汇合度达到80%以上的传代密度，可以进行传代操作，如果细胞汇合度没有达80%以上不够传代，可以将细胞瓶内的培养基吸出在50ml离心管中并标记该细胞专用培养基后备用，保留8-10ml继续培养至可传代。
注意：收到细胞后，活细胞首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否漏液、浑浊等现象。
冻存细胞若发现干冰已挥发完、冻存管瓶盖脱落、破损等异常情况，请务必拍照保留，并于收货24h内与我们联系（电话：400-688-9033；https://）。
细胞复苏1)准备工作：将完全培养液置37℃水浴锅预热30分钟，随后将冻存的细胞从液氮中取出，转移到-80℃冰箱，放置数分钟让残余液氮挥发；2)在超净台内用吸管吸取6-7mL完全培养液至15mL离心管中；3)将细胞从-80℃冰箱取出暂时放置于干冰里，复苏时稍稍甩动，去除残留的干冰和液氮，再迅速用镊子夹住盖子放入37℃水浴中快速晃动（注意：水不能没过盖子），使其在1分钟左右完全融化；4)在超净台内，用酒精棉球擦拭冻存管外壁消毒，稍稍晾干。
用单道移液器将所有融化的细胞悬液转至提前准备好的完全培养液中，盖上盖子，1100rpm室温离心4分钟收集细胞；5)超净台内小心吸弃上清，用单道移液器吸取1mL新鲜完全培养液重悬细胞至单细胞悬液，再转移至装有4mL完全培养液的T25cm2培养瓶中，写上细胞名称、复苏日期、代次，放置37℃、5%CO2饱和湿度培养箱内培养。
不同载体冷冻小鼠胚胎的效果比较
不同载体冷冻小鼠胚胎的效果比较邵明清1，邵南齐2（1.临汾市第四人民医院，山西 临汾041000 ；2.郑州澍青医学院，河南 郑州450064 ） 近年来，玻璃化冷冻技术的飞速发展和广泛应用，已成为辅助生殖技术领域的焦点[1]。
玻璃化冷冻利用含高浓度防冻剂的冷冻液，通过急速降温，使细胞内外的成分同时玻璃化而避免了冰晶的形成，大大提高了冻融后细胞的存活率[2]。
影响胚胎冻存效果的关键因素是冷冻液的成分及冷冻载体.由于在冷冻液成分方面已经有很多学者做了大量研究，目前已有商品化的冷冻解冻液套装，由于各个实验室的条件不同，解冻后复苏率及囊胚率的结果相差很大。
冷冻载体有很多种，现在国内大多数生殖中心应用冷冻帽(Cryotop)、冷冻叶片(Cryoleaf)和冷冻环(Cryoloop )等玻璃化冷冻载体[3]。
本研究以昆明小鼠为研究对象，应用Cryoleaf、Cryotop 和自制半麦管（hemi-straw）冷冻载体开展胚胎玻璃化冷冻研究，旨在分析载体对冷冻效果的影响，进而为人类胚胎玻璃化冷冻技术的改进提供相关依据。
1 材料1.1 实验动物 昆明小白鼠购自郑州大学实验动物中心。
雌性小鼠 6～8 周龄，30只；雄性小鼠 10～12 周龄，15只。
适应性饲养1周，排除应激反应。
1.2 药物与试剂 孕马血清(PMSG)，宁波第二激素厂生产；人绒毛膜促性腺激素(HCG)，南京动物激素厂生产；培养液（受精液FM,卵裂液CM,囊胚培养液BM）及矿物油由COOK 公司生产；冷冻复苏液、血清白蛋白代用品（HSA）由COOK 公司生产。
摘 要：为了比较冷冻叶片（Cryoleaf）、冷冻帽（Cryotop）、自制半麦管（hemi-straw）三种冷冻载体的冻存效果，试验采用玻璃化冷冻方法冻存昆明小鼠8-cell 胚胎。
结果表明，Cryoleaf 组、Cryotop 组和hemi-straw 组胚胎复苏率分别为 92.3％、89.2％和 86.2％，三组比较差异不显著(P>0.05)。
胚胎冷冻技术应用于抗菌肽转基因小鼠的保种传代
１７ ９ ２年 ， ｉｉ ｈｍ等 …发 明 了 胚 胎 冷 冻保 存 Ｗｈ ｔ ｇａ ｔｎ
的慢 速冷 冻法 ， 并用该 方 法成 功地保 存 了小 鼠胚胎 ，
