总RNA提取,cDNA文库构建与基因克隆

Mg2+浓度

Mg2+对PCR反应的特异性和产量有显著影响；
Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异性 扩增。浓度过低会降低DNA聚合酶活性，使反应 产物减少。

PCR反应条件的选择

温度 时间 循环次数
温度设置

变性：90-95 ℃，温度过高会影响DNA聚合 酶的活性，温度过低则需延长时间使变性 充分；

操作步骤
1.匀浆 单位样品（50-100mg组织、3.5cm培养皿、5-10×106动植物细胞或酵母细胞、1×107细菌）加入 1mlTRIZOL，充分吹打和研磨（首先在2mlEP管中加入少量TRIZOL，将组织样品放入，用小剪刀尽 量剪碎，然后转移到研钵中充分研磨）。收集匀浆液，2-8℃，12000g离心10min。 2.分相（phase separation） 上清转移到新的1.5mlEP管，15-30℃放置5min，加入氯仿（0.2ml/1ml TRIZOL），盖好管盖，剧 烈摇动15秒，15-30℃放置2-3min。2-8℃，12000g离心15min。此时管内液体分为三层：上层，中 层和下层。RNA存在于无色上层水相（其体积大约为所用TRIZOL体积的60%，且其表面有一层脂 肪），中层为蛋白，红色下层为酚-氯仿相。 3.RNA沉淀 将上层水相转移到一个新的1.5ml离心管中（该步骤至关重要，尽量避免接触蛋白相和脂肪），加 入异丙醇（0.5ml/1ml TRIZOL）使RNA沉淀下来。15-30℃放置10min，2-8℃，12000g离心10min （离心前不可见，后成胶状沉淀）。提前将异丙醇4℃预冷，或混匀后-20℃放置60min提取效果更 好。 4.洗涤RNA 除去上层液体，加入75%乙醇（至少1ml乙醇/1ml TRIZOL）混匀，2-8℃，7500g离心5min （12000g离心后RNA不易溶解）。若RNA沉淀量多，可重复洗一次。 5.RNA重溶 弃去上层液体，将EP管在超净工作台通风片刻，凉干RNA（空气或真空干燥5-10min，不要真空离 心干燥。不能太干，否则影响溶解）。用适当体积的RNase-free水重新溶解所得RNA（所用体积要 根据RNA量确定）。取少量RNA用DEPC水稀释50倍测得率，取5ul跑电泳，其他-80℃保存。

简
介
SMART：Switching Mechanism At 5’ends of RNA Transcript Creator系统，利用Cre-LoxP技术可将一个目 的基因从单个供体质粒直接转入多种表达受 体质粒中，而无需进行亚克隆。
Creator
SMART cDNA 文库构建 原理
实验流程图


循环次数

循环次数：取决于模板DNA的浓度；
不同的仪器要摸 索一下最佳的循 环数。 此时获得的ds cDNA约2-3 μg/50 μ l。
1、2小结
容易遇到的问题
无ds cDNA产物
ds cDNA产物的片段偏小
分析 原因和 解决的办法
可能漏加反应成分，只能重做
起始材料RNA 可能降解、不纯，要重新制备RNA； 可能是浓度过低，则增加RNA的加量；可能是稳 定性差，就要更换制备RNA的方法。
Electrophorese a sample on a gel
Sfi I digestion
cDNA size fractionation
续上页
Ligate cDNA to pDNR-LIB vector
Transform cells and plate out
The unamplified library & check % recombinant clones


Creator SMART cDNA Library Construction Kit
利用SMART技术建库，可以得到全长的cDNA文库，也不需要 Adaptor的连接。 只需要少至25ng的mRNA或者50ng的Total RNA就可以得到高质 量、高产量的cDNA文库，更重要的是得到的cDNA能够代表原有 样品中的mRNA的丰度。
退火：根据引物的Tm值确定，一般退火温 度=Tm-5℃; 延伸:70-75℃，一般选择72℃。


