真核表达系统与原核表达系统比较
外源基因在动物细胞中的表达
外源基因在动物细胞中的表达随着基因工程技术的不断发展，外源基因的应用范围也越来越广泛。
其中，外源基因在动物细胞中的表达，为研究生物学、医学等领域提供了很多帮助和便利。
一、外源基因的引入和表达在外源基因的引入和表达中，主要有两种方法：转基因和转染。
1. 转基因转基因是将外源基因直接引入动物细胞的染色体或质粒中，并整合到宿主细胞基因组中。
这种方法的好处是可以实现长时间的稳定表达，但是其过程较为复杂，需要进行较多的实验操作。
同时，还有一定的安全性问题需要考虑。
2. 转染转染是将外源基因通过化学、物理等手段引入到细胞内。
这种方法的优势在于操作简单，效率高。
但表达时间较短，需要反复转染才能实现长时间的表达。
二、外源基因的表达系统外源基因的表达主要分为两种系统：原核表达系统和真核表达系统。
其中原核表达系统是应用较多的一种，包括细菌表达和酵母表达等。
1. 原核表达系统细菌表达是利用大肠杆菌等细菌对外源基因高效表达的一种方法。
其主要优势在于速度快、表达量大，同时可以大规模制备蛋白质。
但其缺点也比较明显，外源蛋白可能被别的蛋白降解，所得的蛋白酶解产物活性也可能较低。
酵母表达主要是利用酵母对外源基因高效表达的特点来制备目标蛋白。
相比细菌表达，酵母表达的外源蛋白在折叠和修饰方面更加接近哺乳动物细胞的翻译后修饰，因此适用于制备复杂、大分子量的蛋白质。
2. 真核表达系统真核表达系统是指利用哺乳动物细胞对外源基因表达的一种方法。
它具有结构相对复杂、修饰更接近哺乳动物细胞的翻译后修饰的特点。
常用的真核表达系统包括：哺乳动物细胞的原代细胞、转染细胞、稳定细胞系等。
它们也各自有其优缺点：哺乳动物细胞的原代细胞表达效率高，但生长速度较慢、易受污染；转染细胞操作简单，表达效率较高，但表达时间有限、稳定性差；稳定细胞系可以长时间表达，并且表达和生存稳定，但难度较大。
三、外源基因的应用1. 科学研究外源基因的应用在科学研究领域中尤为重要。
蛋白质表达系统介绍不同的蛋白质表达系统及其优缺点
蛋白质表达系统介绍不同的蛋白质表达系统及其优缺点蛋白质表达是生物学研究中一项重要的技术，它可以通过合成蛋白质来研究其结构和功能。
蛋白质表达系统是实现这一过程的关键工具，主要包括原核表达系统和真核表达系统两种。
本文将对这两种蛋白质表达系统进行介绍，并分析它们的优缺点。
一、原核表达系统原核表达系统是利用原核生物（如大肠杆菌）来表达外源蛋白质的系统。
该系统具有以下特点：1. 高表达水平：大肠杆菌是常用的原核表达宿主，具有高表达水平的优势。
通过利用原核细胞的强大蛋白质合成机器，可以获得高产量的外源蛋白质。
2. 易操作性：原核表达系统相对简单，操作步骤少，易于操作和控制。
不需要复杂的细胞培养条件，可以在常见培养基中进行表达。
3. 快速表达：从启动表达到获得蛋白质通常只需要数小时至数天，速度较快。
这使得原核表达系统在高通量表达和快速实验中具有优势。
然而，原核表达系统也存在一些缺点：1. 外源蛋白质折叠问题：由于原核细胞的机器无法正确折叠某些复杂蛋白质，这可能导致外源蛋白质的不正确折叠和失活。
2. 原核特异性翻译后修饰：原核细胞缺乏一些真核细胞所具有的翻译后修饰机制，这可能影响蛋白质的功能和稳定性。
3. 复杂蛋白质表达困难：对于复杂蛋白质（如膜蛋白），原核表达系统通常无法达到理想的表达水平和正确的折叠结构。
二、真核表达系统真核表达系统主要利用真核生物（如酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞）来表达外源蛋白质。
真核表达系统具有以下特点：1. 正确的折叠和修饰：真核细胞具有复杂的蛋白质折叠和修饰机制，能够产生正确折叠和修饰的蛋白质。
2. 适用于复杂蛋白质：真核表达系统适用于复杂蛋白质（如膜蛋白）的表达。
真核细胞提供了正确的环境和细胞器，能够较好地表达这类蛋白质。
3. 适用于大规模表达：真核细胞通常可以进行大规模培养和表达，适用于工业化生产。
然而，真核表达系统也存在一些缺点：1. 低表达水平：相对于原核表达系统，真核表达系统的表达水平较低，可能无法满足高产量蛋白质的需求。
真核生物和原核生物的区别比较
汇报人： 202X-01-06
目录
• 细胞结构 • 基因结构与表达 • 生殖方式 • 生活环境与适应性
01
细胞结构
细胞核
1
真核生物拥有一个或多个细胞核，而原核生物没 有细胞核。
2
真核生物的细胞核具有明确的核膜，而原核生物 没有核膜，其DNA裸露，不和蛋白质结合。
3
THANKS
感谢观看
真核生物的细胞器具有特定的功能和 结构，而原核生物的核糖体同时承担 多种功能。
02
基因结构与表达
基因结构
