紫外可见分光光度法测定维生素B2
维生素b2生物利用度实验报告
维生素b2生物利用度实验报告一、荧光试验1、方法原理维生素B2（核黄素）具芳香环和杂环，有长共轭结构的π-→π＊跃迁，具有荧光性，在酸、碱性条件下及加入各种还原剂均会使维生素B2（核黄素）转变为无荧光的物质。
2、试剂和材料盐酸溶液：1＋2.氢氧化钠溶液：40g／L。
连二亚硫酸钠。
3、分析步骤取约0.05g实验室样品，加100mL水溶解后，溶液显淡黄绿色并有强烈的黄绿色荧光；加盐酸溶液，摇匀后，黄色即消褪，荧光亦消失。
二、紫外-可见吸收光谱鉴别1、方法原理维生素B2（核黄素）具苯环结构，有多个共轭双键，其紫外-可见吸收光谱中有三个吸收峰（444nm，375nm与267nm），用A444mm ／A267mm及A375mm／A267mm的比值来鉴别维生素B2（核黄素）。
2、试剂和材料冰乙酸。
乙酸钠溶液：14g／L。
实验室样品溶液：取约0.075g实验室样品，精确至0.001g，置烧杯中，加1mL冰乙酸与75mL水，加水稀释，冷却至室温，移置500mL棕色容量瓶中，再加水稀释至刻度，摇匀。
3、仪器和设备紫外-可见分光光度仪。
石英池（1cm）。
4、分析步骤取实验室样品溶液扫描，点击光谱扫描，设定波长范围，测出光谱曲线，在波长444mm±1nm、375nm±1nm与267nmtlnm处有最大吸收，并测定吸光度（A），计算A375mm／A267mm的比值为0.31～0.33和A444m／A267mm的比值为0.36～0.39.5、测定结果A373/A267=0.342/1.039=0.33A445/A267=0.404/1.039=0.39三、维生素B2的测定1、方法原理维生素B2（核黄素）具苯环结构，有多个共轭双键，在波长444nm 处有最大吸收，将样品溶液于该波长处测定吸光度，以百分吸光系数（E／m）计算即得其质量分数。
2、试剂和材料冰乙酸。
乙酸钠溶液：14g／L。
3、仪器和设备紫外-可见分光光度仪。
维生素B1、B2的测定方法比较
维生素B1、B2的测定方法比较比较维生素B1、B2含量测定方法。
方法：采用紫外分光光度法中三种不同方法测定维生素B1、B2含量。
结果：1、按 E 值测标示量维生素B1：98.3 ± 2.51，维生素B2：94.8 ±0.308，复合维生素B片中维生素B1:102.1± 1.70，维生素B1平均回收率为100.4%，RSD为2.13%(n=6)，维生素B2平均回收率为94.9%，RSD为6.5%(n=6)。
2、标准曲线法维生素B1、B2浓度分别在3～18、1～8μg/ml范围内，均呈良好线性关系，标示量分别为：102.9±0.661，98.4±0.152。
3、双波长法测维生素B1标示量：94.2±1.97。
结论：三种方法用于维生素B1、B2含量测定，操作简便、快速、准确，精密度好。
近年来对维生素B1、B2测定方法报道较多，如高效液相色谱法[1,2]、流动注射化学发光法[3]、多元线性分光光度法[4]、荧光分光光度法[5]、毛细管电泳电化学法[6]、氧瓶燃烧电位滴定法[7]等。
这些方法操作麻烦、时间较长。
本文采用紫外分光光度法中按 E 值测定法、标准曲线法和双波长分光光度法，测定维生素B1、B2含量，并将三种方法进行比较。
三种方法均操作简便、快速、准确。
1 仪器和材料仪器：722型分光光度计DU-7紫外—可见分光光度计材料：维生素B1、B2对照品(购自Sigma 公司) ；维生素B1片(批号：20021202) 维生素B2片(批号：20021288-02)；复合维生素B片(批号：20021283-02)三种片剂均为昆明制药股份有限公司产品；冰醋酸、盐酸、氢氧化钠均为分析纯。
2 试验及结果2.1 维生素B1含量测定2.1.1 按E 值测定维生素B1标示量取本品 1 0 片，精密称取、研细，精密称取适量(约相当于维生素B125mg)，加盐酸(9 →1000)约70ml，振摇15min使之溶解，再加盐酸(9→1000)定容至100ml，摇匀，用干燥滤纸过滤，精密量取滤液5 m l，用盐西装盐酸(9 →1000)稀释至100ml，摇匀，扫描得最大吸收波长为246nm(图1)，在该波长处测定吸光度，按其吸收系数( )为421计算：A 为供试品在246nm 波长处测得的吸光度；D 为稀释倍数；W 为维生素B1片的平均片重；W样为称取的维生素B1片粉重；S标为标示量，测定结果(X ±SD)：98.3±2.51(n=7)。
维生素b2片含量及含量均匀度测定方法的研究
维生素b2片含量及含量均匀度测定方法的研究
维生素B2片含量及含量均匀度测定方法是利用酶法测定维生素B2片中维生素B2含
量及含量均匀度的一种测定方法。
通常采用UV波长292nm和AOAC法测定维生素B2片中
的维生素B2含量及含量均匀度，可用于维生素B2的质量控制和检验。
该测试方法具有较高的准确性，受试者可就地进行测定，只需使用分光光度计、标准
溶液和混合谱instrument即可处理完整批次，能有效数据传输，量程可调，自动选择批次，具有精确快速的数据处理能力，该测试方法为优质维生素B2片的质量控制提供了帮
助和支持。