时间设置

变性：30-60s，根据变性温度和模板基因长度确 定，普通PCR选择95℃变性30s即可； 退火:取决于引物的长度、碱基组成和浓度，一般 选择30-60s； 延伸：取决于模板基因的长度，常规体系72 ℃ 60s可延伸1000bp左右。
实验小结

保证获得数量足够的高质量的起始RNA。 反转录成功与否及反转录效率是关键中的关键。


层析柱cDNA分级很关键。这一步稍不注意会影 响获得的cDNA的片段分布特点。 质粒文库对载体与cDNA的连接效率要求很高， 也对连接产物转化大肠杆菌的效率要求很高。

基因克隆(PCR)

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）：简称 PCR，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以 特定引物为延伸起点，通过变性、退火和延伸等步骤，体 外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程，是一项 在短时间内大量扩增特定的DNA片段的分子生物学技术。
6、测定质粒文库滴度

计算菌落数来确定文库滴度
colonies on plate/ [plating volume(ml) x dilution factor] = cfu/ml
注意： 稀释后的文库会不够稳定，所以稀释之后要尽快在滴度降低之前进 行实验； 使用推荐的抗生素浓度的培养基，以确保质粒的稳定性； 通常情况下，用于长期保存的质粒文库滴度要达到108 cfu/ml 。
Amplify and titer library
1、第一链cDNA合成
50 ng of total RNA or 25 ng of poly A+ RNA

1 μg poly A+ RNA


适用于原始材料有限或 RNA较难获取的实验材料， 但是如果起始RNA越多， PCR的循环数则越少，这 样可以减少非特异性产物 的扩增； 反应体系相同；但进行下 一步时只需用2 μl的反转 录产物，其余可保存在-20 ℃冰箱内（3个月）
分级分离要注意的问题


尽可能只收集前三管，避免混入小片段，以免影 响载体连接，造成重组效率低。 如果经检测有小片段没有驱除干净，要重复双链 合成和分级分离的话，要注意: 不要让基质主体过干； 柱子室温储存备用； 不要有气泡； 双链混合物要混合均匀以免导致不能有效分离。
5、连接与转化
连接
转化
同时做阴性对照和阳性对照实验检测感受态细胞； 结果：阴性对照无菌落生长；阳性对照长满了菌落； 实验组平板上的菌落形成汇片，这样的平板可包含几千个菌落。
果实或种子：多糖/多酚
应用SMART技术构建cDNA文库
——Creator SMART cDNA Library Construction Kit
简介

cDNA文库：某种生物基因组转录的全部
mRNA经反转录产生的cDNA片段分别与克 隆载体重组，并将其引入到相应的宿主细 胞中（一般为E.coli.）繁殖和扩增，理论上 此群体就包含有该物种的全部mRNA信息， 称该生物基因组的cDNA文库。
50 ng of total RNA or 25 ng of poly A+ RNA 1 μg poly A+ RNA
Synthesize first-strand cDNA
Synthesize first-strand cDNA
cDNA Synthesis by LD PCR
cDNA Synthesis by Primer Extension
简介
cDNA文库构建的基本步骤：

总RNA提取；
逆转录合成cDNA第一链； cDNA第二链合成； 接头的加入； 酶切及载体连接； 导入宿主细菌； 文库的鉴定。
简 介


常规建库：
加adaptor，相应酶切后插入载体；低丰度或较长信息丢失； 加相同adaptor，因插入载体的方向性，可能有50%信息丢失； 加不同adaptor，双酶切问题影响产率。 表达框架问题，正向插入后的正确产物几率1/3。
酶
根据实验目的选择合适的酶： 普通Taq酶 高保真酶 长片段酶等 一个典型的PCR反应约需酶量2.5U（总反应体积为 100ul） 浓度过高引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物 量减少
模板


