禽畜肉中氯霉素残留量的液质联用分析方法_冯雷

Determination of Chloramphenicol Residues in Meat by HPLC-MS
FENG Lei，YIN Li-zhu，SUN Wen-tong，LI Bo，MA Xue-tao (Yunnan Product Quality Supervision and Testing Center, Kunming 650223, China)
GL-12B高速离心机 上海安亭科学仪器厂；N-EVAP 氮吹仪 美国 Organomation 公司；CPA225D 电子天平 德国 Sartorius 公司；B-400 均质机 瑞士 Buchi 公司； LC-MS-2010A 液相色谱 - 质谱联用仪(色谱柱 Shim-pack VP-ODS C18 150mm × 2.0mm，保护柱为 Shim-pack GVPODS C18 5mm × 2.0mm，色谱工作站为 LC-MS Solution 色谱工作站) 日本岛津公司。 1.3 仪器工作条件
E-mail：fenglei16@hotmail.com
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食品科学
※分析检测
１ 材料wk.baidu.com方法
1.1 材料与试剂 鸡肉样品，购于农贸市场。 氯霉素标样 美国 Sigma 公司；乙腈、甲醇、正
己烷(均为色谱纯) 美国 Fisher 公司；超纯水；乙酸乙 酯、氨水、无水硫酸钠等( 均为分析纯) 。 1.2 仪器与设备
Abstract：A new analytical approach using HPLC-MS was developed for the determination of chloramphenicol residue in meat.
Samples were extracted with ethyl acetate, and the resulting extract was blown to dryness under nitrogen. Subsequently, the
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高氯酸溶解样品残渣，但实验中发现使用高氯酸溶解样 品残渣虽然可以除去蛋白质，但却会严重影响氯霉素在 质谱中的响应灵敏度。实验中比较了高氯酸和水分别溶 解样品残渣，发现使用水溶解样品残渣要比使用高氯酸 时氯霉素的信噪比高 10 倍，可能是高氯酸的存在会抑制 氯霉素在 ESI 源中的离子化效率。 2.4 定量回归方程及相关系数
本研究开发一种无需衍生化，采用高效液相色谱 电喷雾质谱联(LC-ESI-MS)用系统直接分析禽兽肉中的氯 霉素方法，采用质谱定性和定量，以期能准确对样品 的氯霉素残留量进行检测。
收稿日期：2009-05-13 作者简介：冯雷( 1 9 7 9 —) ，男，工程师，硕士，研究方向为食品中农兽药残留、非法添加物的分析。
氯霉素(chloramphenicols，CAP)属胺苯醇类抗生 素，由 Ehrlich 等在 1947 年首次从微生物代谢产物中分 离得到，目前用人工方法合成，已广泛用于动物各种 传染性疾病的治疗[1]。但是氯霉素有严重的副作用，它 能抑制人体骨髓造血功能而引起再生障碍性贫血症和粒 状白细胞缺乏症等疾病[2]，因此动物性食品中的氯霉素 残留对人类的健康构成了潜在的危害。美国仅允许氯霉 素用于非食用动物，规定在动物性食品中不得检出氯霉 素，欧盟(EEC)规定在鸡蛋和乳牛中禁止使用氯霉素，在 鸡肉、肝、肾中的氯霉素残留量不得超过 0.01mg/kg[ 。 2-3] 由于检测技术与国外先进检测机构存在一定差距，我国 常常遇到出口食品氯霉素超标问题，每年出口损失高达 数十亿美元[2]。因此研究一种高效、灵敏的氯霉素残留 量检测方法势在必行，对我国的进出口贸易以及人民的 食品安全意义重大。
表 １ 氯霉素的梯度洗脱程序 Table 1 Gradient elution program
时间 /min
0.0
3.0
