基因敲除小鼠的构建_图文
cre_loxp基因敲除系统解读ppt课件
MerCreMer融合蛋白
该系统将雌激素受体(Estrogen Receptor,ER)的配 体结合区(ligand-binding domain,LBD)和Cre重组 酶进行融合，产生一种嵌合重组酶，该嵌合重 组酶的表达被置于特异启动子的调节之下，从 而使其在特定组织和器官或者特定发育阶段产 生。但是只有该嵌合重组酶并不能发挥Cre重组 酶的活性，因为雌激素受体结合区的存在使其 不能进入核内与loxP位点相结合。只有加入雌 激素后才能使其进入核内发挥作用。
6
基因敲除机理 （续）
Offspring: 25% homozygous knockout after 2 generation
7
二、基因敲除的基本流程
8
（1）打靶载体构建
Attention: Exon1 3N GT/AG
Conditional Knockout
9
（2）转化ES细胞
电转需要的细胞数量2-5x107
同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。 在基因敲除小鼠制作过程中，需要针对目的基因两端特异性片段设 计带有相同片段的重组载体，将重组载体导入到胚胎干细胞后外源 的重组载体与胚胎干细胞中相同的片段会发生同源重组
同源重组示意图
3
一、Cre/Loxp系统
Cre重组酶（37℃）
acids 281 to 599, G525R)
D.S. Sohal, M. Nghiem. Temporally regulated and tissue-specific gene manipulations in the adult and embryonic heart using a tamoxifen-inducible Cre protein. Circ Res. 89:20-25 (201061).
基因敲除小鼠（Knockoutmice）制备技术方法
基因敲除小鼠（Knockoutmice）制备技术方法基因敲除小鼠，人们使用复杂的方法使小鼠体内的某一个基因不表达，从而使小鼠呈现这个基因缺失的状态，可用于研究这个基因的功能。
但如果某个基因功能特别重要，这个基因缺失可能具有胚胎致死性，那我们就无法得到这种基因敲除的小鼠了，于是人们发明了条件性基因敲除技术。
这一技术可以实现在特定的时间、特定的细胞或组织内使某个基因沉默。
方法是首先在目的基因（就是打算敲除的那个基因）的两侧分别插入一段名为LoxP的DNA序列（LoxP序列是一段34bp的DNA序列，两端的13个碱基为回文序列，中间的8个碱基决定LoxP的方向。
然后我们需要用到一种带有Cre酶的转基因小鼠了。
Cre重组酶于1981年从P1噬菌体中发现，属于λ Int酶超基因家族。
Cre重组酶基因编码区序列全长1029bp（EMBL数据库登录号X03453），编码38kDa蛋白质。
是一种位点特异性重组酶，能介导两个LoxP位点（序列）之间的特异性重组，使LoxP位点间的基因序列被删除或重组。
LoxP（locus of X-over P1）序列来源于P1噬菌体，是有两个13bp反向重复序列和中间间隔的8bp序列共同组成，8bp的间隔序列同时也确定了LoxP的方向。
Cre 在催化DNA链交换过程中与DNA共价结合，13bp的反向重复序列是Cre酶的结合域。
其序列如下：5' - ATAACTTCGTATA - ATGTATGC - TATACGAAGTTAT - 3'3' - TATTGAAGCATAT - TACATACG - ATATGCTTCAATA - 5'Cre-LoxP系统的特性Cre重组酶介导两个LoxP位点间的重组是一个动态、可逆的过程，可以分成三种情况：1、如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，且方向相同，Cre重组酶能有效切除两个LoxP位点间的序列；2、如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，但方向相反，Cre重组酶能导致两个LoxP位点间的序列倒位；3、如果两个LoxP位点分别位于两条不同的DNA链或染色体上，Cre酶能介导两条DNA链的交换或染色体易位。
建立基因敲除小鼠颈动脉粥样硬化模型[新版]
![建立基因敲除小鼠颈动脉粥样硬化模型[新版]](https://img.taocdn.com/s3/m/7e07c982866fb84ae55c8d02.png)
injured
ELK
EK
Macrophage stain for 8 weeks
ELK
EK
Von Willebrand Factor Stain for 8 weeks
ELK
EK
TG concentration(mg/dl)
The Plasma Triglyceride Levels of ELK and EK Mice Fed HCC
**
300
ELK
EK
200
**
100
NS
0 ELK-0w k EK-0w k ELK-4w ks EK-4w ks ELK-8w ks EK-8w ks
0 week
ELK（n=4）
61.52±11.09
EK（n=3） 53.96±18.17
P value