真核生物的基因组结构复杂，通常包含 多个染色体，而原核生物的基因组结构 相对简单，通常只有一个环状的染色体 。
真核生物的基因中存在内含子，而原核生物 的基因中不存在内含子。内含子是指在基因 编码序列中无意义的重复片段，在转录过程 中会被剪切掉。
真核生物的细胞核中有染色质，而原核生物没有 染色质。
细胞膜
真核生物的细胞膜由磷脂和蛋白质组 成，具有流动镶嵌模型，而原核生物 的细胞膜较简单，主要由磷脂组成。
真核生物的细胞膜具有多种功能，如 物质运输、信号转导等，而原核生物 的细胞膜功能相对较简单。
细胞器
真核生物具有多种细胞器，如线粒体 、叶绿体、内质网等，而原核生物只 有核糖体一种细胞器。
原核生物
原核生物通常通过简单的二分裂方式进行繁殖，不涉及配子结合的过程。
无性生殖
真核生物
真核生物也可以进行无性生殖，如通过 孢子、分株、出芽等方式进行繁殖。
VS
原核生物
原核生物的无性生殖方式主要是通过简单 的二分裂方式进行，即细胞分裂时，遗传 物质随机分配到子细胞中。
遗传重组
真核生物
生物技术制药课后思考题
第一章：绪论思考题1.什么是生物技术？生物技术所包含的内容及定义。
答：1）生物技术又称生物工程，指人们以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其他基础学科的科学原理，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需产品或达到某种目的的技术。
2）包括基因工程、细胞工程、发酵工程、酶工程、蛋白质工程、抗体工程、糖链工程、海洋生物技术及生物转化等。
（具体定义见P1）。
2.生物技术药物的概念及分类。
答：1）指采用DNA重组技术或其他生物技术生产的用于预防、治疗和诊断疾病的药物，主要是重组蛋白或核酸类药物。
2）a.按照用途：预防、诊断、治疗；b.按作用类型：细胞因子类、激素类、酶类、疫苗、单克隆抗体类、反义核酸、RNA干扰类、基因治疗药物；c.按照生化特性：多肽类、蛋白质类、核酸类、聚乙二醇化多肽或蛋白质。
3.生物技术药物在理化性质、药理学与作用、生产制备和质量控制方面的特性。
答：1）理化性质（从药物多是蛋白质或核酸出发）：a.相对分子质量大；b.结构复杂；c.稳定性差；2）药理学作用：a.活性与作用机制明确；b.作用针对性强；c.毒性低；d.体内半衰期短；e.有种属特异性；f.可产生免疫原性；3）生产制备特性：a.药物分子在原料中含量低；b.原料中常存在降解目标产物的杂质；c.制备工艺条件温和；d.分离纯化困难；e.产品易受有害物质污染；4）质量控制特性：a.质量标准内容的特殊性；b.制造项下的特殊规定；c.检定项下的特殊规定。
4.生物技术制药的概念和主要研究内容与任务。
因工程、细胞工程等生物技术的原理和方法，来研究、开发和生产预防、治疗和诊断疾病的药物的一门科学。
2）主要研究内容与任务：a.生物制药技术的研究、开发与应用；b.利用生物技术研究、开发和生产药物。
第二章：基因工程制药思考题1.简述基因工程制药的基本原理和基本流程。
答：1）利用重组DNA技术将外源基因导入到宿主菌或宿主细胞进行大规模培养和诱导表达以获取蛋白质药物的过程称为基因工程制药。
原核与真核基因表达比较
目录
• 引言 • 原核生物基因表达特点 • 真核生物基因表达特点 • 原核与真核基因表达差异比较 • 原核与真核基因表达互作关系 • 研究展望与意义
01
引言
目的和背景
揭示原核与真核基因表达的差异
通过比较原核生物和真核生物在基因表达调控机制、转录和翻译过程等方面的 异同，深入理解生物进化的本质和复杂性。
宿主环境
真核生物作为宿主，其内部环境可能 对原核生物的基因表达产生影响，如 pH值、温度、营养条件等。
免疫应答
真核生物的免疫系统可以识别并应答 原核生物的感染，从而影响原核生物 的基因表达。生物与真核生物之间可以建 立共生关系，彼此之间的基因表 达会相互影响，以达到共同生存 的目的。
转录延伸
在原核生物中，RNA聚合 酶在DNA模板上持续合成 RNA链，直到遇到终止信 号。
转录终止
原核生物的转录终止通常 涉及rho因子等蛋白质， 帮助RNA聚合酶从DNA模 板上脱离。
翻译过程
01
翻译起始
延伸过程
02
03
翻译终止
原核生物的翻译起始需要特定的 起始因子和核糖体小亚基的结合。
在原核生物中，延伸因子帮助氨 酰-tRNA进入核糖体的A位，并 促进肽键的形成。
表观遗传调控
真核生物具有复杂的表观遗传调控机制，如DNA甲基化、组蛋白修饰和染色质重塑等，这些调控机制可以影响基因 的表达和细胞的命运。而原核生物则缺乏类似的表观遗传调控机制。
信号传导与基因表达调控
