第六章稳定性同位素示踪法
稳定同位素PPT课件
已测定出矿物~水之间的待定常数 a、b
矿物~水
a
石英~水 3.38×106
碱长石~水 2.15 ×106
方解石~水 2.78 ×106
白云母~水 2.38 ×106
b 温度区间(oC) -3.40 200~500 -3.82 350~500 -3.40 0~800 -3.89 350~650
形成时，两共生矿物与一个公共流体相达成平衡，则两 个矿物的 δ18O 值之间存在一个平衡差，由此值可根据内 部计温法计算成岩温度。
例如：以石英、方解石共生矿物对为例： 1000 lnα石英-水=3.38×106T-2 -3.40 1000 lnα方解石-水=2.78×106T-2-3.40 则石英—方解石氧同位素温度计为： 1000 lnα石-方=(3.38-2.78)·(106T-2)+[ -3.40 -（-3.40）] 1000 lnα石-方=Δ石-方=0.60（106T-2） 外部测温法，可用来计算水介质的氢、氧同位素组成。其条件 是，当某矿物的氢、氧同位素组成及其形成温度是可知时，便可根 据有关方程，计算出介质水的氢、氧同位素组成： 1000 lnα矿物—水=δ18O矿—δ18O水=(α/T2)+b 其中δ18O矿、T已知，a、b是待定常数，则可计算出成矿溶液的 H、O同位素组成。
其结果是岩石中富集了18O，水中富集了16O。由于大部分 岩石中氢的含量很低，因此，在水~岩交换反应中氢同位素 成分变化不大。有实验证明，在含OH的矿物中，水-岩反应 结果使得矿物的δD增高。 原因：键强度
• 3.矿物晶格的化学键对氧同位素的选择 • 实验证明： • Si—O—Si键矿物18O最富; • Si—O—Al，Si—O—Mg，Si—O—Fe 其
稳定同位素标记
稳定同位素标记引言稳定同位素标记被广泛应用于不同领域的科学研究中，包括地质学、环境科学、生物学等。
在这些研究中，稳定同位素的标记可以提供关于物质来源、代谢途径和地质过程的重要信息。
本文将探讨稳定同位素标记的原理、应用以及其在不同领域的作用。
稳定同位素标记的原理稳定同位素是指具有相同原子序数但不同质量数的同一种元素，其核外电子结构相同，但核内的中子数不同。
不同同位素之间的质谱值差异可以通过质谱仪进行精确测定，并用于稳定同位素标记。
稳定同位素标记的原理基于同位素的相对丰度稳定性。
相对于放射性同位素，稳定同位素具有长半衰期，不会放射出射线，并且相对丰度在地球上和生物体内具有稳定性。
因此，稳定同位素可以被用作标记物质的示踪剂，并提供关于物质来源、生物过程和地质过程的信息。
稳定同位素标记的应用稳定同位素标记在各个科学领域有着广泛的应用。
以下是几个主要领域的应用示例：1. 地质学稳定同位素标记被广泛用于研究地球历史和地质过程。
例如，通过测量岩石中不同同位素的丰度，可以确定岩石的形成时间和条件，揭示地壳演化的历史。
稳定同位素标记还用于研究地下水和地表水的起源和流动方式，以及地球气候的变化过程。
2. 环境科学稳定同位素标记在环境科学研究中也起着重要作用。
通过测量水体、土壤和大气中稳定同位素的丰度，可以追踪污染物的行为和传输途径。
稳定同位素标记还可以用于研究生态系统中物质循环和生物过程，如食物链和能量流动。
3. 生物学稳定同位素标记在生物学研究中有着广泛应用。
通过将稳定同位素标记物质引入生物体内，可以跟踪物质在生物体内的运动和转化过程。
例如，通过注入稳定同位素标记的氮气到植物叶片中，可以研究植物光合作用的速率和效率。
稳定同位素标记还可以应用于动物行为研究、食物链分析以及追踪动植物迁徙。
稳定同位素标记的示踪方法稳定同位素标记的示踪方法根据研究对象和目的的不同而有所差异。
以下是几种常见的示踪方法：1. 同位素比值法同位素比值法是最常用的稳定同位素标记方法之一。
华中农业大学同位素示踪技术讲课提纲七
af = 1.37-0.37 = 1.0%
∴ Ndff = ap/af = 0.3/1.0 = 30%
Npf = Np×Ndff = 30Kg/亩×30% = 9Kg/亩
施入尿素量：W = 20/40% = 80Kg/亩
肥料N素利用率：R = Npf/Nf= 9/20 = 45%
①15N2还原法（Burris,1941）:充15N2密室进行
NdfA=a样/a气×100%
固氮量=NdfA×总N量 ②同位素稀释法（J、O、Legg等，1975），15N施入土壤
NdfA=1- a固/a非
③AN值法（M、Fried等，1975），田间种固N、非固N NdfA=(As + Afix - As) ×NdfF/Af As、Af、Afix分别代表土壤、肥料、大豆有效N量。 NdfF:来自肥料N素的比例。