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【 键 词 ｌ 小 鼠 ；超 排 卵 ；胚 胎 冷 冻 ；胚 胎 移 植 关 【 图 分 类 号 】Ｒ３ 中 。３ 【 献标 识 码 】Ａ 文 【 文章 编 号 】１７—８６ ２０ ）８０８．３ ６ １ ５ 《０７０ —４４０ ７
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小鼠胚胎冷冻保存条件研究
小鼠胚胎冷冻保存条件研究张立苹;曹辉;刘西梅;毕延震;肖红卫;李莉;华再东;华文君【期刊名称】《湖北农业科学》【年(卷),期】2014(53)20【摘要】为探索在实验室条件下最佳的小鼠胚胎冷冻保存条件.对不同发育阶段小鼠胚胎按照同一个冷冻程序进行冷冻;两个不同的冷冻程序对同一个发育阶段的小鼠胚胎进行冷冻.结果表明,-7℃平衡10 min,然后以0.3℃/min的速率迅速降至-35℃,-35℃平衡5min后投入液氮中,此冷冻程序比较适合小鼠胚胎冷冻;冷冻保存对16细胞以上的小鼠胚胎影响较小.【总页数】3页(P4915-4916,4930)【作者】张立苹;曹辉;刘西梅;毕延震;肖红卫;李莉;华再东;华文君【作者单位】湖北省农业科学院畜牧兽医研究所/湖北省胚胎工程与分子育种重点实验室,武汉430064;普莱柯生物工程股份有限公司,河南洛阳471000;湖北省农业科学院畜牧兽医研究所/湖北省胚胎工程与分子育种重点实验室,武汉430064;湖北省农业科学院畜牧兽医研究所/湖北省胚胎工程与分子育种重点实验室,武汉430064;湖北省农业科学院畜牧兽医研究所/湖北省胚胎工程与分子育种重点实验室,武汉430064;湖北省农业科学院畜牧兽医研究所/湖北省胚胎工程与分子育种重点实验室,武汉430064;湖北省农业科学院畜牧兽医研究所/湖北省胚胎工程与分子育种重点实验室,武汉430064;湖北省农业科学院畜牧兽医研究所/湖北省胚胎工程与分子育种重点实验室,武汉430064【正文语种】中文【中图分类】Q954.4【相关文献】1.小鼠和猪胚胎冷冻保存技术的研究进展 [J], 庄丽伟;许厚强;陈祥2.小鼠胚胎冷冻和重复冷冻的研究 [J], 冯勋伟;王新庄;李义书;王轶敏;牛晖3.C57-ras癌症转基因小鼠模型胚胎冷冻保种技术研究 [J], 左琴;刘甦苏;周舒雅;刘佐民;王金恒;范昌发4.FVB和EIIa-Cre小鼠胚胎冷冻保存研究 [J], 丁贤明;王芊芊;刘璐;陈瑜;傅军5.小鼠胚胎冷冻后线粒体损伤的研究 [J], 邓凯伟;王峰;王志刚;刘丑生;孟飞因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
OPS法对小鼠胚胎冷冻保存的研究的开题报告
OPS法对小鼠胚胎冷冻保存的研究的开题报告【题目】OPS法对小鼠胚胎冷冻保存的研究【摘要】随着科技的发展，胚胎冷冻保存已经成为了人类不孕不育治疗中的重要手段。
OPS（open pulled straw）法是一种新兴的胚胎冷冻保存法，其具有保存胚胎质量高、操作简便等优点。
本研究旨在探究OPS法对小鼠胚胎质量的影响以及最佳冻存条件的确定，为冷冻保存胚胎提供有力的理论基础。
【关键词】OPS法；小鼠胚胎；冷冻保存；胚胎质量【研究背景】胚胎冷冻保存作为一种广泛应用的技术，已经成为了不孕不育患者治疗的重要手段之一。
目前，冷冻保存胚胎主要采用液氮罐保存法和干燥保存法等方法，但这些方法具有一定的缺点，如质量波动大、操作繁琐等。
OPS法是一种新兴的冷冻保存方法，其具有操作简便、胚胎质量高等优点，在冷冻保存领域受到了广泛的关注。
【研究目的】本研究旨在探究OPS法对小鼠胚胎冷冻保存的影响，确定最佳冻存条件，为进一步开展该技术在实际操作中的应用提供参考。
【研究内容】1. 收集小鼠胚胎样本进行实验；2. 对小鼠胚胎进行OPS法冷冻保存；3. 对冻存小鼠胚胎进行质量评估；4. 分析OPS法对冻存小鼠胚胎质量的影响；5. 确定最佳冻存条件。