0.76
4 weeks 8 weeks
113.9±5.98 270.17±24.29
carotid artery counterstained with ORO and haematoxylin
noninjured
injured
ELK
EK
lipid deposit after carotid artery injury by FeCl3 for 8 weeks
carotid artery counterstained with ORO and haematoxylin
noninjured
injured
ELK
EK
Mean Intimal and Medial Cross-sectional Areas
of EK and ELK Mice 8 Weeks after Injury
基因敲除小鼠的构建
疾病的分子机理研究和疾病的基因治疗
免疫学中的应用 改造生物、培育新的生物品种
谢谢观赏
知识回顾 Knowledge Review
Hale Waihona Puke 放映结束 感谢各位的批评指导！
谢 谢！
让我们共同进步
通过观察嵌和体小鼠的生物学形状的变化进而了解目的基因变化前 后对小鼠的生物学形状的改变，达到研究目的基因的目的。
由于同源重组常常发 生在一对染色体上中一条 染色体中,所以如果要得 到稳定遗传的纯合体基因 敲除模型，需要进行至少 两代遗传。
该方法通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定 的位点，以达到定点修饰改造染色体上某一基因的目的，克服了随机 整合的盲目性和偶然性，是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方 法。
现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞，最常用的是鼠，而兔，猪， 鸡等的胚胎干细胞也有使用。
将重组载体通过一定的 方式导入同源的胚胎干细 胞(ES cell)中，使外源 DNA与胚胎干细胞基因组中 相应部分发生同源重组， 将重组载体中的DNA序列整 合到内源基因组中，从而 得以表达
目前常用的方法是正负筛选法（PNS法），标记基因的特异位点表 达法以及PCR法。其中应用最多的是PNS法。
基因敲除小鼠的构建
生物技术十一班 梅沪生
1.基因敲除简介
2.基因敲除方法及其原理
2.1基因敲除小鼠的构建 2.2其他基因敲除方法
3.基因敲除应用
基因敲除主要是应用DNA同源重 组原理，用设计的同源片段替代 靶基因片段，从而达到基因敲除 的目的。
利用同源重组构建基因敲除小鼠的基本步骤
7
把目的基因和与 细胞内靶基因特 异片段同源的DNA 分子都重组到带 有标记基因的载 体上，成为重组 载体。
建立基因敲除小鼠颈动脉粥样硬化模型ppt课件
ELK
injured
EK
Mean Intimal and Medial Cross-sectional Areas
of EK and ELK Mice 8 Weeks after Injury
10
8
*
EK
ELK
6
Mean Area(um2X104)
4
**
2
0
media intimal
carotid artery counterstained with ORO and haematoxylin
noninjured
ELK
injured
EK
lipid deposit after carotid artery injury by FeCl3 for 8 weeks
carotid artery counterstained with ORO and haematoxylin
Future Works
PAI-1↑
？ LPL↓ ？
Other
？Pathways
Neointima formation↑
Thank You！
118.3±7.91
64.54±6.10
109.7±4.46
EK (n=3)
85.19±17.74 61.61±3.14 109.53±2.90P value0.190.68
0.98
Animal Body Weight of ELK and EK Mice Fed HCC
30
NS NS
ELK
NS
EK
carotid artery stained with H&E
noninjured
建立基因敲除小鼠颈动脉粥硬化模型课件28页PPT
Common carotid arteries of apoE-/-, LPL+/- (ELK)mice (A) and apoE-/-, LPL+/+ (EK)mice (B) 8 weeks after ferric chloride injury
neointima formation after carotid artery injury by FeCl3 for 8 weeks
Knock-out Mice
Candidate genes in lipoprotein metabolism
Lusis et al Circulation. 2004
Lipoprotein Lipase in the Arterial Wall
Pentikäinen et al Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2002
