RNAi技术在转基因动物中的应用

遗　传HEREDIT AS (Beijing )28(3):351～356,2006

专论与综述

收稿日期:20050914;修回日期:20051130

基金项目:国家自然科学基金(编号:30321003);国家863计划课题(编号:2004AA221100;2002BA71A0225)[Supported by the National Natural

Science Foundation of China (No.30321003),the National H igh Technology Research and Development Program of China (No.2004AA221100;2002BA71A0225)]

作者简介:尹秀山(1981—

),男,在读硕士生,研究方向:基因打靶。E 2mail :yinxs @ 通讯作者:贺福初(1962—)男,研究员,中国科学院院士,研究方向:系统生物学。Tel :010*********;E 2mail :hefc @

张令强(1976—

),男,副研究员,研究方向:分子生物学。Tel :010*********;E 2mail :zhanglq @ 致 谢:感谢本实验室功能基因组李力博士对本工作提供的帮助和指导;感谢本院生物工程研究所八室杨晓教授及程　萱、侯　宁老师在

转基因小鼠和基因敲除小鼠模型建立及相关问题提供的帮助。

RNAi 技术在转基因动物中的应用

尹秀山,张令强,贺福初

(军事医学科学院放射与辐射医学研究所,北京100850)

摘　要:R NAi 可以作为一种有效的工具用来产生转录后沉默的效果,从而抑制特定基因的表达,已经在线虫、果蝇、小鼠、大鼠等模式生物中得到成功应用。RNAi 转基因小鼠的出现,使得在哺乳动物整体水平研究靶基因的敲低成为可能。文章以RNAi 转基因小鼠为代表,就转基因载体的设计策略、基因敲除与基因敲低的比较、RNAi 转基因动物的优势以及目前存在的缺陷等作一总结,并展望了R NAi 转基因动物对功能基因组研究的贡献以及应用前景。关键词:R NAi ;转基因小鼠;基因打靶;模式生物中图分类号:Q323 文献标识码:A

文章编号:0253-9772(2006)03-0351-06

The Ap p lic a ti o n of RNAi Te c h n ol o g y i n Tr a ns g e ni c Mic e

YI N X iu 2Shan ,ZH ANGLing 2Qiang ,HE Fu 2Chu

(Beijing Institute of Radiation Medicine ,Beijing 100850,China )

Abs t ra ct :RNA interference (R NAi )has been extensively used for sequence 2specific silencing of gene function in C.

elegans ,Drosophila ,mouse and rat.The generation of R NAi transgenic mice made it po ssible to knock down gene expre ssion at the whole organism level in mammalian specie s.In this review we de scribed the de sign strategy of R NAi vectors ,compared the difference of gene knock 2down from knock 2out ,and summarized the advantage s and unresolved issue s concerning R NAi transgenic mice.The contribution of R NAi transgenic mice to functional genomics and of its pro spect for application were also discussed.

Ke y w or ds :R NAi ;transgenic mice ;gene targeting ;model animals

随着DNA 序列精细图谱的完成,生命科学正式进入了后基因组时代,对所有基因的功能进行阐释成为当前最重要的任务[1]。在这一过程中,模式生物的应用,尤其是基因敲除小鼠模型的建立对于解读这部天书有着巨大的帮助。基因敲除小鼠模型从动物整体水平研究基因的功能,具有很多其他技术手段无法比拟的优点[2]。然而基因敲除小鼠模型的

建立周期长、技术含量高、风险性大。至今国内外仍没有在基因打靶方面取得突破性进展使得此技术能够满足快速化、高通量研究基因功能的要求。因此,一种可以快速产生基因敲除效果的模型策略成为系统生物学发展的需要。

由于技术水平和RNA 本身特性等条件的限制,RNAi (RNA interference )这一古老的,在生物进化过

程中保守存在的机制一直未被人们所认识。直到1998年,Fire等[3]发现将双链RNA注射到线虫体内后可以诱导专一性的转录后基因沉默,从此,这门新技术便飞速发展起来。目前,RNAi的作用原理已经初步认清[4,5],而且RNAi作为一种有效的工具用来抑制特定基因的表达,已经在线虫、果蝇、小鼠、大鼠等模式生物中得到应用。本文就自从2002年首次报道RNAi转基因小鼠以来,RNAi技术在动物模型、尤其在转基因小鼠模型中的应用、载体构建策略、目前存在的问题等作一系统性的总结。

1　RNAi在转基因小鼠中的应用

1.1　RNAi转基因小鼠研究进展

RNAi机制被发现以来,在低等模式生物中得到了广泛的应用。然而在哺乳动物中,导入长度大于30个碱基的双链RNA就会启动哺乳动物体内的抗病毒保护机制,并且没有特异的靶向性。Elbashir 等[6]发现将人工合成的21～23碱基大小的双链RNA导入哺乳动物细胞后,可以引起特异的基因沉默,并不会引发细胞的抵御反应。不足之处就是这种特异的基因沉默效果不能长期维持。

2002年,多家实验室几乎同时将利用RNA聚合酶Ⅲ的启动子构建的RNAi载体应用于转染哺乳动物的细胞系,从而达到稳定的对靶基因产生转录后沉默的效果[7,8]。同时,Masaru Okabe实验室成功建立了第一种应用RNAi的转基因小鼠[7]。这种转基因小鼠体内能产生特异针对GFP的siRNA,可以在GFP转基因小鼠全身各个组织内敲低GFP的表达,对GFP表达的抑制程度最高能够达到96%。

由于RNAi转基因小鼠模型能够达到类似基因敲除的效果,迄今为止,已经有几百篇关于RNAi转基因小鼠的报道。引导siRNA产生的启动子,已经由RNA聚合酶Ⅲ的H1和U6扩展到了RNA聚合酶Ⅱ[9]。对siRNA的设计要求也由原来的21～23个碱基扩展到了几百个碱基。基于四环素等诱导的条件型RNAi转基因策略的出现[10～14],使得这一新的研究基因功能的强有力的工具受到越来越的关注。　

1.2　RNAi转基因载体的构建策略

RNAi转基因载体的设计是构建RNAi转基因小鼠模型过程中最关键的一步。一般的设计策略是:利用RNA聚合酶Ⅲ的H1或U6启动子来启动siRNA 的转录,下游紧接的是能够形成发卡结构状dsRNA 的特定序列,然后接着polyT,有的载体还在下游加上表达荧光的报告基因[7](图1,a)。这种设计由于是通过一个中间序列形成了一个环引导的发卡,也称一体型载体。还有一种前后型载体,采用相同的两个启动子,一前一后,分别启动siRNA正义链和反义链的转录[15](图1,b)

。

图1　RNAi普通型载体构建示意图

Fi g.1　S c he matic rep re s e nt ati on of siRNA

e xp re s s i on ve ct ors

图2　四环素诱导的RNAi载体构建示意图

Fi g.2　S c he matic rep re s e nt ati on of s iRNA e xp re s s i on ve ct or c ont r olle d by t e t ra c ycline

利用RNA聚合酶Ⅲ构建的载体设计的siRNA 一般长度为21～23个碱基,Shinagawa等设计出利用CMV(Cytomegalovirus)作为启动子的RNAi载体。这种载体dsRNA长度能达到500个碱基以上,由于产生的dsRNA不进行5′端的加帽和3′端的加尾,所以不能被转运出核而滞留在核内。这种长链

253遗　传H ER ED I TA S(B ei j ing)2006 28卷