Ndff = ap/af×100% （设N素来源于土壤
和肥料二方面） （3）
af：肥料N的原子百分超（或动物饲料N的原 子百分超，此时又多了一个动物排泄因素）。
上片解释见第五章第37片同位 素稀释法
4 、 植 物 从 土 壤 中 摄 取 N 的 % （ Percentage of in the plant tissue derived from
(2) 仪器的本底检查。
(3)离子峰的选择（14N和15N的峰比28N、29N小 10倍，选28N、29N、30N）。
(4) 仪器精确度检查（检查去O2后的空气或 纯N气）。
2.分析样品的制备：
(1) K氏法（Kjeidali） 质谱分析常用法。
A.样品的消化：（例：0.05g植样
+10ml 浓 H2S04+3.3gSe:CuSO4:K2SO4 为 1:10:100混合催化剂→样液清亮再消煮 5h （ 土 ） 或 2h( 植 ) ， 温 度 120-140℃ 。 样品予处理：水杨酸—硫酸法：5g干土 或0.5g植样+12ml水杨酸：硫酸为50g： 1000ml 溶 液 中 放 置 30min ， 再 加 2.5g 硫 代硫酸钠和15ml水，缓缓加热至停出起 泡→冷却→常规消化）。
稳定性同位素示踪法
700℃ CuO 、 CaO 使 用 前 用 700℃ 高 温 12烘 干 除 去 CO2 ， H2O ， 并 在 122 压力下制成棒状 , 备光谱 18Kg/cm 18Kg/cm 压力下制成棒状, 分析
通电予热仪器10分钟，打开光电倍增管高压 通电予热仪器10分钟，打开光电倍增管高压 10分钟
大气中的氮气
大气中的氧气
氮的同位素表
射线种类 β+ β+ ββ半衰期 0.011S 9.96m 7.1S 4.15S 99.635 0.365 自然丰度
同位素
12N
13N
14N
15N
16N
17N
1978年国际纯化学和化学联合会 年国际纯化学和化学联合会IUPAC的命名 年国际纯化学和化学联合会 的命名 法: 1. 结构式 15[N]HCl 结构式: 物质不存在) 物质不存在
4.“Y”型管及内部反应抽气须彻底 ， 型管及内部反应抽气须彻底， Y 型管及内部反应抽气须彻底 防其它气体干扰。 防其它气体干扰。
以下在光谱仪上进行, 以下在光谱仪上进行 , 可用液体样 品也可用干样品
(2).杜马法（Dumas） (2).杜马法（Dumas） 杜马法
—光谱分析中常用法 光谱分析中常用法
峰高。 峰高。
求得平均峰高，计算15N丰度。 求得平均峰高， 丰度。 平均峰高
15N实验结果计算 七．
14、15的质量比28、29、30的小10倍 的质量比28 的小10 14、15的质量比28、29、30的小10倍 不参加运算
15N丰度小于5%: 当 丰度小于5
质量为28离子流强度/质量为29 28离子流强度 R = 质量为28离子流强度/质量为29 子流强度
放电管装入燃烧室固定架上 放电管装入燃烧室固定架上。 装入燃烧室固定架上。
稳定性同位素
稳定性同位素示踪法
概述：
1、1912年，Thomson首发现稳定性核素20Ne 和22Ne（氖）。 2、1929年，Naude发现了15N。
3、1937年，Urey等首次报道人工生产15N的 方法。
4、1940年，先后获得具生物意义的15N、18O 和2H大量生产。
5. 1947年9月在美国Wisconsin大学召开了“同位素 在生物学和医学中应用”专题讨论会，从此开始 了稳定性核素示踪技术应用的新纪元。
(4) 仪器精确度检查（检查去O2后的空气或 纯N气）。
2.分析样品的制备：
(1) K氏法（Kjeidali） 质谱分析常用法。
A.样品的消化：（例：0.05g植样+10ml浓
H2S04+3.3g催化剂（Se:CuSO4:K2SO4为1:10:100） → 样 液 清 亮 再 消 煮 5h （ 土 ） 或 2h( 植 ) ， 温 度 120-140℃。
3.予测样品测定项目……
五、质谱和光谱测定15N原理
14N和15质量不同 质谱：把N2离子化为28N-N2，29N-N2 ，30N-N2 使其 在均匀磁场中发生不同角度偏转 光谱：28N-N2：谱线波长为2976.8埃
29N-N2：谱线波长为2982.9埃 30N-N2：谱线波长为2988.6埃
1800的均匀磁场
即某核素在该组同位素中浓度。
自然丰度（Natural abundaa） A自(AO)
15N：0.365%、18O:0.204%
原子百分超（Atom percent excess） a
