《体内药物分析》PPT课件
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（临床前试验研究）
对体内样品（生物样品）进行检验,研究生物体内药 物浓度、存在状态、生物利用度.
涉及到药物体内作用机制探讨、药物质量、安全 性、有效性评价及临床合理用药。
体内样品性质特点：
1. 采样量少 数ml ～数十 μl
2. 待测浓度低 10-9 ～ 10-6 g/ml,甚至10-12 g/ml
（一）蛋白质的去除 ① 溶剂沉淀法
加入与水混ຫໍສະໝຸດ Baidu的有机溶剂（1:2~3）
——溶液D 、蛋白质分子间静电引力 而聚 集；与蛋白质氢键变化而凝聚；亲水性溶剂的 水和作用使蛋白质脱水而析出，使药物释放。
常用溶剂乙腈、甲醇、丙酮、四氢呋喃等离 心分离，高速离心机（ ～15000×g ，5min）
上清液偏碱（pH8.5 ～ 9.5）
3. 干扰物之多 内源性物质 体内药物分析的特点：
1. 样品需经分离和浓集或化学衍生化 2. 要求分析方法灵敏度高、专属性强 3. 分析工作量大，结果数据处理繁杂
主要常用测定方法：色谱法、免疫学法、生物学法
如：GC、HPLC、LC-MS、LC-MS/MS、 LC-TOF-MS
建立可靠的和可重复的定量分析方法 是进行体内样品分析的基础，为保证方法 的可行性、可靠性，建立的分析方法在用 于实际样品分析前，必须进行充分地方法 学验证
1.血样采集 动物(采血不得超过总量的1/10）
人：静脉采血1-5ml
2.血浆的制备：将采取的全血置含有抗凝剂（肝素） 的试管中，混匀1000×g离心力5-10min，使血细胞分 离，分取上清液为血浆
3.血清的制备：采血后在室温下至少放置30min1h，凝结出血饼，剥去血饼， 1000×g离心力离心 5-10min，分取上清液为血清。
第五章
体内药物分析
体内药物分析
体内药物分析是指体内样品中药物、代谢物、 内源性物质的定量分析。
体内样品：生物体液、头发、脏器和组织。
其中血样是体内药物分析的主要样品 体内药物分析是测定以上样品中：
1. 原型药物 2. 代谢产物 3. 内源性活性物质 4. 结合物（缀合物） 5. 结合药物
体内药物分析经常用于： 1. 药代动力学研究（PK） C-t曲线 2. 代谢组学研究 3. 临床治疗药物检测（TDM） 4. 新药研究中药理、药效、毒性试验
血浆和血清中药物浓度值通常是相同的，血浆比血 清分离快，且制取量多（全血的50%～60%） 4.全血的制备：加抗凝剂采血不离心，放置室温后 可分层，上层血浆下层血细胞。
测定血细胞内、外药物浓度，血浆药物浓度波动 大、浓度低时应考虑用全血。
贮藏
采血后及时分离。 短期保存：4℃ 长期保存： -20℃或-70~-80℃ 全血未经分离不宜冷冻
的强酸：10%三氯醋酸、6%高氯酸、5%偏磷酸 等。（高速离心机离心约2min ）上清液近呈酸 性pH 0 ～ 4。不适宜在酸性中分解的药物。
④ 热凝固法
要求药物热稳定好，通常加热至90℃ ，使热 变性蛋白沉淀，高速离心或过滤法除去。
方法最简单，只能除去热变性蛋白。
（二）分离纯化与浓集
一般浓集方法： ①使被测组分提取体积小 ②挥去提取溶剂（使用尖锥形试管）残渣复溶于小体积
② 中性盐析法
加入中性盐（1:2混合）
——“盐析”沉淀蛋白质，使蛋白质脱水而沉 淀；离子强度发生变化使蛋白质分子间电排斥 作用减弱而凝集。
常用的中性盐有：硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、 氯化钠、磷酸钠等。
高速离心机离心约2min分离
上清液近中性pH7.0 ～ 7.7
③ 加入强酸（1:0.6混合） ——与蛋白质阳离子(铵基)形成不溶性盐沉淀常用
第一节 常用体内样品的制备与贮藏
一.体内样品种类
生物样本：生物体的任何脏器组织、体液均可 作为生物样本. 常用样本:血液（血浆、血清或全血）、尿液、 唾液、毛发
二、体内样品的采集和制备
（一）血样
适用－药物药动学研究、生物利用度、治疗药物检 测等研究与实际工作。
血药浓度通常指血浆、血清中的浓度。其中 的血药浓度能够反映药物在体内（靶器官）的 状况。是体内药物分析最常用的样本
(二) 尿液 适用－药物剂量回收、肾清除率和生物利
用度测定、药代动力学研究等.