真核生物的信号传导途径与基因表达调控密切相关，可以通过信号分子和受体的相互作用来调节基因的 表达。而原核生物的信号传导途径相对简单，通常不涉及复杂的信号分子和受体的相互作用。
原核生物真核生物基因表达比较
08
40s小亚基首先与Met-tRNA(Met上角标）相结合
09
再与模板mRNA结合
10
最后与60s大亚基结合生成起始复合物
肽链合成起始:
原核生物肽链合成的延长：
进位: 氨基酰-tRNA按照mRNA模板的指令进入并结合到核蛋白体A位 2. 成肽:转肽酶催化，核蛋白体P位上起始氨基酰-tRNA转移到A位，与A位上氨基酰-tRNA的α-氨基结合形成肽键 3. 转位转位酶催化，核蛋白体向3´-端移动一个密码子的距离，使mRNA上下一个密码子进入核蛋白体A位、而占据A位的肽酰-tRNA移入P位 延长因子: EF-Tu EF-Ts EF-G
真核生物：转录起始需要启动子 、RNA聚合酶和转录因子的参与。 少数几个反式作用因子的搭配启动特定基因的转录 真核生物RNA-pol不与DNA分子直接结合，而需依靠众多的转录因子，形成转录起始复合物。
转录延长：
转录终止：
依赖ρ因子的转录终止 非依赖ρ因子的转录终止 Ρ因子
真核生物的转录终止：在超出千百个核苷酸后停顿， 转录后修饰有多聚腺苷酸（poly A）尾巴结构加进去 。在读码框架下游常有一组公共序列AATAAA 及 GTGTGT序列，这些序列称为转录终止修饰点。
真核延长过程与原核基本相似 但有不同的反应体系和延长因子：eEF-1α eEF-1βγ eEF-2 真核细胞核蛋白体没有E位，转位时卸载的tRNA直接从P位脱落
核蛋白体A位出现mRNA的终止密码子后，多肽链合成停止，肽链从肽酰-tRNA中释出，mRNA、核蛋白体大、小亚基等分离。
原核生物终止阶段需要释放因子RF-1、 RF-2和 RF-3参与
核蛋白体包括 rRNA(核糖体RNA) 和蛋白质，直径为 20-25nm,真核细胞的核蛋白体比原核细胞的大。
蛋白质表达技术在药物研发中的应用
蛋白质表达技术在药物研发中的应用蛋白质是生命体中不可或缺的基本分子，主要用于构成细胞、组织和器官等，并参与各种生命过程。
在医药研发中，蛋白质也是一种重要的研究对象。
事实上，许多药物都是通过对蛋白质的研究和利用开发出来的。
因此，掌握蛋白质表达技术，将有助于更好地开发新型药物。
“表达”是生物学中的一种重要术语，指的是生物体将基因转录成mRNA，再将mRNA翻译成蛋白质的过程。
在药物研发中，蛋白质表达技术主要指利用生物工程手段，将目标蛋白质的基因导入外源细胞中，使其进行表达并获得目标蛋白质的技术。
蛋白质表达技术可以在可控的条件下，大量高效地表达特定的蛋白质。
因此，蛋白质表达技术被广泛应用于药物研发领域中。
一、蛋白质表达技术在药物研发中的应用1.药物分子筛选药物分子筛选是开发新药物的关键步骤之一。
通常情况下，研究人员需要筛选大量分子，寻找对特定蛋白质具有亲和力的合适药物分子。
这个过程通常需要大量的目标蛋白质，而利用蛋白质表达技术可以大量高效地表达目标蛋白质。
2.药物效应评价药物效应评价是药物研发的重要步骤之一。
利用蛋白质表达技术，可以制备出大量高纯度的目标蛋白质，以进行药物效应评价。
这些研究可以更好地了解药物分子与特定蛋白质之间的相互作用，探究药物作用机制，发现新型药物。
3.药物显性配体鉴定药物显性配体鉴定通常是基于一些已知的蛋白质结构来进行的。
在这种情况下，需要对目标蛋白质进行表达和纯化，以便进一步进行X光晶体学分析和结构解析。
在这个过程中，蛋白质表达技术成为了必不可少的工具。
二、蛋白质表达技术的种类1.原核表达系统原核表达系统指的是表达目标蛋白质的细菌系统。
这种表达系统具有高效、简单、便宜的优点。
但是，由于原核表达系统无法进行翻译修饰和蛋白质折叠，某些蛋白质表达时需考虑到这些因素的影响。
2.真核表达系统真核表达系统指的是表达目标蛋白质的真核细胞系统，如哺乳动物细胞系统、酵母细胞系统、虫卵细胞系统等。
生物制药技术中的表达系统研究
生物制药技术中的表达系统研究生物制药技术一直是医药行业的热门领域，在制药过程中，表达系统的研究是非常重要的一部分。
表达系统是生物制药技术中利用细胞合成目标蛋白的关键工具。
目前，表达系统主要被用于制造重要的药物和生物制剂。
1. 表达系统的概念和分类表达系统是通过改变细胞或微生物的基因，使其能够合成一个目标蛋白质的过程。
表达系统主要有两大类：原核表达系统和真核表达系统。
前者是指以细菌、酵母菌、噬菌体等微生物作为表达的载体的表达系统，后者是指以哺乳动物、昆虫、真菌等真核细胞作为表达载体的表达系统。
其中，细菌表达系统应用最为广泛。
2. 细菌表达系统的研究现状目前，大肠杆菌是最常用的细菌表达系统。
因为其简单易操作、高效、低成本、质量稳定等显著优势。