【研究方法】1. 采集小鼠胚胎样本，分为实验组和对照组，实验组采用OPS法进行冷冻保存，对照组采用传统的液氮罐保存法；2. 对冷冻后的小鼠胚胎进行质量评估，包括细胞活力、胚胎发育能力等指标；3. 对实验组和对照组的评估结果进行对比分析；4. 根据实验数据确定最佳冻存条件。
【预期结果】1. OPS法对小鼠胚胎的质量影响；2. 确定最佳冻存条件，为胚胎冷冻保存提供参考；3. 探究OPS法的应用前景及发展方向。
【研究意义】本研究旨在探究OPS法在小鼠胚胎冷冻保存中的应用，为其在临床实践中的推广提供理论支持。
通过研究可以为胚胎冷冻保存提供一种新的解决方案，提高其质量和成功率，有助于解决不孕不育患者的问题，对促进人类健康产生积极的社会效益。
不同冷冻方法对小鼠卵母细胞冻存的影响
不同冷冻方法对小鼠卵母细胞冻存的影响李娜;姚军【期刊名称】《长治医学院学报》【年(卷),期】2015(000)001【摘要】Objective:To explore the effects of different freezing methods on mouse oocyte survival rate and growth potential. Methods:Using vitrification technology,choose open carrier with enclosed carrier were cryopreserved with mouse cumulus-oocyte complex with cumulus cells (COC)or without cumulus cells (OD),after recovery,for in vitro fertilization and embryo culture.Results:The open carrier cryopreserved live egg number group 76.79%,slightly higher than the 72.98% enclosed carrier cryopreserved had no statistical significance(P >0.05);In two group of the COC group was significantly higher than that of DO group,the survival rate of eggs,statistically significant(P <0.05).The COC group of fertilization rate,blastocyst rate slightly higher than the DO,no statistical difference (P >0.05).Conclusion:(1)the enclosed carrier effectively avoids the potential pollution problems,but different carrier on eggs survival rate had no significant effect.(2)cumulus-cells in the vitrification freezing oocytes play a protective role,and for late-stage embryonic development has certain improvement.%目的：：探讨不同冷冻方法对小鼠卵母细胞存活率及其发育潜能的影响。
不同冷冻保护剂和冷冻方法对小鼠胚胎发育的影响
Ｅｆｅ ｔ ｆｄ ｆｅ ｅ ｒ ｏ ｒ ｔ ｃａ ｓ ｎ ｃ ｙ ｐ ｅ ｅ ｖ ｔｏ ｐｒ ｔ ｃ ｌ ｎ ｔ ｅ ｄｅ ｅｏ ｆ ｃ ｓ ｏ ｉ ｒ ｎｔｃ ｙ ｐ ｏ ｅ ｔ ｎｔ ａ ｄ ｒ ｏ ｒ ｓ ｒ ａ ｉ ｎ ｏ ｏ ｏ ｓ ｏ ｈ ｖ ｌ ｐｍｅ ｔｏ ｎ ｆ
