RNAi技术在转基因动物中的应用

遗　传HEREDIT AS (Beijing )28(3):351～356,2006
专论与综述
收稿日期:20050914;修回日期:20051130
基金项目:国家自然科学基金(编号:30321003);国家863计划课题(编号:2004AA221100;2002BA71A0225)[Supported by the National Natural
Science Foundation of China (No.30321003),the National H igh Technology Research and Development Program of China (No.2004AA221100;2002BA71A0225)]
作者简介:尹秀山(1981—
),男,在读硕士生,研究方向:基因打靶。

E 2mail :yinxs @ 通讯作者:贺福初(1962—)男,研究员,中国科学院院士,研究方向:系统生物学。

Tel :010*********;E 2mail :hefc @
张令强(1976—
),男,副研究员,研究方向:分子生物学。

Tel :010*********;E 2mail :zhanglq @ 致 谢:感谢本实验室功能基因组李力博士对本工作提供的帮助和指导;感谢本院生物工程研究所八室杨晓教授及程　萱、侯　宁老师在
转基因小鼠和基因敲除小鼠模型建立及相关问题提供的帮助。

RNAi 技术在转基因动物中的应用
尹秀山,张令强,贺福初
(军事医学科学院放射与辐射医学研究所,北京100850)
摘　要:R NAi 可以作为一种有效的工具用来产生转录后沉默的效果,从而抑制特定基因的表达,已经在线虫、果蝇、小鼠、大鼠等模式生物中得到成功应用。

RNAi 转基因小鼠的出现,使得在哺乳动物整体水平研究靶基因的敲低成为可能。

文章以RNAi 转基因小鼠为代表,就转基因载体的设计策略、基因敲除与基因敲低的比较、RNAi 转基因动物的优势以及目前存在的缺陷等作一总结,并展望了R NAi 转基因动物对功能基因组研究的贡献以及应用前景。

关键词:R NAi ;转基因小鼠;基因打靶;模式生物中图分类号:Q323 文献标识码:A
文章编号:0253-9772(2006)03-0351-06
The Ap p lic a ti o n of RNAi Te c h n ol o g y i n Tr a ns g e ni c Mic e
YI N X iu 2Shan ,ZH ANGLing 2Qiang ,HE Fu 2Chu
(Beijing Institute of Radiation Medicine ,Beijing 100850,China )
Abs t ra ct :RNA interference (R NAi )has been extensively used for sequence 2specific silencing of gene function in C.
elegans ,Drosophila ,mouse and rat.The generation of R NAi transgenic mice made it po ssible to knock down gene expre ssion at the whole organism level in mammalian specie s.In this review we de scribed the de sign strategy of R NAi vectors ,compared the difference of gene knock 2down from knock 2out ,and summarized the advantage s and unresolved issue s concerning R NAi transgenic mice.The contribution of R NAi transgenic mice to functional genomics and of its pro spect for application were also discussed.
Ke y w or ds :R NAi ;transgenic mice ;gene targeting ;model animals
随着DNA 序列精细图谱的完成,生命科学正式进入了后基因组时代,对所有基因的功能进行阐释成为当前最重要的任务[1]。