本试验在pH为7.0的硫酸氢钠溶液中，将试样片重量折合为3mg，经混合后加入测定烧杯中，加入2ml硝酸氢钠50g/L的溶液，然后加入4ml硫酸十六氢羟基苯甲酰溶液，离
心后备用，再加入1ml琥珀酸钠溶液和LL微量盐晶，搅拌均匀后再离心，用淸洁的纯水
洗涤清洗1次，加入2ml洗涤液及2ml硝酸氢钠50g/L溶液，离心后备用，取滤液到新测
定烧杯中，加入2ml硝酸氢钠50g/L溶液，备用，再加入3ml硫酸十六氢羟基苯甲酰溶液，离心后得出测定结果。
实验34荧光光度法测定新鲜蔬菜中维生素BB2的含量
实验34荧光光度法测定新鲜蔬菜中维生素BB2的含量实验34 荧光光度法测定新鲜蔬菜中维生素B 0bc 2的含量一、实验目的1．了解分子荧光分析法的原理。
2．掌握用荧光法测定维生素B 2的原理以及荧光激发和发射最佳波长的确定。
3．熟悉荧光分光光度计的基本操作方法。
二、实验原理常温下，处于基态的分子吸收一定的紫外可见光的辐射能成为激发态分子，激发态分子通过无辐射跃迁至第一激发态的最低振动能级，再以辐射跃迁的形式回到基态，发出比吸收光波长长的光而产生荧光。
在稀溶液中，荧光强度I F 与物质的浓度c 有以下关系：F 2.303I I φε=当实验条件一定时，荧光强度与荧光物质的浓度成线性关系：F I Kc =这就是荧光光谱法定量分析的理论依据。
维生素B 2（又称核黄素，简称V B2）是机体中许多重要辅酶的组成部分，它在生物氧化中起着重要作用。
当人体缺乏V B2时，代谢作用发生障碍。
V B2易溶于水，在470 nm 蓝光的照射下，发出绿色荧光，荧光峰在550 nm 左右。
V B2在pH = 6～7的溶液中荧光强度最大，在碱性溶液中，V B2经光线照射会发生分解而转化为光黄素，光黄素的荧光比核黄素的荧光强的多，故测V B2的荧光时溶液要控制在酸性范围内，且在避光条件下进行。
三、主要仪器与试剂1．仪器荧光分光光度计。
2．试剂乙酸溶液（5%），NaOH 溶液（1 mol·L －1），HCl 溶液（1 mol·L －1），KMnO 4溶液（3%，长时间不用的情况下，在使用前应过滤），H 2O 2（30% V/V ），冰乙酸，新鲜蔬菜（如菠菜、芹菜、油菜、青蒜等）。
V B2标准贮备溶液（100 mg·L －1）：准确称取25 mg V B2，用5%的乙酸溶液溶解，转移至250 mL 容量瓶中，并用5%的乙酸溶液稀释至刻度，保存于冰箱中。
四、实验步骤安全预防：乙酸有刺激性；盐酸具有腐蚀性；氢氧化钠具有强腐蚀性，若溅到皮肤上或眼中，应立即用水冲洗，或用硼酸水冲洗。
软饮料中维生素b2的测定方法
软饮料中维生素b2的测定方法软饮料中维生素B2的测定方法维生素B2是一种重要的复合维生素，主要参与人体代谢和新陈代谢，能改善机体免疫功能，增强机体抗病能力。
它不仅对人体的正常生理功能有重要作用，而且在食品中也具有重要的功能。
因此，许多企业在生产软饮料时都会注意添加适量的维生素B2，以提高食品的营养价值。
为了保证添加的维生素B2含量符合相关标准，必须进行准确的测定。
一、软饮料中维生素B2的测定原理维生素B2测定是利用它与乙酸二铵发生变色反应，当维生素B2参与变色反应时，乙酸二铵会形成紫色物质，紫色物质的浓度与维生素B2的浓度成正比关系，所以，可以利用紫色物质的浓度来测定维生素B2的浓度。
二、软饮料中维生素B2的测定步骤1.准备试剂乙酸二铵溶液，用0.1mol/L的稀硝酸溶液配制；维生素B2标准溶液，用浓硝酸溶液配制，浓度为0.01g/L；磷酸氢二铵试液，用0.02mol/L磷酸铵溶液配制；溴水溶液，用溴水溶液配制，浓度为0.2g/L。
2.样品处理将待测样品倒入容量瓶中，加入适量的乙酸二铵溶液，摇匀后，加入适量的磷酸氢二铵试液，摇匀后，再加入适量的溴水溶液，摇匀，放置10min，紫色物质的浓度即为维生素B2的浓度。
3.测定用可见光分光光度计检测紫色物质的浓度，波长选择550nm。
4.计算以标准曲线计算维生素B2的浓度，即待测样品中维生素B2的浓度。
三、软饮料中维生素B2的测定注意事项1.试剂的准备在准备测定试剂时，应注意试剂的种类，浓度和比例，以免影响测定结果的准确性。
2.样品的处理对于待测样品，应注意使用时间、温度、pH值等因素，以保证样品的稳定性。
3.测定装置的清洁在测定前，应清洗可见光分光光度计，以免测定装置上残留的物质影响测定结果的准确性。
4.校准曲线在测定前，需要先建立标准曲线，以保证测定结果的准确性。
以上就是关于软饮料中维生素B2的测定方法的介绍，根据以上介绍，可以看出，维生素B2的测定是一个比较复杂的过程，需要准备合适的试剂，并且注意样品的处理，以及测定装置的清洁，建立标准曲线等，只有按照以上步骤进行测定，才能保证测定结果的准确性。
维生素B2含量的测定方法--荧光分光光度法
维生素B2含量的测定方法--荧光分光光度法含量测定为例介绍荧光分光光度法测定维生素Ｂ2含量的以饲料中维生素B2方法。
采用标准：GB/T5009.85——2003，本标准规定了饲料中维生素B2测定方法。
1.1方法原理（即核黄素C17H20N4O6）在440nm紫外光激发下产生绿色荧光，维生素B2在一定浓度范围内其荧光强度与核黄素浓度成正比。
用连二亚硫酸钠还原核黄素成无荧光物质，由还原前后荧光强度之差与内标荧光强度的比值，计算样品核黄素的含量。