乙腈体积分数 /% 20
20
6.0
8.5
50
50
9.0 15.0
20
20
1.4 标准溶液的配制 准确称取 10mg 氯霉素标准样品于烧杯中，用甲醇
溶解定容至 100mL，得到 100μg/mL 的标准溶液，稀释 1000 倍后得到 100ng/mL 的标准溶液储备液。逐级稀释 得到标准工作溶液。标准溶液需避光保存在－ 18℃的冰 箱中可稳定 6 个月。 1.5 样品前处理
信号强度(× 104)
321.10
30
25
20
15
10
5
311.05
0
327.10
347.05
300 310 320 330 340
m/z
图 １ 氯霉素 ＥＳＩ（－）质谱图
Fig.1 MS spectrum of chloramphenicol
氯霉素分子式为 C11H12Cl2N2O5，相对分子质量为 323.13(平均相对分子质量)，从其分子结构看在 ESI 源中 易失去一个氢原子而带负电荷，因此选择 ESI 负离子模 式对其进行检测。氯霉素 ESI(-)质谱图见图 1。其分子 中含有氯元素，因此对其同位素准分子离子峰(m/z 321.10， m/z 323.05)同时进行选择离子扫描，定性时根据两个准分 子离子峰的信号强度之比(m/z 321.10/m/z 323.05)为 3:2 时 (误差范围 10%)确定其为阳性样品，定量时则根据 m/z 321.10 的准分子离子峰的强度进行定量计算。 2.3 样品前处理
实验中比较了液液萃取方法和固相萃取方法，发现 两种方法回收率相差不大，但固相萃取方法回收率重现 性不好且样品前处理成本较高，因此采用液液萃取的方 法对样品进行前处理。氯霉素易溶于甲醇、乙醇、乙 酸乙酯、丙酮等有机溶剂，实验中分别采用以上几种 溶剂作为萃取溶剂对样品中的氯霉素进行萃取，发现使 用乙酸乙酯时样品回收率较高且样品中的干扰物质较 少，因此选择乙酸乙酯作为样品前处理萃取溶剂。在 氮气吹干乙酸乙酯后许多文献方法中选择用 0.5mol/L 的
色谱条件：流动相 A 为 0.1%(V/V)醋酸溶液，流动 相 B 为乙腈，流动相梯度见表 1，流动相流速为 0.5mL/ m i n ，柱温 3 0 ℃，进样量 1 0μL 。
质谱条件：LC-MS 接口为电喷雾接口(ESI)负离子 模式，离子监测模式为选择离子扫描模式(SIM)，选择 监测氯霉素的准分子离子峰([M － H]－)及同位素峰，即 m/z 321.1 和 m/z 323.05 的离子。喷雾口电压为－ 1.5kV， 喷雾气和干燥气为氮气，喷雾气流速为 1.50L/min，干 燥氮气(反吹)压力为 0.2MPa，曲线脱溶线(CDL)电压为 10.0kV，CDL 温度为 250℃，模块温度为 200℃。
禽畜肉中氯霉素残留量的测定方法有酶联免疫法[4]、
气相色谱法[5]、气质联用法[6]、液相色谱法[7]和液质联用 法[8-9]等多种方法。酶联免疫法具有快速简便的特点，但 仅适用于样品的快速筛查，在定性及定量的准确度方面 存在一定的局限性。气相色谱法和气质联用法均需要对 氯霉素样品进行衍生化才能进行分析，其前处理繁琐且 耗时较长。对于食品中氯霉素残留的液相色谱检测，采 用光谱方法进行检测容易出现假阳性检测结果，如果采 用质谱进行检测就可以大大降低假阳性检测结果的检出 率。液质联用系统是残留分析的理想手段，对于需要 高灵敏度、宽适用范围、复杂基质的残留检测，液质 联用无疑是首选的最佳检测手段[10]。
residue left was dissolved in water, defatted with n-hexan. Finally, the water phase was harvested and filtrated through 0.2 μ m
membrane for HPLC-MS analysis. The chromatographic separation was achieved on a C18 column with a mobile phase consisting
the requirements for rapid analysis of large-batch samples.