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以Ｅ Ｇ为冷冻保护剂的胚胎 成活率 、 囊胚 形成率 、 囊胚 孵 出率 显著 高于以 Ｐ Ｏ Ｄ Ｓ 、 Ｒ Ｈ、 Ｍ Ｏ Ｇ为冷 冻保护 剂 的结果 （ ＜ Ｐ
００ ） 而 以 Ｐ Ｏ Ｄ Ｏ、 为 冷 冻 保 护 剂 的 结果 比较 差 异 无 显 著性 意 义 （ ＞ ０ ０ ） 结 论 ．５ 。 Ｒ Ｈ、 ＭＳ Ｇ Ｐ ．５ 。 Ｐ Ｏ 是 慢 速 冷 冻 小 鼠 ＲＨ
小鼠桑椹胚和早期囊胚玻璃化冷冻保存技术的研究的开题报告
小鼠桑椹胚和早期囊胚玻璃化冷冻保存技术的研究
的开题报告
1.研究背景：
小鼠是重要的实验动物，其胚胎能够为各种生殖和发育学研究提供
基础材料。
目前，小鼠早期胚胎玻璃化冷冻保存技术已经得到广泛应用。
但是，对于小鼠桑椹胚和早期囊胚的玻璃化冷冻保存技术还存在一定的
难度和不确定性。
因此，本研究拟探讨小鼠桑椹胚和早期囊胚的玻璃化
冷冻保存技术，为相关领域的研究提供参考。
2.研究目的：
(1)建立小鼠桑椹胚和早期囊胚的玻璃化冷冻保存技术；
(2)探讨不同冷冻溶液对小鼠桑椹胚和早期囊胚玻璃化冷冻保存后的
恢复能力和发育能力的影响；
(3)优化小鼠桑椹胚和早期囊胚玻璃化冷冻保存技术。
3.研究方法：
(1)收集小鼠桑椹胚和早期囊胚样本，根据个体差异和发育阶段的不
同进行分类；
(2)选取适当的冷冻溶液，包括不同浓度的乙二醇、甘油、胆碱等，
对样本进行玻璃化冷冻保存处理；
(3)将冷冻保存后的样本进行复苏和培养，观察其复苏率、发育情况
等指标，比较各组不同冷冻溶液的效果，并寻找最佳的冷冻保护体系；
(4)对优化后的小鼠桑椹胚和早期囊胚玻璃化冷冻保存技术进行验证。
4.研究意义：
(1)建立小鼠桑椹胚和早期囊胚玻璃化冷冻保存技术，为相关领域的研究提供参考；
(2)探讨不同冷冻溶液对小鼠桑椹胚和早期囊胚玻璃化冷冻保存后的恢复能力和发育能力的影响，为优化小鼠胚胎玻璃化冷冻保存技术提供理论依据；
(3)优化小鼠胚胎玻璃化冷冻保存技术，有望解决小鼠胚胎玻璃化冷冻保存存在的问题，提高其保存质量和数量，为相关领域的研究提供更好的资源保障。
(TMMC) 小鼠胚胎冷冻保存和解冻服务使用规范
A4-5小鼠胚胎冷凍保存和解凍服務使用規範基因轉殖小鼠模型核心設施(TMMC)小鼠胚胎冷凍保存和解凍服務使用規範94年度(2006.3.1)基因轉殖鼠核心設施使用者委員會第3次會議通過97年度(2009.3.18)基因轉殖鼠核心設施使用者委員會第9次會議修訂1.使用者欲申請本項服務時必須符合下列各項規定：a.須經本核心認可動物之情況適合作胚胎低溫保存。
b.5隻繁殖力強之2 ~ 4個月齡公鼠。
c.20隻4 ~ 8週齡母鼠。
d.使用者需詳述小鼠品系特性(屬名、基因型、表現型)，且證實沒有Mycoplasma spp.和Lymphocytic Choriomeningitis 病毒感染。
2.若小鼠品系具有與生殖異常相關之表現型，導致不易懷孕或新生兒不易存活時，必須事先知會本核心。
3.若有不可預期之狀況導致胚胎數過低，本核心將通知使用者並要求提供更多數量之小鼠以便保存足夠的胚胎。
4.本核心收費是以將負責保存200個胚胎為基準，冷凍裝置為一般液態氮桶，於保存半年後交付申請人。
5.若需解凍服務，本核心將提供至少四隻小鼠。
6.使用者須了解冷凍及解凍的成功率視不同的品系而有所差異，付費乃依完成200個冷凍胚胎為基準；日後復育小鼠以提供至少四隻小鼠為原則。
7.胚胎保存超過一年以上，需額外負擔液態氮費用 ( 1,500元／第一年以後每年)。
8.使用者送件前需填寫本核心網站提供之小鼠胚胎冷凍保存和解凍服務申請書及同意書並簽名繳交。
本核心於收件時將與使用者共同填寫使用同意證明單（四聯單），使用者憑此四聯單繳費。
9.每項胚胎低溫保存小鼠胚胎服務價格學術單位：NT＄20,000元非學術單位：NT ﹩40,000元。
小鼠胚胎快速冷冻的研究
小鼠胚胎快速冷冻的研究
张嘉保;赵志辉;周虚;关宏;于仙忠;梁冠生;刘健
【期刊名称】《黑龙江动物繁殖》