a = A-A自 又称富集度（Enrichment）
富集15N（Enriched 15N） 贫化15N（Depeled 15N )
化学反应中的同位素示踪实验
化学反应中的同位素示踪实验同位素示踪实验是一种在化学反应中使用同位素标记物质的方法，通过追踪同位素的行为，可以了解反应发生的过程和机制。
同位素示踪实验在化学领域中具有重要的地位，广泛地应用于反应动力学、反应机理、生物化学等领域。
本文将展示同位素示踪实验的原理、应用以及相关技术。
一、同位素示踪实验的原理同位素示踪实验的原理是利用同位素在化学反应中的行为与稳定同位素的特性，通过追踪同位素的排布来了解反应的过程。
同位素是具有相同原子序数但不同中子数的同种元素，因此具有相似的化学性质。
在同位素示踪实验中，通常使用的同位素有氢的氘同位素（2H）、碳的碳-14同位素（14C）、氮的氮-15同位素（15N）等。
二、同位素示踪实验的应用1. 反应动力学研究同位素示踪实验在反应动力学研究中起到关键的作用。
通过追踪同位素标记物质的浓度随时间的变化，可以确定反应速率常数、反应级数和活化能等重要参数，从而揭示反应的动力学过程。
2. 反应机理研究同位素示踪实验可用于研究化学反应的机理。
通过引入标记同位素，在不同反应步骤中追踪同位素的转移和分布情况，可以揭示反应中是否存在中间体、裂解反应、交换反应等一系列的反应步骤，进而了解反应的机理。
3. 生物化学研究同位素示踪实验在生物化学研究中具有广泛的应用。
通过给生物体内引入同位素标记物质，可以追踪其在代谢途径中的转化过程，如糖的代谢、蛋白质合成等，从而揭示生物体内的代谢途径、信号转导机制等。
三、同位素示踪实验的技术与方法同位素示踪实验涉及到较多的技术与方法，包括同位素标记化合物的制备、同位素测定方法、标记物质的纯化与追踪等。
通常使用的同位素测定方法有质谱法、辐射测量法等。
1. 同位素标记化合物的制备同位素标记化合物的制备需要选择合适的同位素标记剂和反应条件。
例如，在有机化学反应中，可以使用氘代试剂、碳-14标记试剂等来引入同位素。
制备过程需要注意同位素标记化合物的选择、合成方法的优化以及纯化方法的选择。
[讲解]同位素示踪法
![[讲解]同位素示踪法](https://img.taocdn.com/s3/m/8456fb66dd88d0d232d46aaa.png)
[讲解]同位素示踪法同位素示踪法同位素示踪法在高中生物学实验中的应用同位素示踪法是利用放射性核素作为示踪剂对研究对象进行标记的微量分析方法，即把放射性同位素的原子参到其他物质中去，让它们一起运动、迁移，再用放射性探测仪器进行追踪，就可知道放射性原子通过什么路径，运动到哪里了，是怎样分布的。
同位素示踪法是生物学实验中经常应用的一项重要方法，它可以研究细胞内的元素或化合物的来源、组成、分布和去向等，进而了解细胞的结构和功能、化学物质的变化、反应机理等。
用于示踪技术的放射性同位素一般是用于构成细胞化合物的重要元素，如3H、14C、15N、18O、32P、35S、131I等。
在高中生物学教材中有多处涉及到放射性同位素的应用，下面笔者对教材中的相关知识进行归纳如下:1 研究蛋白质或核酸合成的原料及过程把具有反射性的原子参到合成蛋白质或核酸的原料(氨基酸或核苷酸)中，让它们一起运动、迁移，再用放射性探测仪器进行追踪，就可知道放射性原子通过什么路径、运动到哪里以及分布如何。
2 研究分泌蛋白的合成和运输用3H标记亮氨酸，探究分泌性蛋白质在细胞中的合成、运输与分泌途径。
在一次性给予放射性标记的氨基酸的前提下，通过观察细胞中放射性物质在不同时间出现的位置，就可以明确地看出细胞器在分泌蛋白合成和运输中的作用。
例如，通过实验说明分泌蛋白在附着于内质网上的核糖体中合成之后，是按照内质网?高尔基体?细胞膜的方向运输的，从而证明了细胞内的各种生物膜在功能上是紧密联系的。
3 研究细胞的结构和功能用同位素标记氨基酸或核苷酸并引入细胞内，探测这些放射性标记出现在哪些结构中，从而推断该细胞的结构和功能。
4 探究光合作用中元素的转移利用放射性同位素18O、14C、3H作为示踪原子来研究光合作用过程中某些物质的变化过程，从而揭示光合作用的机理。
例如，美国的科学家鲁宾和卡门研究光合作用中释放的氧到底是来自于水，还是来自于二氧化碳。
他们用氧的同位素18O 分别标记H2O和CO2，使它们分别成为H218O和C18O2，然后进行两组光合作用实验:第一组向绿色植物提供H218O和CO2，第二组向同种绿色植物提供H2O和C18O2。
稳定同位素示踪技术全解
研究背景