大肠杆菌表达系统的原理主要是：将细胞质中的基因组 DNA 转化为 RNA，然后将 mRNA翻译成蛋白质。
研究表明，大肠杆菌表达系统可以实现许多不同的表达目的，如疫苗生产、技术嵌入、工业酶生产等。
此外，大肠杆菌表达系统在改进和增强中也有很大的发展空间。
目前，研究人员正在进行大肠杆菌表达系统的优化，以提高表达效率并改善产品质量。
例如尝试提高细胞中目标蛋白质的产量，新的表达载体的设计和改进等。
3. 真核表达系统的研究进展在真核表达系统中，以哺乳动物作为载体的表达系统应用最为广泛。
目前，最常用的哺乳动物表达系统是CHO细胞。
CHO细胞是一类美国老鼠卵巢细胞，其表达性能优越，具有较高的表达效率和高质量的表达产物。
除此之外，人类胚胎肾细胞（HEK）是另一种被广泛应用的真核表达载体。
这种类型的表达系统能够产生大量的蛋白质，并且可快速扩展，更加适合于大规模的制剂生产。
总的来说，生物制药技术中的表达系统的研究对于医疗行业的发展起着非常重要的作用。
通过对表达系统的研究，我们能够使得生产更加高效、快速、有效。
另外，还可以提高医药制品的质量和稳定性，为医疗卫生行业提供更高质量的药品和治疗方案。
毕赤酵母表达经验总结
毕赤酵母表达经验总结甲醇酵母表达系统有不少优点，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表达系统最为人熟知，并广泛应用于外源蛋白的表达。
虽然说酵母表达操作简单表达量高，但是在实际操作中，并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的。
不少人在操作中会遇到这样那样的问题，生物通编者特地收集了部分用户在使用EasySelect Pichia Expression System这个被誉为最简单的毕赤酵母表达的经典试剂盒过程中的心得体会。
其中Xiang Yang是来自美国乔治城大学（Georgetown University）Lombardi癌症中心（Lombardi Cancer Center），部分用户来自国内。
甲基酵母部分优点与其他真核表达系统比较与原核表达系统比较1.属于真核表达系统，具有一定的蛋白质翻译后加工，有利于真核蛋白的表达优点-+2.AOX强效启动子，外源基因产物表达量高，可以达到每升数克表达产物的水平++++3.酵母培养、转化、高密度发酵等操作接近原核生物，远较真核系统简单，非常适合大规模工业化生产。
+++=4.可以诱导表达，也可以分泌表达，便于产物纯化。
=+5.可以甲醇代替IPTG作为诱导物，部分甲醇酵母更可以甲醇等工业产物替代葡萄糖作为碳源，生产成本低+++++ 表示优胜于；- 表示不如；= 表示差不多EasySelect Pichia Expression System产品性能：优点——使用简单，表达量高，His-tag便于纯化缺点——酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题全面产品报告及心得体会：巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种，一方面由于其是属于真核生物，因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰，另一方面毕赤酵母生长速度快，可以将表达的蛋白分泌到培养基中，方便蛋白纯化。
毕赤酵母表达载体pPICZ在多克隆位点（MCR）3'端带有his-tag和c-myc epitopes，这些tag有利于常规检测和纯化，而且在MCR5'端引入了alpha factor（α-factor）用以增加表达，并且在表达后α-factor 可以自动被切除。
利用原核和真核系统在重组蛋白质表达中的比较
利用原核和真核系统在重组蛋白质表达中的比较当今生物科学领域中，蛋白质表达技术的发展一直备受关注。
利用原核和真核系统来重组蛋白质，是常见的两种方法。
这两种系统在蛋白质表达中有着各自的优势和适用范围。
一、原核系统的蛋白质表达原核系统主要指大肠杆菌（Escherichia coli，简称E.coli）等细菌，并且是最常用的蛋白质表达系统之一。
原核细胞具有复制速度快、易于培养、表达量高等特点，使其成为研究人员的首选。
在原核系统中，通常使用表达载体质粒将目标基因插入到细菌细胞中，并利用细菌自身的转录、翻译系统来实现蛋白质的合成。
在表达载体上，一般包含启动子、转录终止子、选择性标记等功能元件，以控制目标基因的表达和纯化。
原核系统的蛋白质表达具有高效、简便、经济等优势。
然而，由于原核细胞的风险素材含量高，存在内源性的蛋白质翻译后修饰机制有限等局限，某些复杂蛋白质的表达可能会受到限制。