noninjured
ELK
injured
EK
Macrophage stain for 8 weeks
ELK
EK
Von Willebrand Factor Stain for 8 concentration(mg/dl)
The Plasma Triglyceride Levels of ELK and EK Mice Fed HCC
carotid artery counterstained with ORO and haematoxylin
noninjured
ELK
injured
EK
lipid deposit after carotid artery injury by FeCl3 for 8 weeks
carotid artery counterstained with ORO and haematoxylin
基因敲除小鼠的制作方法
一、常规基因敲除鼠( Conventional Knockout )常规基因敲除是通过基因打靶，把需要敲除的基因的几个重要的外显子或者功能区域用 Neo Cassette 替换掉。
这样的小鼠其全身所有的组织和细胞中都不表达该基因产物。
此类基因敲除鼠一般用于研究某个基因在对小鼠全身生理病理的影响，而且这个基因没有胚胎致死性。
二、条件性基因敲除小鼠( Conditional Knockout )条件性基因敲除小鼠是通过基因打靶，把两个 loxP 位点放到目的基因一个或几个重要的外显子的两边。
该小鼠和表达 Cre 酶小鼠杂交之前，其目的基因表达完全正常。
当和组织特异性表达 Cre 酶的小鼠进行杂交后，可以在特定的组织或细胞中敲除该基因，而该基因在其他组织或细胞表达正常。
条件性基因敲除鼠适用范围为：( 1 )该基因有胚胎致死性；( 2 )用于研究该基因在特定的组织或细胞中的生理病理功能。
三、基因敲入小鼠( Knockin )基因敲入小鼠是通过基因打靶，把目的基因序列敲入到小鼠的相应基因位点，使用小鼠的表达调控元件指导目的基因表达。
此类基因敲入鼠一般用于药物的筛选，信号通路的研究等。
一、 ZFN 技术制作基因敲除鼠ZFN 能够识别并结合指定的基因序列位点，并高效精确地切断。
随后细胞利用天然的DNA 修复过程来实现 DNA 的插入、删除和修改，这样研究人员就能够随心所欲地进行基因组编辑。
这在过去是无法想象的，传统的基因敲除技术依赖细胞内自然发生的同源重组，其效率只有百万分之一，而 ZFN 的基因敲除效率能达到 10% 。
利用这些技术进行小鼠基因的定点敲除和敲入，可以把时间从一年缩短到几个月。
这项技术中设计特异性的 ZFN 是最关键的环节，目前研究者采用计算生物学方法设计高特异性的 ZFN，但 ZFN的脱靶( off target )，也就是把不该切的地方切了的问题仍是一个挑战。
也正因为这个原因，利用 ZFN 技术进行小鼠的基因修饰还无法完全取代传统技术。
基因敲除小鼠的构建
生物技术十一班 梅沪生
1.基因敲除简介
2.基因敲除方法及其原理
2.1基因敲除小鼠的构建
2.2其他基因敲除方法
3.基因敲除应用
基因敲除主要是应用DNA同源重 组原理，用设计的同源片段替代 靶基因片段，从而达到基因敲除 的目的。
利用同源重组构建基因敲除小鼠的基本步骤
7
把目的基因和与
细胞内靶基因特
异片段同源的DNA
分子都重组到带
有标记干细胞，最常用的是鼠，而兔，猪， 鸡等的胚胎干细胞也有使用。
将重组载体通过一定的
方式导入同源的胚胎干细 胞(ES cell)中，使外源 DNA与胚胎干细胞基因组中 相应部分发生同源重组，
将重组载体中的DNA序列整
合到内源基因组中，从而 得以表达
目前常用的方法是正负筛选法（PNS法），标记基因的特异位点表 达法以及PCR法。其中应用最多的是PNS法。
通过观察嵌和体小鼠的生物学形状的变化进而了解目的基因变化前 后对小鼠的生物学形状的改变，达到研究目的基因的目的。
由于同源重组常常发
生在一对染色体上中一条
染色体中,所以如果要得 到稳定遗传的纯合体基因
建立生物模型
提供廉价的异种移植器官
疾病的分子机理研究和疾病的基因治疗
免疫学中的应用
改造生物、培育新的生物品种
谢谢观赏
此法利用某些能随机插入基因序列的病毒，细菌或其他基因载体， 在目标细胞基因组中进行随机插入突变，建立一个携带随机插入突变 的细胞库，然后通过相应的标记进行筛选获得相应的基因敲除细胞。 是最近发展起来的利用随机插入突变进行基因敲除的 新型方法 。
比用同源重组法更加简便，周期大大缩短。 对于哺乳动物，如对于一些敲除后小鼠在胚胎时就会死亡的基 因，可以在体外培养的细胞中利用RNAi技术研究它的功能。 RNAi还被用来研究在发育过程中起作用的基因，如可用RNAi来阻断 某些基因的表达，来研究他们是否在胚胎干细胞的增殖和分化过程 中其起着关键作用。
第九-十一章 转基因鼠的构建过程2、小鼠的基因敲除(gene knockout)流程
第11章1、转基因鼠的构建过程PPT-显微注射法：(1)用显微注射法将纯化的外源基因片段导入受精卵的雄原核内；(2)将微注射后经鉴定为存活的受精卵移植到同步交配的假孕母鼠的输卵管内，其中一部分移植卵能够继续生长发育成个体；(3)鉴定子代鼠中外源基因的整合和表达；(4)转基因动物品系的建立。