• 铅对人体具有多方面的毒性，可导致智力低下、 造血机能障碍、高血压、肾病等[1]。 • 大气铅污染是对人体健康危害十分严重的无机污 染； 它主要来自汽油燃烧产生的汽车尾气和工业 用铅。科学家已对铅的污染源和污染程度进行了 大量铅同位素示踪研究，铅同位素示踪已成为追 踪污染源和评价污染程度的有效方法。
15N原子% 15N + 14N
15N
× 100
= 自然物质中某元素的同位素丰度称为自
然丰度或天然丰度。
原子百分超
某一同位素丰度与自然丰度之差称为同
位素的原子百分超。
将15N浓缩到自然丰度的10倍，其原子 百分超是多少？ 3.65% - 0.365% = 3.285% 在实际测定中，应该采用对照组生物样 品的自然丰度。
二、15N示踪试验的布置
一般采用微区试验。
三、15N测样的制备
测定15N的质谱仪对测样的要求是以简
单的分子态进行。
具体制备过程如下：
1. 将样品中的标记氮转化成铵
用凯氏法将含氮样品在增温剂和催化剂 的参与下， 用浓硫酸消煮，使其中所含的各种形态的氮转化
为氨，与硫酸结合形成硫酸铵，然后加碱蒸馏，
使氨吸收在硼酸溶液中，用标准酸测定样品的全 氮量。 一般用硫酸钾、硫酸铜和硒粉组成的混合催化剂， 三者的质量比为 100：10：1。
通常选用质荷比为28，29，30的峰。 当样品中的15N丰度小于5%时，质荷比 为30的峰高比28，29的小得多（？）， 只能测量质荷比为28和29峰的离子强度 进行计算。 2. 计算公式 设： R=
质荷比为28的离子强度 质荷比为29的离子强度
又设：全部氮原子中14N占的比例为p，
而15N的为q；则 p + q = 1。
第六章稳定性同位素地球化学
ZN 10 11 66 67 77 78 88 89 8 10 16 16 16 17 16 18 16 20
Atomic Mass 1.0078 2.0141 12 13.0034 14.0031 15.0001 15.9949 16.9991 17.9992 31.9721 32.9714 33.9676 35.9671
熔点（760托， C）
0.00
沸点（760托， C）
100.00
蒸汽压（100 C，托） 760.00
粘度（20 C，泊松%） 1.002
D216O
1.1051 11.24 3.81 101.42 721.60 1.247
H218O
1.1106 4.30 0.28
100.14
1.056
分馏系数 Fractionation Factor ()
同位素分馏作用主要来自于同位素交换作 用 （平衡分馏）
• 平衡分馏来自气态或液态中分子或晶体中原子 的平移、转动和振动运动，因为与这些运动相 伴随的能量平均与其分子（原子）的质量有关
• 量子力学体系总是自发地自我调整，使其能量 降到最低的稳定态
• 在三种运动形式中，振动能量对同位素分馏作 用的影响最重要，而且在固体物质中，振动则 是原子唯一存在的运动形式
• 假设同位素的分配基本与压力条件无关
但也部分研究发现，体系压力可能对同位素的分配有不 同程度的影响，其机理是压力条件能改变影响溶液中挥 发份的含量，进而影响其在水-岩体系中的分配
• 原子数相对较低 。常指质量数小于40的稳定核素，区 别于高质量数稳定核素，包括放射成因同位素等
• 同元素的同位素间相对质量差异较大 • 它们之间常以强共价键结合 • 多具一种以上氧化价态，形成多种化合物，或组成自
地球化学第六章 同位素地球化学-稳定同位素
第六章同位素地球化学——稳定同位素第一节基本概念一、同位素的定义核素：是由一定数量的质子（P）和中子（N）构成的原子核。
核素具有质量、电荷、能量、放射性和丰度5中主要性质。
元素：具有相同质子数和中子数的核素.同位素：原子核内质子数相同而中子数不同的一类原子叫做同位素(isotope)，他们处在周期表上的同一位置二、同位素的分类– 放射性同位素(radioactive isotope)：原子核是不稳定的，它们能够白发地衰变成其他的同位素。
最终衰变为稳定的放射性成因同位素。
目前已知的放射性同位素达1200种左右，由于大部分放射性同位素的半衰期较短，目前已知自然界中存在的天然放射性同位素只有60种左右。
放射性同位素例子：238U→234Th＋4He(α)＋Q→206Pb；235U→207Pb；232Th→208Pb– 稳定同位素(stable isotope)：原子核是稳定的，迄今还未发现它们能够自发衰变形成其他的同位素。
自然界中共有1700余种同位素，其中稳定同位素有260余种。
z轻稳定同位素，又称天然的稳定同位素，是核合成以来就保持稳定。