二、真核系统的蛋白质表达真核系统主要指哺乳动物细胞（如CHO细胞）、昆虫细胞（如Sf9细胞）等，相对于原核系统，真核系统具有更接近生物体内蛋白质表达的环境，更能实现复杂蛋白质的表达。
在真核系统中，常用的蛋白质表达包括稳定转染和瞬时转染两种方式。
稳定转染是将目标基因整合到宿主细胞的基因组中，从而实现长期稳定的表达。
而瞬时转染则是将目标基因引入宿主细胞的质粒中，通过短时间高表达来获得大量蛋白质。
真核系统的蛋白质表达能够实现更多的翻译后修饰，如糖基化、磷酸化、乙酰化等。
这些修饰对于某些蛋白质功能的发挥至关重要。
此外，真核细胞中包含更多复杂的蛋白翻译机制和分子伴侣蛋白，有利于蛋白正确折叠和纯化。
然而，真核系统的蛋白质表达过程更为复杂，所需时间和成本也相对较高。
此外，真核细胞具有更严格的质控机制和蛋白降解系统，蛋白质的表达稳定性较差。
三、原核与真核系统的比较原核和真核系统的选择应根据具体的研究目的和需求。
如果目标是表达小分子量、水溶性和结构简单的蛋白质，原核系统是较好的选择。
原核表达系统
-原核表达系统一．表达系统：基因工程中用来获得有功能的异源蛋白质的体系，包括克隆载体，表达载体及受体细胞。
据受体细胞的不同可分为：1．原核表达载体系统：将外源基因引入原核细胞，并使其在原核细胞中以发酵形式快速高效地表达合成基因产物的体系。
2．真核表达系统：使外源基因在真核细胞中表达。
二．原核生物基因结构和表达特点1．原核生物染色体DNA是裸露的环形DNA，其转录和翻译是偶联的连续进行。
2．原核生物形成多顺反子mRNA：mRNA在合成过程中和多个核糖体结合，翻译形成多条肽链。
（图）多顺反子mRNA（polycistronic mRNA）：即可作为两个或多个肽链翻译模板的mRNA。
3．一般不含内含子（intron），没有转录及翻译后加工系统。
4．原核生物中功能相关的基因串联在一起，形成操纵子。
操纵子（operon）：是一组功能上相关，受同一调控区控制的基因组成的一个遗传单位。
1）原核生物基因表达的基本单位（即一个转录单位）。
共同协调作用，完成某一多肽的表达调控。
2）包括调控区：调节基因，启动基因，操作基因。
结构基因：5．原核生物中参与转录的基因结构：1）启动子：是DNA上的一段序列，是RNA聚合酶识别并结合部位。
各种不同的原核细胞其启动子各有不同，但均含有下列两个高度保守区（富含AT：易变性解离为单链，为RNA合成提供模板）（1）TATA box（-10区，pribnow box）：转录启始点上游10bp处一段富含AT的碱基TATATTA（2）-35区：长度和顺序个体间差别很大，富含AT是RNA聚合酶识别位点。
转录的启始：RNA聚合酶首先识别启动子的-35区并结合至启动子上，然后开始滑向转录起始点，到-10区时，RNA聚合酶与启动子结合更牢固，并继续向前滑行，大约6-7bp后开始转录（转录起始位点）。
即RNA聚合酶识别并结合启动子，但并不转录（图）。
各种启动子启动转录能力不同。
启动子强弱取决于-35区和-10区的碱基组成及其间隔序列。
生物大分子的生产和纯化技术研究
生物大分子的生产和纯化技术研究生物大分子在生物技术领域中扮演着重要的角色，包括多肽、蛋白质、抗体、核酸等。
它们通常是由生物体中的细胞或器官内分泌分子、代谢物或病原体产生的，具有广泛的应用前景。
然而，如何快速、高效地生产和纯化生物大分子，一直是制约其应用的关键。
本文将围绕这一课题展开讨论。
一、生物大分子的生产技术生物技术已成为现代生命科学的主要分支之一，其核心在于将自然界中的生物分子进行检测、提取、合成、修饰、鉴定和应用。
这其中，生物大分子的生产是制定生物技术研究计划的重要环节。
常见的生物大分子生产技术有以下几种：1、原核表达系统细菌可以高效地表达大量的异源蛋白质，因此原核表达系统成为了最常见、最普遍的表达系统。
常见的原核表达系统有E. coli，Bacillus subtilis，Pseudomonas fluorescens等。
E. coli表达系统是目前广泛应用的，由于主机易于培养和大规模生产，而且具有较高的表达效率。
可以通过不同的表达载体来选择不同的启动子、信使RNA、连接器和标签，调节靶蛋白的表达量和纯度，并实现对多肽、蛋白质和抗体结构和功能的重组和改造。
2、真核表达系统真核表达系统适用于对膜蛋白、糖蛋白、酶和激素等复杂蛋白质的表达。
常见的真核表达系统有酵母菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞等。
酵母表达系统具有高表达量、易操作、可大规模生产等优点。
哺乳动物细胞能够产生正确的蛋白质，并且在翻译、转运和修饰方面具有真正的生物学特性。