补充-逆转录病毒法：将插入有外源基因的逆转录病毒载体DNA，通过辅助细胞包装成高感染低毒的病毒颗粒，再感染上升期的胚胎细胞，随后将胚胎导入子宫，可发育成携带外源基因的子代动物。
补充-胚胎干细胞法：(1)分离培养ES细胞先要获取发育至一定时期的胚胎，经培养后，剥离和分散内细胞团，再行培养，最后分离，扩大培养并鉴定ES细胞;(2)在ES细胞上的基因操作通过基因打靶技术，将外源基因导入ES细胞，体外培养和筛选外源基因表达者；(3)获取囊胚细胞，作为ES细胞的移植受体；(4)通过显微操作将ES细胞注入到囊胚期胚胎的腔内，与其细胞团紧靠在一起，成为嵌合体；(5)将注射过的胚胎，经培养后筛选无发育缺损的囊胚，移植到交配第三天的假孕受体鼠子宫内，培育出转基因动物。
2、小鼠的基因敲除（gene knockout）流程基因敲除是采用同源重组的方法，用体外合成的无效基因或突变基因取代相应正常基因，再应用转基因方法孵育出转基因动物。
简：将灭活的基因导入ES细胞中，使这一灭活基因通过同源重组取代原有的目的基因，筛选到基因已定点灭活的细胞后，通过显微注射将细胞注入小鼠囊胚中。
细胞在小鼠囊胚中参与胚胎的发育，最终形成嵌合体小鼠。
由于嵌合体小鼠的一部分细胞来源于ES细胞，所以通过小鼠培育即可获得纯合子基因敲除小鼠。
繁：a.获取ES细胞ｂ．基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA分子都重组到带有标记基因的载体上，此重组载体即为打靶载体。
ｃ．将基因打靶载体通过一定的方式(常用电穿孔法)导入同源的胚胎干细胞(EScell)中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将打靶载体中的DNA序列整合到内源基因组中从而得以表达。
建立基因敲除小鼠颈动脉粥样硬化模型英文-27页PPT精选文档
300
ELK
EK
200
**
100
NS
0 ELK-0wk EK-0wk ELK-4wksEK-4wksELK-8wksEK-8wks
0 week
ELK（n=4）
61.52±11.09
EK（n=3） 53.96±18.17
P value
0.76
4 weeks 8 weeks
113.9±5.98 270.17±24.29
carotid artery stained with H&E
ELK
EK
lipid deposit after carotid artery injury by FeCl3 for 4 weeks
carotid artery counterstained with ORO and haematoxylin
The Plasma Glucose Levels of ELK and EK Mice Fed HCC
150
ELK EK
100
50
0 ELK-0wk EK-0wk ELK-4wksEK-4wksELK-8wksEK-8wks
0 week 4 weeks 8 weeks
ELK (n=4)
118.3±7.91 64.54±6.10 109.7±4.46
carotid artery counterstained with ORO and haematoxylin
noninjured
ELK
injured
EK
lipid deposit after carotid artery injrtery counterstained with ORO and haematoxylin
建立基因敲除小鼠颈动脉粥样硬化模型(英文)PPT课件
noninjured
ELK
injured
EK
lipid deposit after carotid artery injury by FeCl3 for 8 weeks
carotid artery counterstained with ORO and haematoxylin
Pentikäinen et al Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2019
Hypothesis
LPL
？ hyperlipidemic conditions
Arterial response to injury
A 1x2-mm strip of filter paper saturated with 10% FeCl3 solution was applied to the adventitial surface of the surgically exposed carotid artery for 3.0 minutes, then removed. The surgical incision was sutured with 4– 0 monofilament, and the animal was returned to its cage.
Lipoprotein Lipase (LPL) Deficiency Increases Plasma Lipid Level and Enhances Neointima Formation After Carotid Artery Injury in apoE
Knock-out Mice