1.2试剂和溶液除特殊规定外，本标准所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水或相应纯度的水。
1.2.1盐酸溶液，0.1mol／L，将8.5mL盐酸（GB 622）用水稀释至1000mL。
1.2.2盐酸溶液，1mol／L，将85mL盐酸用水稀释至1000mL1.2.3氢氧化钠溶液，1mol／L，将40gNaOH（GB 629）溶于水定容至1000mL1.2.4冰乙酸（GB 676）。
1.2.5冰乙酸溶液，0.02mol／L：将1.8mL冰乙酸用水稀释至1000mL。
1.2.6高锰酸钾（GB 643）溶液，40g／L。
1.2.7过氧化氢（HG 3─1082）溶液，100mL／L。
现用现配。
1.2.8核酸素标准溶液核黄素贮备液Ⅰ：将核黄素于五氧化二磷干燥器中干燥24h，称取0.0500g，溶解于0.02mol／L乙酸溶液（3.2.5）中，在蒸汽浴上恒速搅动直至溶解，冷却后稀释至500mL。
盛入棕色瓶滴加甲苯覆盖，低温（4℃）保存。
该溶液每毫升含0.1mg核黄素。
核黄素贮备液Ⅱ：取核黄素贮备液Ⅰ10mL用0.02mol／L乙酸溶液稀释至100mL，盛于棕色瓶中滴加甲苯覆盖，低温（4℃）保存。
该溶液每毫升中含10μg 核黄素。
核黄素标准工作液：取核黄素贮备液Ⅱ10mL，用水稀释至100mL。
现用现配。
该溶液每毫升中含1μg核黄素。
1.2.9荧光素标准溶液1.2.9.1荧光素贮备液：称取荧光素（Q／HG 22─786）0.0500g，用水稀释至1000mL，盛于棕色瓶中，低温（4℃）保存。
紫外分光法测量饮料中维生素B2的含量
XX医科大学生物化学自主实验设计紫外分光光度法测定饮料中的的核黄素实验小组成员：专业：紫外分光光度法测定饮料中的的核黄素摘要：利用紫外分光光度法测定市场上贩卖的几种常见品牌饮料中维生素B2的含量。
使用444nm波长的紫外光测定对其进行测定。
关键词：紫外分光光度法；核黄素；测定含量正文：维生素B2（核黄素）是人体中许多重要辅酶的组分。
测定核黄素含量的方法很多，本实验小组采用紫外分光法,以市售美国原装Puritan's Pride核黄素维生素B2片中核黄素含量为标准，测定市场上贩卖的几种常见品牌饮料中维生素B2的含量，为各种饮料的营养含量提供了实验依据。
1 实验部分1.1实验目的：采用紫外分光光度法测定市场上抽选的5种品牌饮料中维生素B2的含量，探讨各种品牌的饮料是否具有其描述的功能。
从中学习核黄素的检测技术并了解直接提取样品的原理与方法。
1.2实验原理：核黄素（维生素B2）分子式为C17H20N4O6，结构式如图1.2.1，微溶于水，可溶于氯化钠溶液，易溶于稀的氢氧化钠溶液，遇光容易分解。
样品中加入1.4%的冰醋酸后，在444nm的波长处可以测定其吸收结果从而根据标准曲线得出样品浓度。
图 1.2.11.3实验用品：仪器：紫外分光光度计，层析管，棕色容量瓶，50mL 锥形管，脱脂棉，比色管。
试剂：硅镁吸附剂A 、B ，蒸馏水，冰醋酸，洗脱液（丙酮：冰醋酸：水=5：2：9），3%高锰酸钾溶液，3%过氧化氢溶液，1.4%醋酸钠，维他奶样品（图1.3.1），“蒙牛”纯牛奶样品（图1.3.2），“椰树”椰汁样品（图1.3.3），“冰露”机能水样品（图1.3.4），“燕京”啤酒样品（图1.3.5）,市售美国原装Puritan's Pride 核黄素维生素B2片（每1图1.3.1 图1.3.2 图1.3.3图1.3.4 图1.3.5片含100mg 核黄素）。
1.4实验步骤：1.4.1 核黄素标准夜的制备 取1粒维生素B2片溶于500ml 锥形瓶中，加75ml 水及1ml 冰醋酸，在温水中溶解后，精密量取10ml 溶液于100ml 容量瓶中，并加入1.4%醋酸钠溶液7ml ，用水稀释至刻度，摇匀并作为标准溶液。
紫外可见分光光度法测定维生素B2 - 副本
实验名称：紫外可见分光光度法测定维生素B2实验目的：1、维生素B2的紫外可见光谱图的测绘2、根据E1%1CM444nm文献值323求取样品中VB2的含量（不需要同学们做）3、用标准曲线法求取样品中VB2的含量4、比较两种方法的误差来源实验原理：维生素B2，通常指核黄素。
维生素B2在224、267、375、444nm处具有吸收峰。
一般取444nm的波峰为定量吸收峰，除了用一般的工作曲线法外，还可按C17H20N4O6的吸收系数（E1%1CM444nm）为323计算，求取样品中维生素B2的含量。
实验器材：Cary100UV-Vis分光光度计、冰醋酸（AR）、氢氧化钠1mol/L（AR）、维生素B2标准试剂（0.075mg/ml）、药片（含维生素B2片）。
实验步骤：1、待测液的配置：取待测片剂2片，精密称定、研细，精密称取适量（约相当于维生素B210mg），置于1000 mL容量瓶中，加冰醋酸5mL与水100mL，置水浴（100 ℃）加热1小时，时时摇振，使维生素B2溶解，加水稀释，冷却后加氢氧化钠液（1 mol/L）30 mL。
用水稀释至刻度，摇匀，过滤；弃去初滤液，取续滤液作为待测液。