昆虫细胞能够表达膜蛋白和糖蛋白，并能够以低成本获得高纯度蛋白质。
3、泛微生物表达系统泛微生物表达系统可用于在单个细胞系统中表达多组分蛋白质，并能够同时进行多重显微镜成像和生物发光实验，具有应用前景。
4、植物表达系统植物表达系统成本低廉，表达蛋白质的速度快，并且具有较好的免疫原性。
但是，植物表达的蛋白质需要进行复杂的糖基化修饰。
二、生物大分子的纯化技术获得高纯度的生物大分子对于其后续研究和应用具有重要的意义。
重组蛋白的高效表达及纯化技术研究
重组蛋白的高效表达及纯化技术研究随着生物技术的发展，蛋白表达与纯化技术在医疗、工业以及科学研究等领域中扮演着越来越重要的角色。
其中，重组蛋白的高效表达及纯化技术是蛋白质学研究的关键环节之一。
本文旨在探讨目前被广泛应用的几种重组蛋白表达及纯化技术，以及它们的新进展与应用前景。
一、背景介绍重组蛋白指的是通过基因重组技术将人工合成的DNA片段引导到细胞中，使其在受到特定刺激后大量表达特定功能蛋白的一种新型蛋白质。
由于其具有高度专一性、易制备性以及更高的效力和安全性，越来越多的药物被开发为基于重组蛋白的生物制剂。
二、重组蛋白表达技术1. 原核表达系统原核表达系统是将DNA片段导入大肠杆菌等细菌中，在其形成菌落的过程中进行表达。
该系统的优点在于表达速度快、操作简便、表达产量高。
但同时，由于原核表达与真核细胞中的表达相比，它对于蛋白翻译辅助因子和蛋白修饰等生物特征的模拟程度较差，不利于蛋白的正确折叠，因此该系统表达的蛋白质通常需要经过重新折叠处理。
2. 原核表达系统与原核表达系统相比，真核表达系统更接近真实情况中的表达方式，对于全长的蛋白大多数时候能够实现正确的折叠。
在真核表达系统中，常用的系统包括昆虫细胞、哺乳动物细胞以及酵母菌表达系统等。
其中，哺乳动物细胞表达系统能够实现高产量、高质量的蛋白质表达，因此被广泛应用于蛋白质制备。
三、重组蛋白纯化技术1. 亲和层析法亲和层析法是一种将目标蛋白质从混合物中分离出来的技术。
该技术的依据是一种特定的与目标蛋白质具有相互作用的配体分离柱。
在该技术中，目标蛋白质与配体分离柱上的特定功能团结合，非特异性的蛋白质能够在洗脱过程中被去除。
2. 总体分离法总体分离法是将目标蛋白从混合物中分离出来，采用离心、可溶性和非可溶性的分离方法。
其中，在采用可溶性分离的方式时，常用的方法有两相法、分配层析等。
四、新兴技术及应用前景近年来，3D打印技术的应用逐渐渗透到生物医疗领域，并开始用于制备组织工程器官和人造蛋白质等领域。
蛋白质表达系统的选择原核与真核细胞的比较
蛋白质表达系统的选择原核与真核细胞的比较蛋白质表达是生物学研究中至关重要的实验技术之一，它可以帮助科学家们生产大量特定的蛋白质，并且进行进一步的研究。
在进行蛋白质表达时，科学家们可以选择将目标基因表达于原核或真核细胞中。
本文将对原核细胞和真核细胞的差异进行比较，分析选择适合的蛋白质表达系统的几个关键因素。
1. 细胞结构差异原核细胞是没有真核细胞特有的细胞核和复杂的胞器结构的单细胞有核生物。
相比之下，真核细胞的细胞结构更加复杂，包括细胞核、线粒体、内质网等。
这些细胞器的存在使得真核细胞在蛋白质表达过程中能够进行更多的后续修饰和折叠，从而获得更高的蛋白质表达效率。
2. 转录与翻译差异在原核细胞中，DNA转录和蛋白质合成是同时进行的。
因为没有细胞核的隔离作用，转录和翻译可以在细胞质中同时进行。
而在真核细胞中，DNA转录发生在细胞核中，形成的mRNA需要通过核孔复合体进入细胞质，然后才能进行翻译。
这种分离的过程使得真核细胞蛋白质表达的效率相对较低。
3. 后续修饰能力差异真核细胞拥有更强大的后续修饰能力。
在蛋白质合成过程中，真核细胞能够进行糖基化、磷酸化、酰化等修饰作用，从而赋予蛋白质更多的功能和稳定性。
相比之下，原核细胞的后续修饰能力较弱，只能进行有限的修饰。
4. 表达量与成本差异原核细胞的表达系统通常能够提供较高的表达量，因为它们能够在较短的时间内合成大量的蛋白质。
此外，原核细胞的培养成本相对较低，适用于大规模生产。
真核细胞在表达大蛋白质时效率较低，而且培养成本相对较高。
综上所述，选择表达系统需要考虑具体实验要求。
如果需要大量表达，可以选择原核细胞，如大肠杆菌。
原核细胞表达系统的优势在于高表达量和低成本。
而如果需要进行复杂的后续修饰，以及模拟真实细胞环境的蛋白质表达，则可以选择真核细胞，如酵母或哺乳动物细胞。
真核细胞表达系统的优势在于能够进行复杂的蛋白质修饰和得到更接近自然状态的蛋白质。
此外，还可以根据实验需求进一步优化表达系统，例如引入特定的启动子或基因调控元件来提高表达效率和稳定性。
常见蛋白表达系统的比较
哺乳动物细胞
CHO、HEK293、COS、BHK、SP2/0、NIH3T3.