【年(卷),期】1998(6)2
【摘要】本文研究了小鼠胚胎快速冷冻方法，以ＰＢＳ＋２．０Ｍ甘油＋０．５Ｍ蔗糖为冷冻液，以ＰＢＳ＋０．５Ｍ蔗糖为稀释液。
结果桑椹胚冷冻解冻后的存活率为６９．３％，早期囊胚冷冻解冻后的存活率为６０．４％，二者之间无显著差异（Ｐ＞０．０５）。
【总页数】2页(P8-9)
【关键词】动物;胚胎;快速冷冻
【作者】张嘉保;赵志辉;周虚;关宏;于仙忠;梁冠生;刘健
【作者单位】中国人民解放军农牧大学畜牧水产系
【正文语种】中文
【中图分类】S814.6
【相关文献】
1.牛胚胎直接投入液氮快速冷冻技术的研究 [J], 田金如;邓瑞广
2.人类胚胎超快速冷冻保存的初步研究 [J], 林戈;陆长富;龚斐;肖红梅;周虹;卢光
3.小鼠体外受精、胚胎培养及胚胎快速冷冻的研究 [J], 张嘉保;任文陟;宋德光;徐勇;母连志;高晓伟
4.牛胚胎快速冷冻技术的研究 [J], 徐坤
5.小鼠胚胎快速冷冻方法的研究 [J], 刘云海;朱志庆;罗应荣;朱成宽
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小鼠esc培养方案
小鼠esc培养方案一、细胞来源与获取小鼠胚胎干细胞（ESC）可来源于受精后3.5\~5.5天的胚胎，这些胚胎可通过显微操作技术从囊胚中剥离。
剥离的胚胎干细胞需要在含有血清和饲养层细胞的培养基中进行培养。
二、培养基选择与配制培养基是小鼠胚胎干细胞（ESC）生长的必要条件，常用的培养基包括Glasgow MEM、Ham F12、ES Cell Medium等。
在配制培养基时，需要添加适量的血清（一般为胎牛血清）和抗生素等成分，以维持细胞的生长和繁殖。
三、饲养层细胞准备饲养层细胞可以为胚胎干细胞提供必要的生长因子和细胞因子，常用的饲养层细胞包括STO、STO-derived fibroblasts等。
在准备饲养层细胞时，需要将细胞接种在消毒后的培养皿或培养瓶中，待细胞生长至适宜密度后，再进行后续操作。
四、细胞接种与培养将剥离的胚胎干细胞接种在饲养层细胞上，通常情况下，接种密度为1\~5万个/cm²。
在培养过程中，需要保持适宜的温度和湿度，并定期更换培养基，以维持细胞的生长状态。
一般情况下，小鼠胚胎干细胞（ESC）会在接种后2\~3天开始贴壁生长。
五、细胞传代与扩增当小鼠胚胎干细胞（ESC）生长至适宜密度时，需要进行传代和扩增。
通常情况下，传代时的细胞密度为1\~2万个/cm²。
在传代过程中，需要将细胞从培养皿或培养瓶中吹散，并接种到新的培养皿或培养瓶中。
扩增过程需要定期更换培养基，并保持适宜的温度和湿度。
六、细胞冻存与复苏为了长期保存小鼠胚胎干细胞（ESC），需要进行细胞冻存。
将处于对数生长期的细胞进行离心和清洗后，加入适量的冷冻保护剂（一般为二甲基亚砜），然后放入液氮中进行保存。
在需要使用时，将冻存的细胞取出，进行复苏。
胚胎冷冻保存技术资料
1972年，Whittingham等首次用慢速冷冻法成功保存小鼠胚胎。
1977年，Whittingham再次报道了冷冻、解冻小鼠卵母细胞得到活仔。
1977年Willadsen进行了改良，建立了快速冷冻法。
1985年Rail和Fahy建立了玻璃化冷冻法。
目前，胚胎及卵母细胞的冷冻保存技术研究集中于寻求效果更佳的保护剂和简化冷冻和解冻程序方面。
胚胎冷冻的关键是减少细胞内冰晶形成对胚胎的损伤。
对于胚胎的冷冻和解冻，一50~-15℃是一个致死温度区。
在这个温度区细胞容易形成大的冰晶。
加入抗冻保护剂能避免冰晶的形成。
细胞的冷冻保存并不在于能否长期耐受低温，而是在于冷冻和解冻时对细胞的致死性作用（致死性温区-50~-15℃）胚胎冷冻的受损机制在冷冻过程中，冰晶首先在细胞外液中形成，此时冰晶与溶质分离，使细胞外液浓度升高、渗透压增加，细胞内水分渗出产生溶液效应。
随着温度继续下降，细胞外冰晶不断形成，未冻结部分的溶液浓度增加，细胞内外的渗透压差增大。