其特点是①原子量小，同—元素的各同位素间的相对质量差异较大；②轻稳定同位素变化主要原因是同位素分馏作用所造成的，其反应是可逆的。
如氢同位素（1H和2H）、氧同位素（16O和18O）、碳同位素（12C和13C）等。
z重稳定同位素，又称放射成因同位素(radiogenic isotope)：稳定同位素中部分是由放射性同位素通过衰变后形成的稳定产物。
其特点是①原子量大，同—元素的各同位素间的相对质量差异小（0.7%~1.2%）环境的物理和化学条件的变化通常不导致重稳定同位素组成改变；②重稳定同位素变化主要原因是放射性同位素衰败引起，这种变化是单向的不可逆的。
如87Sr是由放射性同位素87Rb衰变而来的；三、同位素的丰度和原子量1．同位素丰度(isotope abundance) ：可分为绝对丰度和相对丰度绝对丰度是指某一同位素在所有各种稳定同位素总量中的相对份额，常以该同位素与1H（取1H=1012）或28Si（取28Si=106）的比值表示。
高中生物必修二第六章知识点总结
卵巢
过 程
有变形期
无变形期
子细胞数
一个精原细胞形成4个精子
一个卵原细胞形成1个卵细胞+3个极体
相同点
精子和卵细胞中染色体数目都是体细胞的一半
四、注意：
（1）同源染色体：①形态、大小基本相同；②一条来自父方，一条来自母方。
（2）精原细胞和卵原细胞
癌细胞特点：（1）能够无限增殖（2）形态结构发生显著变化；（3）癌细胞表面糖蛋白减少
细胞癌变相关基因：原癌基因和抑癌基因
（3）细胞的衰老
生物体内的细胞多数要经过未分化、分裂、分化和死亡这几个阶段。因此，细胞的衰老和死亡是一种正常的生命现象。衰老细胞具有的主要特征有以下几点：
（1）细胞内的水分减少，细胞新陈代谢的速率减慢；
（3）对实验结果进行统计学分析（4）严谨的科学设计实验程序：假说-------演绎法
★三、孟德尔豌豆杂交实验
（一）一对相对性状的杂交：
P：高茎豌豆×矮茎豌豆DD×dd
↓↓
F1： 高茎豌豆 F1： Dd
↓自交↓自交
F2：高茎豌豆 矮茎豌豆 F2：DD Dd dd
3 ： 1 1 ：2 ：1
基因分离定律的实质：在减数分裂形成配子过程中，等位基因随同源染色体的分开而分离，分别进入到两个配子中，独立地随配子遗传给后代
例：判断下列细胞正在进行什么分裂，处在什么时期？
答案：减Ⅱ前期 减Ⅰ前期 减Ⅱ前期 减Ⅱ末期 有丝后期 减Ⅱ后期 减Ⅱ后期 减Ⅰ后期
第三节伴性遗传
一、概念：遗传控制基因位于性染色体上，因而总是与性别相关联。
二、XY型性别决定方式：
染色体组成（n对）：
雄性：n－1对常染色体+ XY雌性：n－1对常染色体+ XX
生物化学资料：同位素示踪法和核磁共振波谱法
Proportional counting 正比计数法
正比计数法是测定由放射线通过对闪 烁器内某种物质的冲击，使之产生离 子化，并能放出闪光。经光电倍增管 把光转变为电子脉冲的振幅。经倍增 管放大后，即可加以检测。这种测定 法对于穿透力较强的γ射线比较合适。 而对于穿透力较小的β射线则不易穿 透到闪烁器内。
此时处于低子能级的原子核吸收能量跃迁到高子能级即产生核磁共振3核的质量数为偶数原子序数也为奇数或核的质量数为奇数质子数为偶数1612的取值1核的质量数与原子序数皆为偶数i0无自旋
同位素示踪法和核磁共振波谱法
同位素示踪法（isotopic tracer method）是利用放 射性核素作为示踪剂对研 究对象进行标记的微量分 析方法
Melvin Ellis Calvin
(1911-1997)
Isotopic tracer method——Rationale（原理）
Isotopic tracer method is a method for micro determination using radionuclide as a tracer to mark subjects. Radionuclide (and their compounds) used in isotopic have the same chemical and biological properties as common elements (and their compounds). However, their property in nuclear physics differ. They are able to emit characteristic ray ,therefore, their position, number and transformation can be traced by nuclear detectors.