产品的抗原性、免疫源性和功能与天然蛋白质最接近，糖基化等后加工最准确，表达水平较低。
发酵液中的目的产物含量：0.2-200mg/L。
外源蛋白占菌体总蛋白量：10%-30%。
真核生物
酵母
酿酒酵母
兼具原核细胞良好的可操作性和真核系统的后加工能力，但存在产量低及过度糖基化等问题。
外源蛋白占菌体总蛋白量：约10%。
甲醇营养型酵母
巴斯德毕赤酵母
第二代酵母表达系统，部分克服了利用酵母表达的过度糖基化缺点，有较好的分泌性，产量较高，但产品结构与天然分子仍有一些差异。
外源蛋白占菌体总蛋白量：10%-30%。
昆虫杆状病毒系统
病毒：AcNPV、BmNPV
昆虫：sf9细胞
具有高等真核生物表达系统的优点，产品的抗原性、免疫原性和功能与天然蛋白质相似，表达水平较高，但其糖基化程度较低，形式较为单一。
发酵液中目的产物含量：1-500mg/L。
植物细胞
植物根分泌、叶分泌
植物易于大规模培养和生产，在基因表达与修饰及安全性方面有特别的优势，但转基因植物制作费时，表达量较难提高，分离纯化不便。
常见蛋白表达系统的比较
在生物学研究中，重组蛋白的研究越来越受到关注，而重组蛋白最为重要的莫过于表达系统的选择。蛋白表达系统是指用模式生物如细菌、酵母、动物细胞或者植物细胞表达外源基因蛋白的一种分子生物学技术。常的蛋白表达系统分为原核表达系统和真核表达系统，具体又可以细分多种，每一种有各自的优缺点。在此，小编给大家整理了各表达系统间的差异，供大家参考。
表达系统
代表工程菌株
蛋白表达形式
蛋白表达形式
蛋白表达形式主要有以下几种：
1. 原核表达系统：原核表达系统是最早被开发的蛋白表达途径之一，主要利用大肠杆菌（E.coli）作为宿主细胞。
该系统具有操作简单、表达量高等优点，适用于小分子量蛋白的表达。
在原核表达系统中，常用的表达载体包括质粒和噬菌体。
质粒表达途径通过将目标蛋白编码基因插入质粒中，然后将质粒导入宿主细胞，利用宿主细胞的代谢机制表达目标蛋白。
噬菌体表达途径则利用噬菌体感染宿主细胞，将目标蛋白编码基因插入噬菌体基因组中，然后利用宿主细胞的机制表达目标蛋白。
原核表达系统的主要限制是无法表达复杂的蛋白质结构和糖基化蛋白。
2. 真核表达系统：真核表达系统利用真核细胞作为宿主细胞，可以表达复杂的蛋白质结构和糖基化蛋白。
常用的真核表达系统包括酵母表达系统和哺乳动物细胞表达系统。
酵母表达系统主要利用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或毕赤酵母(Pichia pastoris)等作为宿主细胞。
除此之外，还有分泌型表达载体、带纯化标签的表达载体、表面呈现表达载体、带伴侣的表达载体等多种表达形式，并且每种表达形式都有其独特的特点和应用场景。
基因工程中的基因克隆与表达
基因工程中的基因克隆与表达基因工程是一门涉及分子生物学、遗传学、生物化学等多个学科的综合性科学。
其中，基因克隆和基因表达是基因工程研究的两个重要方面。
本文将就基因克隆和基因表达的原理、方法及应用进行探讨。
一、基因克隆1.原理基因克隆是指将目标基因从其天然基因组或其他来源中分离出来，并将其插入到另一个载体（如质粒）中，使其能够在宿主细胞内复制和表达。
基因克隆的原理是基于DNA序列特异性杂交的方法，利用限制性内切酶切割目标DNA和载体DNA，然后将它们黏合在一起，形成重组DNA。
通过转形或感染，使重组DNA 进入宿主细胞内，并复制和表达。
2.方法基因克隆的方法主要有限制性酶切与黏合（RE-Mediated Ligation）、PCR（聚合酶链反应）、TA克隆和基因文库等。
限制性酶切与黏合是一种常用的基因克隆方法。
该方法利用限制性内切酶切割DNA，然后通过T4 DNA连接酶黏合在一起。
这种方法操作简单、效率高，但存在限制内切酶的局限性，无法应用于不同酶切位点的DNA。
PCR是用于复制DNA片段的重要方法，也可以用于基因克隆。
PCR方法可以在不使用限制酶的情况下，从任何源提取DNA片段，扩增需要的基因段，并使用酶切和连接技术插入到载体中。
TA克隆是指用于从PCR产物中克隆DNA的一种方法。
该方法利用了Taq聚合酶不完全特异性合成3'-末端斜伸的性质，使产生的末端序列与T自带的A进行互补配对，从而使PCR产物能够被直接连接到TA克隆载体上。
基因文库是一种重要的基因克隆技术，可以将许多目标基因同时克隆入同一载体中。
基因文库分为cDNA文库和基因组文库。
通过荧光筛选或选择性培养，可以从文库中筛选出感兴趣的基因。
3.应用基因克隆技术广泛应用于基因工程、疫苗制备、药物研发、作物改良、动物遗传改良、环境污染治理等领域。
例如，利用基因克隆技术可以创造出超级细菌、工业用酶、新型药物、高产优质作物等。
二、基因表达1.原理基因表达是指基因通过转录和翻译的过程，将DNA序列转化为蛋白质的过程。
原核生物表达载体
•
增强子
启动子(promoter, P)
指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基 因转录的一段DNA序列。
• 一般长40-60bp，富含A-T碱基对 • 具有保守序列：
-10区（pribnow box）：TATAAT