在这一过程中,模式生物的应用,尤其是基因敲除小鼠模型的建立对于解读这部天书有着巨大的帮助。

基因敲除小鼠模型从动物整体水平研究基因的功能,具有很多其他技术手段无法比拟的优点[2]。

然而基因敲除小鼠模型的
建立周期长、技术含量高、风险性大。

至今国内外仍没有在基因打靶方面取得突破性进展使得此技术能够满足快速化、高通量研究基因功能的要求。

因此,一种可以快速产生基因敲除效果的模型策略成为系统生物学发展的需要。

由于技术水平和RNA 本身特性等条件的限制,RNAi (RNA interference )这一古老的,在生物进化过
程中保守存在的机制一直未被人们所认识。

直到1998年,Fire等[3]发现将双链RNA注射到线虫体内后可以诱导专一性的转录后基因沉默,从此,这门新技术便飞速发展起来。

目前,RNAi的作用原理已经初步认清[4,5],而且RNAi作为一种有效的工具用来抑制特定基因的表达,已经在线虫、果蝇、小鼠、大鼠等模式生物中得到应用。

本文就自从2002年首次报道RNAi转基因小鼠以来,RNAi技术在动物模型、尤其在转基因小鼠模型中的应用、载体构建策略、目前存在的问题等作一系统性的总结。

1　RNAi在转基因小鼠中的应用
1.1　RNAi转基因小鼠研究进展
RNAi机制被发现以来,在低等模式生物中得到了广泛的应用。

然而在哺乳动物中,导入长度大于30个碱基的双链RNA就会启动哺乳动物体内的抗病毒保护机制,并且没有特异的靶向性。

Elbashir 等[6]发现将人工合成的21～23碱基大小的双链RNA导入哺乳动物细胞后,可以引起特异的基因沉默,并不会引发细胞的抵御反应。

不足之处就是这种特异的基因沉默效果不能长期维持。

2002年,多家实验室几乎同时将利用RNA聚合酶Ⅲ的启动子构建的RNAi载体应用于转染哺乳动物的细胞系,从而达到稳定的对靶基因产生转录后沉默的效果[7,8]。

同时,Masaru Okabe实验室成功建立了第一种应用RNAi的转基因小鼠[7]。

这种转基因小鼠体内能产生特异针对GFP的siRNA,可以在GFP转基因小鼠全身各个组织内敲低GFP的表达,对GFP表达的抑制程度最高能够达到96%。

由于RNAi转基因小鼠模型能够达到类似基因敲除的效果,迄今为止,已经有几百篇关于RNAi转基因小鼠的报道。

引导siRNA产生的启动子,已经由RNA聚合酶Ⅲ的H1和U6扩展到了RNA聚合酶Ⅱ[9]。

对siRNA的设计要求也由原来的21～23个碱基扩展到了几百个碱基。

基于四环素等诱导的条件型RNAi转基因策略的出现[10～14],使得这一新的研究基因功能的强有力的工具受到越来越的关注。

　
1.2　RNAi转基因载体的构建策略
RNAi转基因载体的设计是构建RNAi转基因小鼠模型过程中最关键的一步。

一般的设计策略是:利用RNA聚合酶Ⅲ的H1或U6启动子来启动siRNA 的转录,下游紧接的是能够形成发卡结构状dsRNA 的特定序列,然后接着polyT,有的载体还在下游加上表达荧光的报告基因[7](图1,a)。

这种设计由于是通过一个中间序列形成了一个环引导的发卡,也称一体型载体。

还有一种前后型载体,采用相同的两个启动子,一前一后,分别启动siRNA正义链和反义链的转录[15](图1,b)。

图1　RNAi普通型载体构建示意图
Fi g.1　S c he matic rep re s e nt ati on of siRNA
e xp re s s i on ve ct ors
图2　四环素诱导的RNAi载体构建示意图
Fi g.2　S c he matic rep re s e nt ati on of s iRNA e xp re s s i on ve ct or c ont r olle d by t e t ra c ycline
利用RNA聚合酶Ⅲ构建的载体设计的siRNA 一般长度为21～23个碱基,Shinagawa等设计出利用CMV(Cytomegalovirus)作为启动子的RNAi载体。

这种载体dsRNA长度能达到500个碱基以上,由于产生的dsRNA不进行5′端的加帽和3′端的加尾,所以不能被转运出核而滞留在核内。

这种长链
253遗　传H ER ED I TA S(B ei j ing)2006 28卷　
dsRNA经过核内的Dicer降解成小RNA,然后被转运出核与特异的mRNA结合,导致靶定序列的降解[9]。

自从RNAi转基因小鼠有报道以来,人们就迅速想到了在基因打靶中应用的条件型载体策略,基于四环素诱导的时间型调控载体和基于Cre2LoxP 原理的组织特异性表达载体很快便被报道[10～14,16,17]。