IBs成因矿物学(稳定同位素)6
Z*
3n6
Z 1 i G(ui )ui
ui
hc kT
(i
i* )
11 1
G(ui )
2
ui
e ui 1
Sakai(1968)提出了计算固体矿物的公式：
ln
Z* Z
E
1 24
m ms
s
1
hc kT 2
i2
ms ms ms*
(1 kxms k y ms )
ks ms ks ms
其测量过程可归结为下列步骤：1）将被分析的 样品以气体形式送入离子源；2）被分析的元素转变 为电荷为e的阳离子，施加纵向电场将离子束汇聚成 一定能量的平行离子流；3）利用电，磁分解器将离 子束分解成M/e比值不同的组分；纪录并测定每一离 子束组分的强度；5）利用数据处理程序将离子束强 度转化成同位素丰度值；6）将待测样品测量值与工 作标准相比较，获得相对于国际标准的同位素比值。
D. 色谱－质谱在线技术 元素分析仪是测定石油化工产品中挥发性元素
含量的常用设备。 把元素分析仪与气体质谱仪通过一个接口连接
起来，样品由元素分析仪燃烧并经气相色谱分离， 通过载气将待测气体带入质谱仪进行稳定同位素比 值测定（Glesemann 等, 1994; 郑永飞等，1999）。 该技术在国外发展很快，已经在石油、天然气和农 业研究中得到广泛的应用，目前正在向环境和地球 科学领域扩展，并已实现对固体无机硅酸盐岩石内 部所含挥发性元素含量和同位素比值的同时测定。
103 ln Min 18 Min 103 ln Qu
(0
00)
(
RSa RSt
1) 1000
即样品的同位素比值相对于某一标准的同位素比
值的千分差。
蛋白质生理需求量的稳定性同位素标记氨基酸示踪测定法
蛋白质生理需求量的稳定性同位素标记氨基酸示踪测定法齐孟文中国农业大学1.背景蛋白质的生理需求是指维持机体正常代谢所需蛋白营养量的临界值，是制定合理饮食和蛋白质营养摄入推荐的基础数据，因此对其准确的测定在营养学上具有重要意义。
传统的氮素平衡方法，由于难以准确测定各种途径的氮损失，所得到结果不够精确，而标记氨基酸代谢与蛋白质关系提供了一种量精确测定蛋白质理需求量的示踪方法。
2.原理2.1示踪研究模型 氨基酸蛋白质IC S E图.氨基酸代谢两库模型注：I 是食物摄入率；C 是蛋白质分解率；E 是排泄率，通过转变为代谢产物( E) 而排泄, 如脱氨、氧化, 最后生成尿素、氨等物质；S 是合成而结合到蛋白质的结合率。
当机体内的代谢处于平衡状态时，单位时间内进入氨基酸库的量与离开的量相等: Q = I+C = S + E, 如果单位时间内进出游离氨基酸代谢库的量以(Q ) 表示, 同时再测定E 和I 的值, 便可以计算出蛋白质的合成速率( S ) 和分解速率(C ) 。
该模型成立的基本假设为: 1 ) 在实验期间代谢库大小是恒定的；2 ) 实验期间示踪原子的再利用可忽略不计；3) 游离氨基酸代谢库的其它消除途径, 除C 和E 外可忽略或校正。
测定蛋白质的需求量是的基本假设是，当机体的蛋白质量未达到基本生理代谢需求时，氨基酸主要用来合成机体的蛋白质, 一旦蛋白质达到并且超过了生理需要量, 那么摄入的氨基酸将会被机体所氧化, 从而导致该氨基酸的氧化率迅速升高, 在氨基酸氧化率对应氨基酸摄入量水平的量效曲线的拐点处所对应的饮食蛋白质量即为基酸的生理需要量。
根据检测过程不同，具体分为两种方法。
2.2氨基酸直接氧化法通过给予受试者不同水平的氨基酸剂量来检测氨基酸的氧化率的变化, 进而确定机体与所需氨基酸适宜量相应蛋白质量的一方法。
稳定同位素示踪需要对标记氨基酸的最终分解产物进行测量, 标记的碳原子可能现在各种不同的代谢产物中, 这使得解释起来很困难, 而且标记的羧基碳可能最终不通过呼吸排出，而是参与其它合成反应。
稳定同位素示踪技术概要
2. 将铵转化成氨气
在高真空气化装置中，用碱性次溴酸钠将铵氧
化而产生氮气，其反应式：
2NH4+ + 3NaBrO N2↑+ 5H2O + 3NaBr
四 、质谱法测定15N丰度
（一）质谱仪器的工作原理
利用电磁学原理，使带电粒子按照质荷
比进行分离，从而测定其质量的分析仪器。
·
M2 R2
R1 加速 V 电压
（二）15N质谱分析的计算公式
1. 质谱峰的选择 氮分子经电离后产生质量不同的离子：
离子种类 [15N15N]+ [15N14N]+ [14N14N]+ [15N]+ 和[15N15N]+ + [15N14N]+ + [14N]+和[14N 14N]++ 质荷比 30 29 28 15 14.5 14
由此可得：
（p + q）2 = p2 + 2pq + q2
其中： p2为质荷比为28的离子数目；
2pq为质荷比为29的离子数目。 也即： R =
p2 2pq p 2q
=
(4)
15N原子%
= = =
15N 14N
+
q
15N
× 100
p+q
1 2R + 1
×100 × 100
