水及食品中微生物的检测

水及食品中微生物的检测

水是食品生产中的重要原料。据世界卫生组织估计，在全世界每年数以亿计的食源性疾病患者中，70%是由于食用了各种致病性微生物污染的食品和饮水造成的。水是否合乎标准，除需对其感官质量、放射性物质、与健康有关的无机成分等进行分析测定外，还必须对微生物进行检测。通常通过水中细菌总数和大肠杆菌群数来确定水的卫生质量。

细菌总数是指被检样品经过处理（如剪碎、研匀），在一定条件下培养后，所得1g或1ml检样中所含细菌菌落的总数。由于一个活细胞能形成一个菌落，因此，菌落就是待测样品所含的活菌数。由于每种细菌都有一定的生理要求（如对氧、培养温度、培养基的pH等），所以，培养时应该用不同的培养条件及不同的生理条件去满足其要求，才能将各种细菌都培养出来。但在实际工作中，一般都只用一种常用的方法去作细菌菌落总数的测定，所得结果指包括一群能在牛肉膏蛋白胨琼脂上或其他培养基上生长的嗜中温性需氧菌的菌落总数。

大肠杆菌是一群在37 ℃下能发酵乳糖、产酸产气、需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌,大多数无致病性,但是当致病性大肠杆菌侵入人体某些部位时,可引起腹泻、膀肤炎、胆囊炎等。大肠杆菌作为普遍采用的水质卫生学指标,常用来指示水源受粪便污染的状况,从而控制其质量,保证卫生安全[1]。食品中大肠杆菌群系以每100ml(g)检样内大肠菌群最可能数（MPN）来表示。大肠杆菌群的测定，一般包括发酵试验（在单料或双料乳糖胆盐发酵管内进行）、分离培养试验（利用伊红美蓝平板）、复发酵试验（在乳糖发酵管内进行）、革兰氏染色、芽孢染色、显微镜观察等。

1材料与用具

1.1材料

湖水、黄酒。

1.2 培养基

1.2.1 肉膏蛋白胨琼脂固体培养基

牛肉膏1.0g、蛋白胨2.0g、NaCl1.0g、水200 ml、琼脂2%、pH7.2、0.10Mpa 灭菌20min。

1.2.2 乳糖胆盐发酵培养基(单料)

蛋白胨5g、乳糖2.5g、猪胆盐(或牛、羊胆盐)1.25g、0.04%溴甲酚紫水溶液4滴左右、蒸馏水250ml、pH7.4。配制方法如下：将蛋白胨、胆盐及乳糖溶于水中，校正pH，加入指示剂，分装每支试管的1/3，并倒置放入杜氏小管(注意排净小管内气泡)，115℃灭菌15min。

1.2.3 乳糖发酵培养基

蛋白胨2.4g、乳糖1.2g、0.04%溴甲酚紫水溶液2-3滴、蒸馏水120ml、pH7.4。配制时将蛋白胨及乳糖溶于水中，校正pH，加入指示剂，按检验要求分装每支试管的1/3，并倒置放入杜氏小管(注意排净小管内气泡)，115℃灭菌15min。1.2.4 伊红美蓝固体培养基

伊红美蓝固体培养基是一种鉴别培养基，常用于食品及饮用水的微生物学检验，培养基中的伊红为酸性燃料，美蓝则为碱性染料，当大肠杆菌发酵乳糖产生混合酸时，细菌带正电荷，与伊红染色，再与美蓝结合生产紫黑色化合物。在此培养基上大肠杆菌生长形成呈紫黑色带金属光泽的小菌落，而产气杆菌则形成棕色大菌落，不能发酵乳糖的细菌产碱性物质较多，带负电荷，与美蓝结合形成兰色菌落。

其配方为：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl5g、20%乳糖溶液20ml、2%伊红溶液20ml、0.5%美蓝溶液10ml、水1000ml、琼脂20g、pH7.6。配制时将牛肉膏、蛋白胨、NaCl加入水中溶解，调pH为7.6，加琼脂、融化、分装、灭菌。再以无菌操作加入预先0.075MPa 灭菌20min的20%乳糖溶液20ml、2%伊红溶液20ml、0.5%美蓝溶液10ml。当培养基冷却到50℃左右倒平皿。