模板基因的完整性是PCR反应成功的关键； 模板纯度尽量高，避免脂类和蛋白质污染； 模板量要适中，浓度过高或过低均不利于PCR反 应； RNA模板要防止降解，PCR过程中用专门试剂，且 需加入RNA酶抑制剂。
几种分子生物学常规实 验技术介绍
王义鹏 2013年10月9日
主要内容
RNA提取 cDNA文库构建 基因克隆（PCR）
RNA提取
Trizol法提取RNA
试剂和耗材准备


Trizol试剂 氯仿 异丙醇 75%乙醇（DEPC处理水配制） Βιβλιοθήκη BaiduEPC处理水 枪头、PCR管（购买商品化产品或DEPC水浸泡）
PCR原理
变性：95 ℃
退火：60℃
延伸：72℃
PCR反应五要素

引物（primer）
酶（DNA polymerase）


dNTP（dATP, dGTP, dCTP, dTTP）
模板（template） Mg2+（magnesium）


引物-PCR特异性反应的关键



引物长度15-30bp； G+C含量：40%-60%； Tm值与G+C含量有关，通过调整G+C含量使Tm值处于6070℃； ATGC随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶成串排列； 引物3’末端的碱基要求严格配对，且最末端核苷酸避免用 腺嘌呤A； 避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补； 特异性引物/兼并引物
LD PCR中获得ds cDNA产 物产量低或没有 可区分的 亮带
1、循环数不够，可导致产量低或片段大小<4 kb 或<2-3 kb，增加循环数。 2、第一链cDNA的产量低或起始的RNA 量不足， 导致产量低，从头开始。 3、如果整个smear比较亮而不可区分，可能是循 环数太多，少2-3个循环重新合成第二链。 4、电泳所用的琼脂糖凝胶也可能改变条带亮度， 建议用1XTAE，1.1%-1.2%琼脂糖，电压60-90V。 对于哺乳动物来源的RNA可能因结构复杂而无亮 带；增加2-3个循环来重复引物延伸步骤；电泳所 用的琼脂糖凝胶也可能改变条带亮度，建议用 1XTAE，1.1%-1.2%琼脂糖，电压60-90V。
4、cDNA片段的分级分离
应用CHROMA SPIN-400 Column





上样前的准备：混匀柱子内的基质，去除气泡； 去除底部封口，液体自然流出至流干，直 到看到基质处于1 ml刻度处； 流速大约1滴/40-60 sec，每滴大约40 μl。 当储备液流干后，加700 μl 缓冲液洗柱子。 上样：当缓冲液停止流出15-20 min后，加入样品液。 洗涤：保证样品完全吸附于柱内，再加入缓冲液洗涤。直至 液滴停止，此时染料带进入柱子几毫米处。 洗脱：准备好回收管，加入600 μl 缓冲液开始回收 （16）。 检测：每管3 μl 电泳，150V 10 min。 回收：收集包含cDNA的前三管。浓缩、沉淀后，7 μl 溶解。
引物延伸法获得的ds cDNA 没有可区分的亮带
3、蛋白酶K消化与酶切



所用的ds cDNA的量为50 μl，加入2 μl蛋白 酶K消化，使DNA聚合酶失活。 进行纯化，沉淀ds cDNA时，注意要加入室 温下的95%乙醇，且室温下离心，不要在 离心前将试管置于冰上，以免因低温导致 杂质的共沉。 酶切后加入2 μl 1%的二甲苯氰，作指示剂。


适用于RNA 易于获得的实 验材料，但使用少于0.5 μg或大于2.0 μg的Poly A+ RNA 会降低克隆效率； 在终止第一链合成反应之 后，加入1 μl的NaOH，然 后68℃下保温30 min。 在下一步反应中，全量 （ 11 μl ）加入进行第二 链的合成。
2、合成ds cDNA
LD PCR法扩增cDNA 引物延伸法合成双链cDNA