这时可能发生两种情况：（1）当降温速度很慢时，胞质内更多的水分有足够的时间渗出，水分在细胞外冻结，随着细胞外冰晶的形成，细胞内外形成了较高的渗透压差，使细胞内水分逐渐减少，细胞内电解质浓度增高，导致细胞膜蛋白复合体的破坏和膜的分解。
（2）当降温速度很快时，胞质内水分形成的冰晶使细胞受到物理性的损伤。
这个因素影响是胚胎及卵母细胞冷冻保存的关键。
在-5~-15℃细胞内液处于超冷冻状态时，如果细胞尚未充分脱水，一旦结冰，冰晶就会迅速聚集，释放潜热引起温度瞬间剧增，造成过冷损伤。
冷冻的卵母细胞或胚胎解冻后可见到透明带破裂，这主要是由于物质的膨胀率和收缩率不同，这种现象被称作破裂损伤。
卵母细胞或胚胎在冷冻液中平衡或脱出冷冻保护剂时，由于渗透压的急剧变化而引起细胞过度膨胀或收缩使细胞受到损伤。
冷冻还能损伤细胞整体，阻碍极体产生，增加DNA的不稳定性而导致染色体异常。
渗透型属于细胞内冷冻保护剂，一般小分子物质，在0℃以上很容易通过细胞膜进入细胞质。
小鼠胚胎操作手册第三章
小鼠胚胎操作手册第三章第三章小鼠胚胎操作手册第一节注射操作在小鼠胚胎培养和研究中，注射是一项关键操作。
正确的注射技术可以确保研究的准确性和成功率。
本节将介绍小鼠胚胎注射的步骤和技巧。
1. 准备工作在进行注射前，确保实验室环境整洁，并准备好所需的实验材料。
这些材料包括显微镜、注射器、胚胎培养培养皿、胚胎移植工具等。
2. 胚胎准备将小鼠产下的胚胎收集到含有去离子水的培养皿中。
使用显微镜观察胚胎的形态和发育情况，并选择符合实验需求的胚胎进行注射。
3. 注射剂准备根据实验需求制备相应的注射剂。
注射剂可以是基因编辑工具，如CRISPR/Cas9系统，也可以是药物或其他化合物。
确保注射剂的浓度和质量符合实验要求。
4. 注射操作将胚胎取出，并放置在培养盐水中以保持湿润。
使用显微镜和细注射器将注射剂缓慢注入胚胎内。
注射时要注意避免损伤胚胎，注入的剂量要准确控制。
5. 胚胎移植完成注射后，将胚胎移植回培养皿中，并放入孵化箱或恒温箱中进行进一步的培养。
确保温度、湿度和氧气供应的稳定。
第二节胚胎培养和观察胚胎培养和观察是小鼠胚胎实验研究中的核心步骤。
本节将介绍胚胎的培养条件和观察方法。
1. 培养条件将注射后的胚胎放置在含有培养基的培养皿中。
培养基应包含足够的养分和生长因子，以满足胚胎的发育需求。
培养皿要保持无菌，并放置在恒温箱中维持稳定的温度。
2. 观察方法使用显微镜观察胚胎的发育情况，并记录下重要的观察结果。
观察胚胎的细胞分裂情况、胚胎囊胚的形成和融合等发育进程。
记录这些数据对于后续的实验分析非常重要。
3. 胚胎存储如果需要长期保存胚胎，可以使用液氮冷冻保存的方法。
在胚胎培养过程中，将胚胎收集到冷冻培养基中，然后放入液氮中冷冻保存。
这样可以保持胚胎的完整性和生理活性。
第三节数据分析和结果解读在小鼠胚胎操作过程中，数据分析和结果解读是至关重要的。
本节将介绍常用的数据分析方法和结果解读的注意事项。
1. 数据分析方法对于进行注射和观察的胚胎数据，可以使用统计学方法进行分析。
小鼠胚胎冷冻保存条件探究
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关键词院小鼠曰胚胎曰冷冻保存
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小鼠胚胎常规冷冻和玻璃化冷冻效果的比较
小鼠胚胎常规冷冻和玻璃化冷冻效果的比较
吕文发;王军;李喜春;王春强;王恒
【期刊名称】《家畜生态学报》
【年(卷),期】2005(26)5
【摘要】将小鼠胚胎分别用常规冷冻法和OPS法冷冻,结果用常规冷冻法和OPS 法冷冻小鼠桑葚胚,解冻后培养24 h胚胎的发育率分别为87.32%、86.67%(P＞0.05);用两种方法冷冻小鼠囊胚的结果分别为81.43%、83.56%(P＞0.05),结果表明用OPS法冷冻保存小鼠胚胎能达到用常规冷冻法的效果.