(5)
（5）式就是通用的以同位素离子强度
积累在豆株各部位的N素随着籽实的膨大
而进行再分配，从夹伸长期到籽实肥大 期，叶柄的N素最先开始运转。
Kunio 等应用13C标记13CO2 及15NO2的 双标记技术研究水稻植株从顶叶到根对C和 N的吸收及转移规律。结果表明：C和N从 叶到根的运转中，13C从喂饲叶运转到其它 器官需1天；15N通过喂饲叶片在几小时内迅 速运转。15N进入成熟根后再运转至新根及 鞘中，大量15N从叶运输到根后，最后累积 于新根中。
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af = 1.37-0.37 = 1.0%
∴ Ndff = ap/af = 0.3/1.0 = 30%
Npf = Np×Ndff = 30Kg/亩×30% = 9Kg/亩
施入尿素量：W = 20/40% = 80Kg/亩
肥料N素利用率：R = Npf/Nf= 9/20 = 45%
B.蒸馏：
用蒸汽蒸馏将消化液中NH3分离出来， 并测定总N。
方法：消化液中加过量40%NaOH,释放的NH3 被蒸汽逐出，经冷凝后被2%硼酸吸收，加 入混合指示剂用标准硫酸滴定（设置一个 标准液）。
此步骤将NH3-N转变成了NH4+-N（铵态N）， 仪器分析适宜量1mgN/样品2-3ml(浓缩或稀 释)。
the soil）:Ndfs
Ndfs =1- Ndff (4)
5、植物中来自肥料的N量: Npf
Npf=植物总N量×ap/af （5）
Npf+Nps=植物中总N量（已在定N中测定, K氏定N法）設总N来源于土壤和肥料，则：
6.植物中来自土壤N的量：Nps
Nps = 总N - Npf
(6)
7.N素利用率：R = Npf / Nf×100% (7) Nf：施入纯N的总量
以下在质谱仪上进行
C.将NH4+-N转化为N2气 :
在真空条件下，将上述样品与次溴酸钠 反应，放出N气（在质谱仪内进行）详 见书15N章节。
制样时注意：
1.所有试剂纯度要高。
2.消化要完全。
3.防止样品间交叉污染（每个样品 蒸馏前用蒸馏15ml乙醇洗器皿）。
4.“Y”型管及内部反应抽气须彻底， 防其它气体干扰。
八、 13C示踪法
1．样品的制备：
（ 1 ） 样 品 碳 转 化 为 BaCO3 ： 干 氧 化 法 （Pregl）: 如上图
1.对待测样品的要求：
(1) 因为测量的是不同质量离子流的相对含 量，因此，保证有一定的N量即可。一般要求 含N量1mg/ml最少不低于0.5mg。
(2) 仪器的本底检查。
(3)离子峰的选择（14N和15N的峰比28N、29N小 10倍，选28N、29N、30N）。
(4) 仪器精确度检查（检查去O2后的空气或 纯N气）。
一.稳定性同位素示踪法的基本依据：
1.自然界中一种元素同位素组成是相对恒定 2.同一元素的同位素具有相同的化学性质 3.同一元素的同位素之间存在质量差异
元素 H B C N O
重要化学元素的稳定性同位素
同位素
自然丰度
样品来源
1H
99.985
新鲜的表面淡水
2 H(D)
0.0147
10B
18.46
意大利天然硼酸盐
纯样品火焰为粉红色或淡黄色 有CO2呈白色，有水呈黄色）
注意：
如果是液体样品。需用Pyrex玻 璃管（1cm Φ 2mm）吸满样液，烘 干后再放入放电管。
CuO 、 CaO 使 用 前 用 700℃ 高 温 烘 干 除 去 CO2 ， H2O ， 并 在 1218Kg/cm2压力下制成棒状,备光谱 分析
生 物 固 氮 ： N2+6H++xATP 2NH3+xADP+xPi
6e-/ 固 氮 酶
下列研究方法：
1. 测根瘤数目和干物质产量。早、有无？
2. 氮素平衡法。十分烦琐。
3. 比较固N作物和非固N作物总N量差异。
4. 乙炔还原法。简单、灵敏。
5.乙炔还原成乙烯，存在转换因子（3个）。
6. 同位素法：
8.土壤A值：A值 =Ndfs / Ndff×Nf
(Kg/公顷) （8）
A值：表示土壤有效供应N素量(用A值可以解释 为什么某种土壤适合于种植某种植物)。
(来自：A值/Ndfs=Nf/Ndff)
9、N素回收率： R回 = 已检出的Nf量 / Nf×100% (9)
10、N素损失率：
R失 = 100% - R回
即某核在该组同位素中浓度(通常指人工加浓 了 的)。
自然丰度（Natural abundaa） A自(AO)
15N：0.365%、18O:0.204%
原子百分超（Atom percent excess） a
a = A-A自 又称富集度（Enrichment）
富集15N（Enriched15N） 贫化15N（Depeled15N )
3. 双标记化合物(一个同位素): H215N-CO-15NH2 尿素
4. 混合标记化合物: ( 15NH2)13CO (13C15N) 尿素