2、标准溶液的配置：准确称取75mg核黄素（维生素B2），置于1000 mL容量瓶中，加少量水使维生素B2溶解，最后加水定容至刻度得到维生素B2标准试剂（0.075 mg/mL）。
3、用移液管分别吸取2mL、4mL、5mL、6mL、8mL维生素B2标准试剂（0.075 mg/mL）于5个25 mL容量瓶中，加水定容至刻度，摇匀。
用紫外分光光度计分别测量5个容量瓶中的VB2稀释液，得到5个吸收度数值A444nm。
4、以VB2稀释液浓度为横坐标，A444nm数值为纵坐标，建立VB2浓度与吸收度的标准曲线，然后在444nm波长处测出待测液的吸收度数值，在标准曲线上找到相应的浓度数值即可。
实验结果：1、维生素B2的紫外可见光谱扫描图2、维生素B2标准工作曲线图标准液体积（ml）0 2 4 5 6 8 待测液标准液浓度（μg/ml）0 6 12 15 18 24A444nm0 0.189 0.373 0.487 0.561 0.755 0.322根据工作曲线，计算得：待测液浓度为10.222μg/ml思考题：1、本方法要求在避光下进行，试述理由。
实验报告2荧光分光光度法测定维生素B2的含量
实验项目：荧光分光光度法测定维生素 B 2的含量【实验题目】荧光分光光度法测定维生素 B 2的含量【实验目的】1掌握标准曲线法定量分析维生素B 2的基本原理。
2、了解荧光分光光度计的基本原理、结构及性能，掌握其基本操作。
【实验原理】维生素B2（又叫核黄素，VB 2）是橘黄色无臭的针状结晶。
由于分子中有三个芳香环，具有平面刚性结构，因此 它能够发射荧光。
维生素B 2易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂，在中性或酸性溶液中稳定，光照易分解，对热稳维生素B 2溶液在430~440nm 蓝光的照射下，发出绿 色荧光，荧光峰在535nm 附近。
维生素B2在pH = 6~7的 溶液中荧光强度最大，而且其荧光强度与维生素 B 2溶液浓度呈线性关系，因此可以用荧光光谱法测维生素B 2的含量。
维生素 B 2在碱性溶液中经光线照射会发生分解而 转化为另一物质一一光黄素，光黄素也是一个能发荧光的 物质，其荧光比维生素 B 2的荧光强得多，故测维生素B2内，且在避光条件下进行。
在稀溶液中，荧光强度 F 与物质的浓度c 有以下关系： 当实验条件一定时，荧光强度与荧光物质的浓度呈线性关系：F=Kc这是荧光光语法定量分析的依据。
【主要仪器与试剂】主要仪器：F-2500 HiTachi 荧光分光光度计；1cm 石英皿；50mL 容量瓶；5mL 移液管；烧 杯；胶头滴管 试剂：维生素 B 2标准溶液：未知液 4 【实验内容及步骤】1、 系列标准溶液的制备取维生素 B 2 标准溶液（10.0 卩 g/mL ）1.00mL 、2.00mL 、3.00mL 、4.00mL 、5.00mL 分别置 于50mL 的容量瓶中，各加入去离子水稀释至刻度，摇匀。
标记为①②③④⑤的一系列维生 素B 2标准溶液。
待测。
2、 待测液制备取5.00mL 未知液4置于50mL 容量瓶中，加入去离子水稀释至刻度，摇匀。
待测。
3、 激发光谱和荧光发射光谱的绘制设置入em = 540nm 为发射波长，在250~500nm 范围内扫描标准溶液③，记录荧光发射 强度和激发波长的关系曲线，便得到激发光谱。
紫外分光光度法测定维生素B2的含量精选全文
可编辑修改精选全文完整版验证性试验实验十六紫外分光光度法测定维生素B2的含量一、目的要求1.掌握维生素B2含量测定的原理。
2.熟悉紫外可见分光光度法的应用。
二、仪器与试药1.仪器Mettler AL204电子天平 752型紫外可见分光光度仪刻度移液管规格：1mL、10mL 定量滤纸（直径10cm）容量瓶规格：100mL 500mL 研钵2.试药维生素B2原料冰醋酸氢氧化钠醋酸钠溶液蒸馏水三、实验原理利用维生素B2分子中具有共轭双键结构，在紫外区有吸收，测定其最大吸收波长处的吸收度即可计算其含量。
四、实验内容维生素B2Vitamin B2C17H20N4O6 376.37本品为7,8-二甲基-10[(2S,3S,4R)-2,3,4,5-四羟基戊基]-3,10-二氢苯并蝶啶-2,4-二酮。
按干燥品计算，含C17H20N4O6应为98.0%～102.0%。
【性状】本品为橙黄色结晶性粉末；微臭，味微苦；溶液易变质，在碱性溶液中或遇光变质更快速。
本品在水、乙醇、二氯甲烷或乙醚中几乎不溶；在稀氢氧化钠溶液中溶解。
【鉴别】取本品约1mg，加水100 mL溶解后，溶液在透射光下显淡黄绿色并有强烈的黄绿色荧光；加无机酸或碱溶液，荧光即消失。
【含量测定】避光操作。
取本品约75mg，精密称定，置烧杯中，加冰醋酸1mL与水75mL，置水浴上加热溶解后，加水稀释，放冷后，移置500mL量瓶中，再加水稀释至刻度，摇匀；精密量取10mL，置100mL量瓶中，加1.4%醋酸钠溶液7mL,并用水稀释至刻度，摇匀，照紫外-可见分光光E为323计算，即得。
度法，在444 nm的波长处测定吸光度A，按照Ｃ17H20N4O6的吸收系数%11cm计算：维生素B 2含量% =A ：供试品在444nm 的波长处测得的吸收度；D ：供试品的稀释倍数；%11cm E :吸收系数; W ：维生素B 2的取样量。