基于四环素诱导的载体构建策略在2003年被多家实验室提出[10～14]。

在这种载体中,四环素操纵子插入到RNA聚合酶Ⅲ的H1或U6启动子中。

在四环素(tetracycline)或者强力霉素(doxycycline)不存在的情况下,四环素的抑制子TetR就和四环素操纵子区域结合使siRNA无法产生。

当加入四环素或强力霉素后就可以调节TetR从而产生siRNA(图2)。

在细胞水平的实验证实通过改变加入四环素的剂量浓度可以调节siRNA产生的量,进而调控对靶基因的抑制[11]。

这样就可建立较少的Founder小鼠,通过在食物中添加不同浓度的四环素来产生不同层次的抑制表型,既可研究基因的量效关系,又减少了维持小鼠的费用和工作量。

基于Cre2LoxP原理的载体构建策略最近也取得进展,就在3个月前,邓初夏实验室报道利用Cre2 LoxP原理成功建立了Fgfr2基因敲低的小鼠模型,使得Cre2Loxp介导的siRNA可以组织特异性的敲低靶基因的表达[18]。

这样,RNAi转基因小鼠既可以在四环素诱导的载体构建策略下在特定的时间段实现对靶基因的抑制,并能够通过控制小鼠摄取的四环素剂量实现不同层次的抑制表型;也可以在Cre2LoxP载体构建策略下在特定组织甚至细胞系中研究对靶基因敲低后的表型。

但是这样精细的策略有时仍不能满足研究的需要。

也是在3个月前,Wei Hsu实验室建立了一种利用一个载体同时达到四环素诱导的载体和Cre2LoxP载体效果的基因敲除小鼠模型,实现了时空特异性敲除,可谓把基因打靶策略发挥到了极至[19]。

而这种策略应用于RNAi转基因策略中在理论上是完全可行的。

由于相关技术都已具备,加上转基因小鼠获得难度远低于基因敲除小鼠,可预见这种小鼠模型的产生只是一个时间的问题。

1.3　基因敲除与基因敲低
基因敲除小鼠建立在胚胎干细胞技术和同源重组技术上,是一种定向改变生物活体遗传信息的实验手段[20,21]。

通过对基因敲除小鼠的研究,使许多与人类疾病相关的新基因功能得到阐明,使生命科学与医学得到了迅速的发展。

近年随着基因组学和蛋白质组学的发展,大量的数据信息需要回归到基因功能水平,在动物整体水平进行验证是最好的策略。

但是基因敲除小鼠模型的建立耗时长,难度大,无法满足后基因组时代的需求。

RNAi转基因小鼠则是建立在转基因技术和RNAi原理上,是一种随机整合于基因组,但能特异抑制靶基因表达的实验手段。

与基因敲除小鼠相比可以作以下3个方面的比较。

(1)关于遗传背景。

对于基因敲除小鼠,ES细胞大都来自129系小鼠。

但该品系由于固有的缺陷,繁殖质量较差。

故供体囊胚及后来的杂交都选用繁殖能力强的小鼠如C57BL/6J。

这导致小鼠的遗传背景很模糊,于是同一种基因敲除,在不同的小鼠重系遗传背景下表型可能完全不同甚至相反,大大增加了表型分析的难度[22,23]。

RNAi转基因小鼠则不需考虑这些问题,所以我们可以选择单一的小鼠种系从而得到非常干净的遗传背景,使后续的表型分析有更高的可信度。

(2)关于遗传方式。

基因敲除小鼠模型的成功构建,从载体设计到得到基因敲除的小鼠,一般需要2～3年的时间。

需要经过6个关键步骤:载体构建→电转ES细胞→囊胚注射→F0代嵌合体小鼠→F1代杂合体小鼠→F2代纯合体小鼠,而RNAi转基因小鼠和普通的转基因动物一样,只需要3步:载体构建→显微注射→F0代Founder小鼠(图3)。

可见RNAi转基因小鼠与基因敲除小鼠相比,无论在时间上还是步骤上,都有着很大的优势。

对于RNAi转基因小鼠来说,更方便的是可以同时进行两个或多个RNAi载体的共注射,产生双抑制或多抑制的效果[24]。

而基因敲除小鼠只有按照孟德尔遗传定律通过交配传代才能得到如双敲的小鼠。

(3)关于梯度量效。

基因敲除能够达到的效果是100%的把靶基因敲除。

一些疾病可能是因为体内某种或某些蛋白表达的水平不同导致的。

这样,利用基因敲除就无法实现这类疾病模型的建立。

而基因敲低在理论上可以实现从1%到99%的抑制效果,弥补了基因敲除的缺陷。

353
　3期 尹秀山等:RNAi技术在转基因动物中的应用
图3　基因敲除Vs基因敲低
Fi g.3　Kn oc k2out vs Kn oc k2d ow n
2　RNAi在其他模式生物中的应用
2.1　线虫
RNAi就是最先在线虫中被阐明的,最初研究dsRNA被注射到线虫的生殖腺,后来发现把dsRNA 注射到线虫的任何一个部位都可以产生抑制靶基因表达的效果,更有甚者,把产生dsRNA的工程菌作为线虫的饲料或者把线虫浸泡在含有dsRNA的溶液里一样可以产生转录后沉默效应[25,26]。