核素 A（%） 质量数
14N 99.635
14
15N 0.365
15
注意：由于同位素之间的质量差异，因此 它们的物理、化学、生物化学等性质会有 所不同，进行实验时，需注意同位素效应。
A值=Ndfs/Ndff×Nf=70%/30% ×20Kg/亩=46.7Kg/亩（土壤中可 供蕃茄生长的每亩有效N--当然不是全部被吸收,A值愈大说明土 壤的供N能力愈强）
15N示踪与生物固氮(以下各方法简讲)
工剂/业45固℃氮，（20H0a在be气r-压Bosc2hN反H3应）：N2+3H2 催化
①15N2还原法（Burris,1941）:充15N2密室进行
NdfA=a样/a气×100%
固氮量=NdfA×总N量 ②同位素稀释法（J、O、Legg等，1975），15N施入土壤
NdfA=1- a固/a非
③AN值法（M、Fried等，1975），田间种固N、非固N NdfA=(As + Afix - As) ×NdfF/Af As、Af、Afix分别代表土壤、肥料、大豆有效N量。 NdfF:来自肥料N素的比例。
2.植样的原子百分超: ap
ap = A-A自 （2）
（A自= 0.365%或空白实验值）
3.植物从肥料中摄取N的%: Ndff
植物中N有多少%是来自于肥料 （ Percentage of in the plant derived from the fertilizer），可以是根、茎、叶、
果实的任一Ndff
(10)
以上公式适用32P等放射性物质（以比强为单位）
等计算。
练习题： 蕃茄实验地中施用15N-尿素纯N20Kg/亩，收获后测得植物含N
量为30Kg/亩，植物样品的15N丰度为0.67%，15N-尿素的15N丰度为1.37%， 设自然丰度为0.37%，尿素的含N量为40%。
求：1、每亩施入尿素量？2、肥料N素的利用率？ 3.A值?
6. 近20年，稳定性核素示踪技术迅速发展，分离分析方 法取得了较大突破，13C、2H、18O、15N广泛应用于生物 学、医学、环保、农药、农学、微生物等研究领域。我 国先后分离了25种元素的100多种稳定性核素，例如： 15N标记化合物就有30余 种。
几个概念
稳定性同位素（Stable isotope） 丰度（Abundance） A
以下在光谱仪上进行,可用液体样 品也可用干样品
(2).杜马法（Dumas）
—光谱分析中常用法 适用于含N量低（少于100 μg） 的样品，光谱测量。
方法：
A．在放电管中装入样品，氧化剂（CuO） 及吸收剂（CaO）抽真空，抽完后熔封放 电管。
在马福炉中燃烧0.5-3h（560℃）样品， （CaO吸收CO2和H2O)以产生N2气。 B．冷却至室温后在光谱仪上测定
14N和15质量不同 质谱：把N2离子化为28N-N2，29N-N2 ，30N-N2 使其 在均匀磁场中发生不同角度偏转 2 光谱：28N-N2：谱线波长为2976.8埃
29N-N2：谱线波长为2982.9埃 30N-N2：谱线波长为2988.6埃
-
1800的均匀磁场
加 速
出口
电
入口
压
六.供仪器待测样品的制备、测量
第六章 稳定性同位素示踪法
概述：
1、1912年，Thomson首发现稳定性核素20Ne 和22Ne（氖）。 2、1929年，Naude发现了15N。
3、1937年，Urey等首次报道人工生产15N的 方法。
4、1940年，先后获得具生物意义的15N、18O 和3H大量生产。
5. 1947年9月在美国Wisconsin大学召开了“同位素 在生物学和医学中应用”专题讨论会，从此开始 了稳定性核素示踪技术应用的新纪元。
仪器分析方法步骤：
1、通电予热仪器10分钟，打开光电倍增管高压。 2、放电管装入燃烧室固定架上。 3、开高频发生器电源，使放电管中样品放电发光。 4、选择适宜放大倍数对28N、29N、30N峰分别进行 放大，在2970A0-2990A0之间扫描。 5、放下记录笔，接通扫描开关，划出28N、29N、 30N峰高。 6、求得平均峰高，计算15N丰度。
Nf：施纯N量 RN：N肥利用率
注意事项：
1.同位素交换反应：在一定条件下，标记 的铵盐可与大气发生反应：
15NH+4水溶液+14NH3→14NH+4水溶液+15NH3 15N丰度高时应注意。
2.同位素效应：藻类对14C、13C、12C的吸 收依次递减。
3.予测样品测定项目……
五、质谱和光谱测定15N原理
-
-
-
-
β-
7.1S
β-
4.15S
β-
0.63S
自然丰度
99.635 0.365
稳定性同位素标记物的命名
1978年国际纯化学和化学联合会IUPAC的命名 法:
1. 结构式: 15[N]HCl 物质不存在)
或15NHCl（这样純的
2. 单标记化合物: H215N-CO-NH2 15N-尿素， 例如15N的丰度可为5%，10%，15%……