【总页数】2页(P19-20)
【作者】吕文发;王军;李喜春;王春强;王恒
【作者单位】吉林农业大学动物科技学院,吉林,长春,130118;吉林农业大学动物科技学院,吉林,长春,130118;吉林农业大学动物科技学院,吉林,长春,130118;吉林农业大学动物科技学院,吉林,长春,130118;吉林农业大学动物科技学院,吉林,长
春,130118
【正文语种】中文
【中图分类】S811.5
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药品器材清单
PMSG 孕马血清促性腺激素
hCG 人绒毛膜促性腺激素
DPBS 杜氏磷酸缓冲液
M16 体外培养液
EG 乙二醇
蔗糖
塑料细管
1ml注射器
35mm培养皿若干
二氧化碳培养箱
小鼠胚胎的获取
控光（14h光照，10h黑暗）饲养1-2周后的4-6周龄小白雌鼠，腹腔注射10 IU/只PMSG，48h后腹腔注射10 IU/只hCG。
注射hCG后（计时为0h）当晚与雄鼠（≥8周龄）合笼（雌：雄=2:1或1:1）。
次日早晨检查阴道栓，见栓雌鼠于72-82h颈椎脱臼处死，采集桑椹胚。
在DPBS中洗净后移入M16培养基，置于5 %CO2,95 %空气,相对湿度100 %的二氧化碳培养箱中待用。
小鼠胚胎的玻璃化冷冻
平衡液EG10，见附录溶液的配制。
玻璃化溶液EFS40 ，见附表2。
或者EG40，亦见附录溶液的配制。
解冻稀释液用DPBS稀释而成的0. 5mol/L蔗糖溶液。
将室温调至25℃,经1～2小时将溶液及用具充分平衡后，用0. 25ml的塑料细管(Flance)
按顺序吸入解冻稀释液5cm———空气1㎝——1.5cm玻璃化溶液。
用吸管将胚胎移入平衡液平衡5分钟,而后导入细管内的玻璃化溶液中平衡30秒。
这30秒接着吸入空气1cm——吸满解冻稀释液，封口后直接投入液氮中保存。
小鼠冷冻胚胎的解冻
将冻好保存于液氮中的细管,取出后直接投入25℃水中快速解冻。
当解冻稀释液部分由乳白变为透明时取出,用吸水纸将细管水珠拭净,剪断细管两端的栓塞后,用含有解冻稀释液(0. 8ml)的注射器(带16号针头),将细管内容物冲洗于表面皿中，轻轻摇匀,置于实体显微镜下回收胚胎。
回收的胚胎于解冻稀释液中平衡5分钟,以便脱出细胞内部乙二醇,再用PBS洗净后,移入M16溶液中于5 %CO2,95 %空气,相对湿度100 %的二氧化碳培养箱中培养。
小鼠胚胎的发育能力判定
体外培养回收的胚胎在M16中培养48小时以内恢复到囊胚或继续发育的胚胎视为有发育能力胚胎。
胚胎移植解冻后的胚胎,约经3小时培养,选择外形良好的胚胎移植于与结扎输精管的公鼠交配后即假妊娠第3天受体鼠的子宫中,一侧5～7枚,每只受体10～14枚胚胎为宜。
妊娠19～22天观察产仔情况。