五、注意事项1.避光操作。
2.振摇充分，使样品溶解完全。
荧光分光光度法测定维生素 B2的含量
荧光分光光度法测定维生素 B2的含量维生素B2（核黄素）是一种黄色的水溶性维生素，参与人体多种代谢过程，如能量代谢、蛋白质合成及细胞呼吸等。
因此，对维生素B2的含量进行精确测量至关重要。
本文将介绍一种常用的荧光分光光度法测定维生素B2含量的方法。
一、测定原理荧光分光光度法是一种基于物质吸收光谱和荧光光谱的仪器分析法，它利用物质在受激光或外界光源激发下，发生荧光的特性来测定物质的含量。
维生素B2在紫外光530.0nm 处吸收，同时能在pH8.0的碳酸氢钠缓冲溶液中产生荧光。
因此，荧光分光光度法可以通过测定维生素B2产生的荧光强度来计算其含量。
二、测定步骤1.准备样品将要测定的维生素B2溶于50mL的碳酸氢钠缓冲液中，并将其均匀混合。
用已知浓度的维生素B2标准品分别配制成不同浓度的标准溶液，用于绘制标准曲线。
2.测定荧光光谱取适量的样品及标准溶液分别装入荧光分光光度计的比色皿中，然后在含有Excitation (Ex)波长为450.0nm、Emission (Em)波长为530.0nm的荧光滤光片下进行测量。
将标样及待测样荧光强度值分别记录下来。
3.制定标准曲线将已知浓度的维生素B2标准溶液按照步骤2测定，绘制标准曲线，根据数据进行回归分析，得出求出待测样品浓度的公式。
4.检测待测样品按照步骤2进行待测样品的测定，利用标准曲线计算出待测样品中维生素B2的含量。
三、测定注意点1.样品配制时要保持一定浓度，过高或过低都会影响分析结果；2.样品制备、实验条件及荧光光度计的使用必须保证一致性；3.测量结果可受色、浑浊等因素影响，需要有一定的操作经验、严守操作规程。
四、结论本文介绍了荧光分光光度法测定维生素B2含量的方法，并简要说明了测定原理及详细的操作步骤。
此种方法具有测量简便、操作方便、灵敏度高等优点，被广泛应用于维生素B2含量的测量。
维生素B2片分析方法验证方案
一．概述1.维生素B2片含量测定：照高效液相色谱法（通则0512）测定。
1.1色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0. Olmol/L庚烷磺酸钠的0.5%冰醋酸溶液-乙腈-甲醇(85∶10∶5)为流动相；检测波长为444nm。
理论板数按维生素B2峰计算不低于2000。
1.2测定法避光操作。
取本品20片，精密称定，研细，精密称取适量(约相当于维生素B2 10mg)，置500ml量瓶中，加盐酸溶液(1→2)10ml，振摇使维生素B2 溶解，加水20ml，继续振摇数分钟，再加水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，精密量取20ul注入液相色谱仪，记录色谱图；另取维生素B2对照品约10mg，同法测定。
按外标法以峰面积计算，即得。
1.3本品含维生素B2计算，应为标示量的90.0% ～110.0%。
2. 维生素B2片溶出度测定：照溶出度与释放度测定法（通则0931第二法）测定法避光操作。
取本品，以冰醋酸3ml与4%氢氧化钠溶液18ml用水稀释至600ml为溶出介质，转速为每分钟100转，依法操作，经20分钟时，取溶液10ml，滤过，取续滤液，照紫外-可分光光度法（通则0401)，在444nm的波长处测定吸光度，按C17H20N4O6的吸收系数()为323计算每片的溶出量。
限度为标示量的75%，应符合规定。
3. 维生素B2片有关物质测定：照高效液相色谱法（通则0512）测定。
色谱条件照含量测定。
避光操作。
取本品的细粉适量（约相当于维生素B2 10mg)，置100ml 量瓶中，加盐酸溶液（1→2)5ml，振摇使维生素B2溶解，加水10ml，继续振摇数分钟，再用水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；精密量取1ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。
精密量取供试品溶液与对照溶液各20ul，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍。
供试品溶液的色谱图中如有杂质峰，单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积的0.75倍(1.5% ) ，各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的1.5倍（3.0% )。
概述及维生素B2的分析与测定
《生物产品分析与检验技术》课程单元教学设计卡二、教学内容相关知识第一节维生素概述1.定义：维生素是维持人体正常生理机能所必需的生物活性物质。
2.维生素对人体的意义根据日常生活以举例为主3.维生素类物质的分类（按其溶解性质分）脂溶性维生素：主要有A、D、E、K等水溶性维生素：主要有B族（B1、B2、B12等）、维生素C、烟酸、叶酸、泛酸、抗坏血酸等。
4.维生素测定方法化学分析法、比色法、分光光度法（紫外和荧光）、层析法、色谱法（气相色谱和高效液相色谱）和微生物法等。