Key words：chloramphenicol；HPLC-MS；analysis
中图分类号：TS251.7
文献标识码：A
文章编号：1002-6630(2010)04-0243-03
取鸡肉样品约 200g 于均质机中磨碎均质后称取 5g (精确至 0.01g)，置于 50mL 聚丙烯离心管中，加入 15mL 乙酸乙酯，0.5mL 氨水。均质混匀后在旋涡振荡器上混 合 30s，然后超声波提取 10min。以 6000r/min 的转速离 心 5min，上清液转移至 50mL 比色管中，如此反复提取 3 次，合并萃取液。萃取液经 10g 无水硫酸钠干燥后在 50℃水浴中将乙酸乙酯萃取液氮吹浓缩至 10mL 以内时将 其转移至 10mL 比色管中继续氮吹浓缩至干。向 10mL 比 色管中加入 2mL 水和 2mL 正己烷，漩涡混合 30s 后待其
配制氯霉素质量浓度分别为 1.0、4.0、8.0、20.0、 50.0ng/mL 的标准工作溶液，依次进样后以峰面积为 Y 轴、质量浓度为 X 轴，进行线性回归得到氯霉素的定 量方程为 Y=9106.8X － 512.3，相关系数 R2=0.9998。 2.5 方法精密度、回收率及检出限
实验以未检出氯霉素的猪肉作为空白样品，采用空 白样品加标进行回收率的测定，分别进行了 1 、5 、2 0 μg/kg 三个水平的空白加标样品进行回收率实验，每个 水平做 5 次平行试验，得到平均回收率及相对标准偏差 见表 2。以信噪比(RSN)等于 3 时计算氯霉素的最低检出 限为 0.1μg/mL，以信噪比(RSN)等于 10 时计算氯霉素的 定量限为 0.3μg/mL，根据取样量以及定容体积可计算出 样品中的检出限和定量限分别为 0.04μg/kg 和 0.12μg/kg。 说明此方法回收率、精密度基本令人满意，检测限可 以到达发达国家的氯霉素限量要求。
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禽畜肉中氯霉素残留量的液质联用分析方法
冯 雷，尹丽珠，孙文通，李 波，马雪涛
(云南省产品质量监督检验研究院，云南 昆明 650223)
摘 要：研究一种针对禽畜肉中氯霉素残留量的液质联用分析方法。采用乙酸乙酯萃取样品中的氯霉素，氮吹后 用水溶解样品残渣，然后用正己烷除去样品溶液中的脂肪，对样品中的目标物进行净化前处理。以乙腈 - 体积分 数 0.1% 醋酸溶液作流动相，C18 色谱柱对食品中的氯霉素残留进行分离，然后用电喷雾质谱负离子选择离子模式[ESI ( - ) -S I M ] 对氯霉素进行检测。本方法缩短了色谱分离时间，提高了检测灵敏度和分析结果可靠性，具有准确、快 速以及灵敏度高的特点，能够适应大规模样品的快速分析要求。 关键词：氯霉素；液质联用；分析
of acetronitrile and 0.1% acetate. ESI(-)-SIM mode was adopted for the detection of chloramphenicol. The developed approach
is characterized by short time consumption for chromatographic separation, high sensitivity and good reliability so as to meet
静置分层，用吸管吸弃正己烷；再分两次加入正己烷重 复上述操作，除去样品中的脂肪。最后将水相部分过 0.2μm 滤膜后即可进样分析。
２ 结果与分析
2.1 色谱条件优化 实验中比较了不同流动相对分离度、峰形、灵敏度
等的影响。发现对于水相来说，用体积分数 0.1% 的醋酸 溶液比用水作为水相流动相时氯霉素的信噪比要高 5 倍， 也比用 0.5% 的醋酸溶液或是 0.1% 的氨水灵敏度要高，可 能是 0.1% 的醋酸溶液作为流动相时氯霉素在 ESI(-)源中离 子化效率较高的原因。而有机相用乙腈比用甲醇时的氯霉 素峰形更好，与其他干扰物质的分离度也较好，而且使 用乙腈作为有机流动相更有利于 ESI 源中溶剂去除。因此 试验中采用了 0.1% 醋酸溶液 - 乙腈的流动相体系。 2.2 质谱条件的选择