1.3实验用具

显微镜、培养箱、水浴锅、培养皿、吸管、接种环、试管、杜氏小管、涂布器、酒精灯、试管架等。

2方法

2.1细菌总数的测定

2.1.1 采样

瓶装发酵酒的取样方法：用点燃的酒精棉球灼烧瓶口灭菌，用石炭酸纱布盖好，再用灭菌开瓶器将盖启开，含有二氧化碳的酒类可倒入500ml灭菌磨口瓶中，口勿盖紧，覆盖一灭菌纱布，轻轻振荡，待气体全部逸出后，进行检验。

水样的采取方法：湖水应取距水面10~15cm的深层水样，将无菌带玻璃塞的广口瓶浸入水中，盛满后将瓶塞盖好，再从水中取出。

2.1.2 检样稀释 (无菌操作)

将被检样25 g (或25ml或1ml) 剪碎，放入含有225ml (或9毫升)无菌生理盐水(或无菌水)的无菌三角瓶(瓶内放置适当数量的玻璃珠)或无菌研钵内，经充分振荡或研磨，制成10-1稀释液。用1ml吸管吸取10-1稀释液1ml，沿管壁慢慢注入含有9ml无菌水的试管内，制成10-2的稀释液，同法，直到用最后稀释度的菌液做倾注法平皿计数时，每个培养皿的菌落数在30~300之间。

2.1.3 倾注培养

选择10-4、10-5两个适宜稀释度，每个稀释度作2个平皿。稀释液移入平皿后，及时将保温至45℃左右的肉膏蛋白胨琼脂培养基注入平皿约15ml，并摇动平皿使培养基和菌液混匀，待凝固后将平皿倒置于36±1℃培养箱内培养24±2h 后取出，计算平板内菌落总数，乘以稀释倍数，即得每克(每毫升)样品菌落总数。

2.1.4 菌落计数方法

可用肉眼观察直接计数，也可用菌落计数器计数。求出同稀释度的各平板平均菌落数。

2.2 大肠菌群检验

2.2.1 检样稀释

无菌操作将检样25ml(或25g)放入装有225ml无菌生理盐水的无菌三角瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠）或无菌研钵内，经充分振摇或研磨制成10-1稀释度的稀释液。

用1ml无菌吸管吸取上述稀释液1ml，注入含有9ml无菌生理盐水的试管内，振摇混匀，制成10-2的稀释液。

另取1ml无菌吸管，按上述方法依次做10倍递增稀释液，每次换用1支1ml 无菌吸管。

选择1、10-1、10-23个稀释度，每个稀释度接种3管。

2.2.2 乳糖胆盐发酵

将被检样品接种乳糖胆盐发酵管内，每一稀释度接种3管，置36±1℃培养箱内，培养24±2h，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性；如有产气者，则按下列程序进行。

2.2.3 分离培养

将产气的发酵管分别接种在伊红美蓝琼脂平板上，置36±1℃培养箱内，培养18~24h。观察菌落形态，做革兰氏染色和复发酵证实实验。

2.2.4 复发酵证实试验

在伊红美蓝琼脂平板上挑取①紫红色，具有金属光泽的菌落；②深红色，不带或略带金属光泽的菌落；③淡红色，中心较深的菌落。具有以上特征的菌落为可疑大肠菌群菌落，挑取1~2个进行革兰氏染色，同时对应接种到乳糖发酵管内进行复发酵，36±1℃培养24±2h，观察产气情况。凡在乳糖发酵管内产气、革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌，即可报告为大肠菌群阳性；如不产气或革兰氏阳性，则报告大肠菌群阴性。

3结果与分析

3.1细菌总数的测定

取湖水、黄酒稀释度为10-4和10-5的稀释液于牛肉膏蛋白胨培养基内混合培养，每一稀释度2个平板。将平皿倒置于36±1℃的恒温箱内培养24±2h后取