并且这种效应可以遗传给子代,使这种效应的研究贯穿线虫的整个发育阶段。

现在RNAi已经成为一种广泛应用在线虫反向遗传学研究的有利工具[27]。

2.2　果蝇
在果蝇中不能应用同源重组和基因替换策略研究基因的功能,一般的研究方法是P启动子插入失活或者γ射线照射诱变使基因突变。

但是这些方法耗费大量的人力物力,时时还会产生一些混乱的表型,使研究者无法解释[28]。

RNAi技术现在已广泛应用于果蝇基因的功能研究,在果蝇中进行RNAi实验策略同线虫相似,可以通过直接注射方法达到抑制靶基因的效果。

RNAi技术目前可以在果蝇各个品系的细胞内实现,从而使对果蝇进行各个水平上的研究成为可能[28]。

而且这种抑制在很短时间内(2～3天)就可以发挥效果,这是其他的传统技术无法达到的[28]。

据推断果蝇体内只有1/3的基因可以通过诱变的方式得到可以检测到的表型,剩余2/3的基因会因为基因冗余等原因无法得到明显的表型,RNAi同时抑制多个基因可以克服这种基因冗余机制得到理想的表型[29]。

利用RNAi技术可以尽快得到更多的基因功能信息,并能用来同时研究信号通路中的多个基因达到研究整条信号通路的结果[30]。

2.3　大鼠
目前大鼠是研究人类高血压、糖尿病、乳腺癌和神经系统疾病的最理想的动物。

与小鼠相比,大鼠更适宜作为人类疾病的动物模型。

但由于大鼠的ES细胞技术仍不成熟,无法获得基因敲除的大鼠动物模型,使它在人类疾病研究和药物研制方面的实际应用受到了很大的限制。

Masaru Okabe实验室在成功建立第一种应用RNAi的转基因小鼠同时,
453遗　传H ER ED I TA S(B ei j ing)2006 28卷　
也建立了应用RNAi的转基因大鼠[6]。

转基因大鼠的出现,使得在大鼠中研究产生类似基因敲除的效果成为可能。

3　RNAi转基因小鼠存在的缺陷
尽管RNAi转基因小鼠有如此多的优点,但是由于RNAi的机制至今仍未解释清楚,很多设计的dsRNA不能产生抑制靶基因转录后沉默的效果。

而且由于RNAi转基因小鼠只是在转录后水平上敲低基因的表达,并不象基因敲除那样100%的把基因从基因组中剔除掉,所以有时也会因背景的不干净导致产生的表型难以分析。

前者面临的问题会随着对RNAi机理的探明而得到解决。

而后者则是由于RNAi本身的性质决定的。

目前只有基因敲除小鼠或基因突变小鼠能达到基因水平的剔除或灭活。

4　展　望
除了在各种模式生物中的应用以外,RNAi在昆虫中可能有更大的应用前景[31]。

自从本世纪初出现第一只转基因蚊子以来,人们的研究兴趣开始转向一些节肢动物的研究[32]。

将来在RNAi转基因技术可能导致昆虫研究的飞速发展。

不仅对于防治害虫如蚊子、蟑螂等有很大的帮助,而且对于研究昆虫基因的进化开辟了一条新路。

尽管有很多的不足和缺陷尚未解决,后基因组时代的研究必将受益于RNAi转基因小鼠模型。

目前国内关于RNAi转基因小鼠的报道还很少,但由于其巨大的优势以及与基因敲除相比对技术的低依赖性和省时性,必将受到越来越多的关注。

随着研究的深入,相信生命科学领域很快就会迎来一个时空诱导的、全基因水平的基因敲低小鼠时代。

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