第二节维生素B2的特征及分析测定1．维生素B2的化学结构维生素B又称核黄素，分子式为C17H20N4O6，维生素B2的结构是由D-核醇和7，28-二甲基异咯嗪组成，以D-核醇的C1上醇基与异咯嗪上N相连。
2．维生素B2的性质微溶于水，在中性或酸性溶液中加热是稳定的，为体内黄酶类辅基维生素B2的组成部分（黄酶在生物氧化还原中发挥递氢作用）。
当缺乏时，会影响机体的生物氧化，使代谢发生障碍，导致口腔、唇、皮肤、生殖器的炎症和机能障碍，如口角炎、唇炎、舌炎、口腔溃疡、眼结膜炎和阴囊炎等，故本品可用于上述疾病的防治。
体内维生素B2的储存是很有限的，因此每天都要由饮食提供。
B2在食品中以游离形式或磷酸酯等结合形式存在。
膳食中主要来源于各种动物性食品，其中以肝、肾、心、蛋、奶含量最多，其次是植物性食品的豆类和新鲜叶菜类。
主要性质有：2.1紫外吸收：维生素B2的最大吸收波长在267nm、375nm与444nm处。
2.2不稳定性：维生素B2对光线极不稳定，易分解为感光黄素（光化黄）。
2.3旋光性：维生素B2在碱液中呈左旋性。
2.4酸碱两性：维生素B2为两性化合物，可溶于酸和碱。
其水溶液为非解离型，呈黄绿色荧光。
荧光在pH 6～7时最强，在酸或碱中解离，荧光即消失。
3．测定方法维生素B的分析方法主要有荧光法、微生物法、紫外分光光度法、高效液2相色谱法。
（1）荧光反应（荧光法）核黄素在440-500nm波长照射下发生黄绿色荧光，在稀溶液中，荧光强度与核黄素浓度成正比。
荧光分光光度法测定药液维生素B2的含量
仪器部件
a. 光源 ： 在荧光计中常用卤钨灯作光源 ； 荧光分度 光源： 在荧光计中常用卤钨灯作光源； 计常采用高压汞灯或氙弧灯做光源。 计常采用高压汞灯或氙弧灯做光源。 b. 单色器 ： 荧光计的单色器是滤光片 ， 只能用于定 单色器： 荧光计的单色器是滤光片， 量分析；荧光分光光度计采用两个光栅单色器， 量分析；荧光分光光度计采用两个光栅单色器，可 获得激发光谱和荧光光谱。 获得激发光谱和荧光光谱。 c. 检测器 ： 荧光计采用光电管作检测器 ； 荧光分光 检测器： 荧光计采用光电管作检测器； 光度计采用光电倍增管作检测器。 光度计采用光电倍增管作检测器。
数据处理
1. 用标准系列溶液的荧光强度绘制标准工作曲线。 用标准系列溶液的荧光强度绘制标准工作曲线。 2. 根据待测液的荧光强度，从标准工作曲线上求 根据待测液的荧光强度， 得其浓度，计算出试样中VB 含量。 得其浓度，计算出试样中VB2含量。
注意事项和问题
1. 解释荧光光度法较吸收光度法灵敏度高的原因 。 解释荧光光度法较吸收光度法灵敏度高的原因。 2. 维生素 B2在pH＝6～7时荧光最强，本实验为何 维生素B pH＝ 时荧光最强， 在酸性溶液中测定？ 在酸性溶液中测定？
维生素B 溶液在430～ 维生素 B2溶液在 430～440 nm蓝光的照射下 ， 发出绿色 nm蓝光的照射下 蓝光的照射下， 荧光，其峰值波长为525 nm。 荧光，其峰值波长为525 nm。VB2的荧光在pH=6～7时最强， 的荧光在pH=6 时最强， 在 pH=11时消失。 维生素B2在碱性溶液中经光线照射会发生 pH=11时消失 维生素B 时消失。 分解而转化为光黄素，光黄素的荧光比核黄素的荧光强的多， 分解而转化为光黄素，光黄素的荧光比核黄素的荧光强的多， 故测VB 的荧光时溶液要控制在酸性范围内， 故测 VB2 的荧光时溶液要控制在酸性范围内 ， 且在避光条件 下进行。 下进行。
VB2的测定
4.00
5.00
－
－
－
－
－
－
－
0.5 00
用H2O定容至50 mL ，摇匀，测定 …
…
…
…
…
…
ρ(VB2) /mg·L-1
0.000 0.200 0.400 0.600 0.800
… 1.000
荧光强度(F)
1）．用标准系列溶液的荧光强度绘制标准工作曲线 2）．根据待测液的荧光强度，从标准工作曲线上求得其浓度
4、结果的计算：
VB2% x 50 100 (wx 106 ) 100%
Vx
1
四、实验步骤：
1、试剂溶液的配制
1）5％醋酸溶液: 取5份冰醋酸与95份体积蒸馏水混合
2）10.0mg·L-1VB2标准溶液：
准确称取10.0mgVB2
于少量的5%HAc中溶解
转移 至1L容量瓶中用5%HAc稀释至刻度
置阴凉处保存
3）待测液：
准确称取市售VB2一片
于50mL烧杯中
加入约12mL 5%HAc溶液，用玻璃棒捣碎药片 水浴加热至透明
维生素B2水溶液在430-440nm蓝光或紫外光照射下 会发生绿色荧光，荧光峰在535nm,在pH=6-7溶液 中荧光强度最大，在pH=11的碱溶液中荧光消失， 所以可以用荧光光谱法测定维生素Ｂ2的含量
三、实验用品： 1．仪器： 荧光分光光度计，移液管，容量瓶，棕色试剂瓶， 比色管，烧杯，离心机，离心管 2．药品： 核黄素（生化试剂），冰醋酸（AR）,盐酸（AR） 氢氧化钠，市售维生素B2片剂
(4) 然后将激发波长设定在442nm处 在400－700nm波长范围内对荧光波长扫描 约在525nm处荧光强度最大
实验二 荧光法测定医用维生素B2片剂中维生素B2的含量