-35区：RNA聚合酶的δ因子的识别位点
RNA聚合酶保护区 结构基因
5 3 5
分泌型表达载体----pINIII-ompA1
分泌型融合表达载体----pEZZ18
六．提高表达水平的手段 1、选择合适载体，提高翻译水平 • 强启动子----提高转录水平
• 核糖体结合位点（ATG---SD）
• 避免产物降解 ：分泌/融合表达 细菌蛋白酶抑制剂
2、选择合适宿主
Lac 启动子----LacI菌 PL/PR -------- CI857 溶源菌 3、诱导表达 温度诱导------PLPR / IPTG的化学诱导----Plac、Ptac 4、提高表达蛋白的稳定性，防止被宿主降 解
DNA本身
生殖细胞、
体细胞、个体
基因工程的目的是使目的基因能高效表达。 基因表达受DNA结构、蛋白质因子与核酸相互辨 认、结合等组成的表达体系的调控。 基因表达调控可在转录、转录后修饰、翻译、翻 译后修饰等水平进行 基因工程载体的构建必需应用表达调控的基本理 论知识，应用已知的调控序列进行重组、改造。
第四章 原核生物表达载体
表达系统：
基因工程中用来获得有功能的异源蛋白 质的体系，包括克隆载体，表达载体及 受体细胞。
据受体细胞的不同可分为： 1．原核表达系统： 将外源基因引入原核细胞，并使其在原 核细胞中以发酵形式快速高效地表达、 合成基因产物的体系。
2．真核表达系统：使外源基因在真核细 胞中表达的体系。
生物制药工程：第二章 第七节 基因表达
• the space between cell membrane and cell wall.
分泌到细胞周间隙中 的重组蛋白质
LOGO
特点：
读码框架固定: The target gene does not need start
Quantity of target protein
in cell, units
IPTG addition
LOGO
Where your expressed protein will be located?
Nothing
Recombinant protein may be hydrolyzed by proteinases
Purify and Identify the protein
问题： 是不是所有基因都可以在E.coli中表达？
SDS-PAGE
Western Blot Analysis
LOGO
外源基因在原核细胞表达的必要条件：
1. 删除内含子和5’非编码区 2.外源基因置于强启动子和SD顺序控制下 3.维持正确开放阅读框架（ORF） 4.mRNA稳定且可有效转译，形成的蛋白质
影响目的基因的转录和翻译效率
干扰基因载体的复制等生物学功能
增加受体细胞的无效能量消耗 LOGO
2、原核表达质粒的类型：
成熟型 ------天然完整蛋白
融合型 -----融合蛋白 分泌型 ----分泌性蛋白
减少原核细胞对外 源蛋白的降解
LOGO
表达载体。 ④生理代谢途径及基因表达调控机制比较清楚。 ⑤不具备真核生物的蛋白质加工系统，表达产物无特定的空
间构象。 ⑥内源蛋白酶会降解表达的外源蛋白，造成表达产物的不稳
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系统又分为毕赤酵母表达和酿酒酵母表达。针对真核表达系统来说，哺乳动物细胞和酵母表达较为常用。
针对其各自的优缺点，如下：
真核系统和原核系统各自优缺点：
表达系统
系统优缺点
系统蛋白表达方式 优点
缺点
表达的蛋白活性高， 瞬时转染
能够快速灵活的制 蛋白表达量低，大
能够表达多复杂修饰
备活性蛋白
量生产成本极高
哺乳动
的蛋白；
稳定细胞系构建 筛选出的细胞株能 细胞株筛选困难且
真 核 表 达 物细胞
需要细胞房，无菌，
够实验蛋白的大量 时间长，投入大
系统
成本投入高
生产
重组抗体表达
比普通单抗生产量 需筛选细胞株，需
有保证
耗时耗力
酵母表
与哺乳动物相比只能 毕赤酵母表达
甲醇诱导操作方面 需要时间
达系统
表达简单修饰的蛋白 酿酒酵母表达
更多蛋白表达系统比较，原理与常见问题解决和标准试验操作资料，请见： /topics/dan-bai-biao-da.html 我们会不断更新补充，欢迎收藏！
Tel: (025) 5889- 4959
Order@
不常用Biblioteka 不常用昆虫表不常用
达系统
原 核 蛋 白 大 肠 杆 菌 操作简单。表达量高；
表达系统 表达
易形成包涵体，蛋白活性物保证
Tel: (025) 5889- 4959
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枯 草 芽 孢 不常用
杆菌表达
链霉菌
不常用
活性蛋白整体方案
Active Protein Solutions
活性蛋白整体方案
Active Protein Solutions
真核表达系统比较
体外重组蛋白表达系统主要分为真核表达系统和原核表达系统。其中原核表达系统以大肠杆菌表达为主，
也是目前应用最广泛最多的表达系统。真核表达系统分为：哺乳动物细胞表达，酵母表达系统和昆虫表达
系统。其中哺乳动物细胞表达又分为哺乳动物细胞瞬时转染表达和稳定细胞系构建，重组抗体生产。酵母