Cx ( ug/ml) 25 ( ml ) 500( ml ) V ( ml )
六、注意事项
操作应该在避光的条件下进行。
样品池轻拿轻放，垂直放入，小心使用。
不要关闭电脑上的荧光仪联机软件。
七、结果记录
根据测定的样品相对荧光强度ΔF＝F－F0，从标准曲线上 查出样品溶液对应的维生素B2的浓度Cx，并计算维生素B2 片中B2的含量，计算公式如下：
维生素 B 2的 含 量 ( ug )
注：F0为空白溶液的荧光强度。
三、仪器及试剂
棱光F96荧光分光光度计，石英样品池（四面透 光），25 ml比色管，一次性吸管，500 ml容量瓶， 漏斗，滤纸等。
维生素B2标准溶液：10 ug/ml，贮存于棕色试剂 瓶中；1% 醋酸溶液；样品维生素B2片。
四、实验条件
固定激发= KC
采用标准曲线法进行定量：
配制一系列浓度不同的标准溶液，分别测出它们 的荧光强度，以横坐标表示浓度C，纵坐标为相 对荧光强度ΔF（ΔF=F-F0），绘制出标准曲线。 若要测定未知溶液的浓度，则在相同条件下测出 未知溶液的相对荧光强度ΔF，在标准曲线上就可 以直接查出对应的未知液浓度Cx。
实验二 荧光法测定医用维生素B2 片剂中维生素B2的含量
中山大学公共卫生学院 肖琴
一、实验目的
了解荧光分析法的基本原理； 了解荧光分光光度计的使用。
二、实验原理
维生素B2又称核黄素。
在紫外光照射下，维生素B2就会发出绿色的荧光。 当荧光物质溶液的浓度较低时( abc≤0.05 )，若入 射光的强度不变，则物质发出的荧光强度F与其 浓度C成正比：
维生素B2片
系统适用性溶液、色谱条件、系统适用性要求与测定法 见维生素 B, 有关物质项下。
限度 供试品溶液色谱图中如有杂质峰，单个杂质峰面 积不得大于对照溶液主峰面积的 o. 75 倍 (1.5 % ), 各杂质峰
• 1476•
不得过 1. 0 % (通则 0831) 。
炽灼残渣 不得过 0. 2%( 通则 0841) 。 【含呈测定】 照高效液相色谱法（通则 0512) 测定。避光 操作 。 供试品溶液 取本品约 15mg, 精密称定，置 500ml 量瓶 中，加冰醋酸 5ml 与水 200ml, 置水浴上加热，并时时振摇使 溶解，加水适量稀释，放冷，再用水稀释至刻度，摇匀。 对照品溶液 取维生素 B, 对照品约 15mg, 精密称定，置 500ml 量瓶中，加冰醋酸 5ml 与水 200ml, 置水浴上加热，并时 时振摇使溶解，加水适益稀释 ， 放冷，再用水稀释至刻度，摇匀 。 色谱条件 见有关物质项下 。 系统适用性要求 理论板数按维生素压峰计算不低于 2000 。 测定法 精密量取供试品溶液与对照品溶液，分别注入 液相色谱仪，记录色谱图。按外标法以峰面积计算。 【类别】 维生素类药。 【贮藏】 遮光，密封保存 。 【制剂】 (1) 维生素 B, 片 (2) 维生素 B, 注射液
维生素 B2 注射液 Weishengsu B2 Zhusheye Vitamin B2 Injection
本品为维生素 B, 的灭菌水溶液 。 含维生索片 CC,, H20 风 0, )
应为标示最的 90. 0%~11s. 0 % 。 本品中可酌加适宜的助溶剂与止痛剂。 【性状】 本品为橙黄色的澄明液体；遇光易变质。 【鉴别】 取本品适量（约相当千维生素 B2 1mg), 照维生
VB2的测定和方法学
国内外研究方法
近年来对VB2测定方法报道较多，如： 1. 高效液相色谱法 2. 流动注射化学发光法 3. 多元线性分光光度法 4. 荧光分光光度法 这些方法操作麻烦，时间较长，本实验用紫外
分光光度法和荧光法测定VB2含量 。
实验思路
1.VB2片的紫外测定
VB2的避光措施
? 本实验中，首次采用添加硫代硫酸钠还原维 生素B2方法制作标准曲线来测定VB2含量。 这是其它文献中没用采用过的方法。
收获
? 我们学会了分析课题，查找文献并设计实验 方案，以及对实验的严谨态度。
? 学会独立操作紫外分光光度计和荧光分光光 度计，并了解其工作原理。
? 了解了维生素B2的特性及富含维生素B2的食 物。
Readings 0.3158 0.3777 0.4432 0.5059 0.5676 0.6301
浓度：10~20mg/L
VB2片的浓度计算
结论：所测样品的 含量为4.563mg/ 片
①VB2紫外线性范围浓度：
0.2~24mg/L A=0.0312c+0.0069 R2=0.9998
0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1
0 0
5
10
Standard
Std 1 Std 2 Std 3 Std 4 Std 5 Std 6 Std 7 Std 8 Std 9 Std 10 Std 11
Concentration (mg/L) 0.2 0.5 1.0 1.5 2.0 4.0 8.0 12 16 20 24
Readings
0.0082 0.0211 0.0378 0.0523 0.0705 0.1299 0.2672 0.3828 0.5063 0.6280 0.7528
紫外分光光度法测定维生素B2的含量
验证性试验实验十六 紫外分光光度法测定维生素B 2的含量一、目的要求1.掌握维生素B 2含量测定的原理。
2.熟悉紫外可见分光光度法的应用。
二、仪器与试药1.仪器Mettler AL204电子天平 752型紫外可见分光光度仪刻度移液管 规格：1mL 、10mL 定量滤纸（直径10cm ）容量瓶 规格：100mL 500mL 研钵2.试药维生素B 2 原料 冰醋酸 氢氧化钠 醋酸钠溶液 蒸馏水三、实验原理利用维生素B 2分子中具有共轭双键结构，在紫外区有吸收，测定其最大吸收波长处的吸收度即可计算其含量。
四、实验内容维生素B 2Vitamin B 2C 17H 20N 4O 6 376.37本品为7,8-二甲基-10[(2S,3S,4R)-2,3,4,5-四羟基戊基]-3,10-二氢苯并蝶啶-2,4-二酮。
按干燥品计算，含C 17H 20N 4O 6应为98.0%～102.0%。
【性状】本品为橙黄色结晶性粉末；微臭，味微苦；溶液易变质，在碱性溶液中或遇光变质更快速。
本品在水、乙醇、二氯甲烷或乙醚中几乎不溶；在稀氢氧化钠溶液中溶解。
【鉴别】取本品约1mg ，加水100 mL 溶解后，溶液在透射光下显淡黄绿色并有强烈的黄绿色荧光；加无机酸或碱溶液，荧光即消失。
【含量测定】避光操作。
取本品约75mg ，精密称定，置烧杯中，加冰醋酸1mL 与水75mL ，置水浴上加热溶解后，加水稀释，放冷后，移置500mL 量瓶中，再加水稀释至刻度，摇匀；精密量取10mL ，置100mL 量瓶中，加1.4%醋酸钠溶液7mL,并用水稀释至刻度，摇匀，照紫外-可见分光光度法，在444 nm 的波长处测定吸光度A ，按照Ｃ17H 20N 4O 6的吸收系数%11cm E 为323计算，即得。
计算：维生素B 2含量% = 1%1100%100cm A D E W⨯⨯⨯⨯⨯A：供试品在444nm的波长处测得的吸收度；D：供试品的稀释倍数；1%E:吸收系数;1cmW：维生素B2的取样量。
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上海大学生命科学实验中心
实验报告
课程：生化分析实验姓名：吴梦楠日期：2011.09.21 学号：09123364 同组者：指导老师：戴小峰
实验时间：2011.09.19 温度：湿度：
实验名称：紫外可见分光光度法测定维生素B2
实验目的：1、维生素B2的紫外可见光谱图的测绘
2、根据E1%1CM444nm文献值323求取样品中VB2的含量
3、用标准曲线法求取样品中VB2的含量
4、比较两种方法的误差来源
实验原理：维生素B2，通常指核黄素。
维生素B2在224、267、375、444nm处具有吸收峰。
一般取444nm的波峰为定量吸收峰，除了用一般的工作曲线法外，还可按C17H20N4O6
的吸收系数（E1%1CM444nm）为323计算，求取样品中维生素B2的含量。
实验器材：Cary100UV-Vis分光光度计、冰醋酸（AR）、氢氧化钠1mol/L（AR）、维生素B2标准试剂（0.3mg/ml）、药片（含维生素B2片）。
实验步骤：1、取待测片剂20 片，精密称定、研细，精密称取适量（约相当于维生素B210mg），置于1000ml容量瓶中，加冰醋酸5ml与水100ml，置水浴（100℃）加热1小时，时
时摇振，使维生素B2溶解，加水稀释，冷却后加氢氧化钠液（1mol/L）30ml。
用水稀释至刻度，摇匀，过滤；弃去初滤液，取续滤液，在444nm波长处测定吸收度，
C17H20N4O6的吸收系数（E1%1CM444nm）为323计算。
2、用移液管分别吸取2ml、4ml、5ml、6ml、8ml维生素B2标准试剂（0.3mg/ml）
于5个100ml容量瓶中，加水定容至刻度，摇匀。
用紫外分光光度计分别测量5个
容量瓶中的VB2稀释液，得到5个吸收度数值A444nm。
以VB2稀释液浓度为横坐标，
A444nm数值为纵坐标，建立VB2浓度与吸收度的标准曲线，然后测出待测液的吸收度
数值，在标准曲线上找到相应的浓度数值即可。
实验结果：1、维生素B2的紫外可见光谱扫描图
2、维生素B2标准工作曲线图
标准液体积（ml）0 2 4 5 6 8 待测液
标准液浓度（μg/ml）0 6 12 15 18 24
A444nm0 0.189 0.373 0.487 0.561 0.755 0.322
根据工作曲线，计算得：待测液浓度为10.222μg/ml
思考题：1、本方法要求在避光下进行，试述理由。
答：本方法测定的是物质在特定波长下光的吸收，避免VB2遇光分解干扰数据测定。
2、当吸收值为何值时，浓度测量的相对误差最小。
答：当吸光值为0.2——0.8之间，相对误差最小。
3、如何选择参比溶液？基本原则是什么？
答：当试剂与显色液为无色，选择水，当试剂有色，显色液无色，选择不如显色液的被测液，当显色剂有色时，可选择不加试样溶液的试剂。
原则是消除本身物质以外的影响因素。
4、比较两种定量方法，探求误差原因。
答：标准曲线：每次的色谱条件难以完全相同，有误差。
文献曲线：因操作、环境、仪器、人员与文献值不同，引起误差。
5、本实验中一般选取445nm左右的波峰为维生素B2的定量吸收峰，为什么？
答：可减少其他物质的干扰，且波峰较宽有利于检测。