体内药物的清除主要通过尿液的排出。药 物可以原型或代谢产物及缀合物等形式排出。
尿液中药物浓度高，收集量大、方便。但 尿液浓度通常变化较大。
尿液中药物浓度与血药浓度相关性差；不 宜采样的人群：肾功能不良者、儿童
采样后应立即测定。否则应加入防腐剂或冷藏
(三) 唾液
一些药物的唾液浓度S与血浆浓度P呈密切相关，因 此在TDM中测S替代 P。
唾液pH值在6.2-7.4；含有粘蛋白约为血浆的1/10、 电解质含量同细胞外液，粘度是水的1.9倍。 采样后经放置后除去泡沫后， 以3000r/min离心 10min分离，分取上清液作为药物浓度测定的样品。
唾液作为样品测定药物浓度优点：采样容易；有些 唾液中药物浓度可以反映血浆中游离型药物浓度。但 与血浆药物浓度相比易变动；浓度低需高灵敏度监测 仪器。
(四) 组织 常用的脏器组织：胃、肝、肾、心、脑等
1. 样品的制备 先制成匀浆液━━萃取药物 2.样品处理
①沉淀蛋白法 ②酸水解或碱水解法 ③酶水解法
(五) 毛发（头发）
适用：微量元素测定 方法：有机破坏法
湿法破坏 干法破坏 氧瓶燃烧法
测定方法为原子吸收分光光度法和电感耦 合等离子体发射光谱法。
第二节、体内样品分析的前处理技术
一般在测定前预处理:分离、浓集或改性
一、体内样品预处理的目的
1. 使药物游离，使蛋白结合型的药物中释出来测定 2. 满足测定方法的要求 分离与浓集 3. 改善分析环境 保护仪器性能，如HPLC色谱柱 二、常用体内样品处理方法
方法：（1）去蛋白质 （2）分离、纯化、浓集 （3）缀合物水解 （4）化学衍生化
通入氮气（氮吹仪）；减压挥干溶剂
①液相萃取法（LLE) 新方法新技术： ②固相萃取（SPE)
③超滤法
1.液-液萃取法（LLE）
多数药物：弱极性、亲脂性强。多为碱性
内源性杂质：强极性、水溶性强。酸性
根据溶剂、药物、内源性杂质的极性、酸碱性， 选择合适的溶剂分离杂质、纯化样品。
对有机溶剂的要求:①对药物分子未电离的可 溶、电离的不溶 ②沸点低易挥发③与水不相溶 ④无毒、不乳化。⑤较高稳定性、惰性⑥不影 响紫外检测
对体内样品（生物样品）进行检验,研究生物体内药 物浓度、存在状态、生物利用度.
涉及到药物体内作用机制探讨、药物质量、安全 性、有效性评价及临床合理用药。
体内样品性质特点：
1. 采样量少 数ml ～数十 μl
2. 待测浓度低 10-9 ～ 10-6 g/ml,甚至10-12 g/ml
（一）蛋白质的去除 ① 溶剂沉淀法
加入与水混ຫໍສະໝຸດ Baidu的有机溶剂（1:2~3）
——溶液D 、蛋白质分子间静电引力 而聚 集；与蛋白质氢键变化而凝聚；亲水性溶剂的 水和作用使蛋白质脱水而析出，使药物释放。
常用溶剂乙腈、甲醇、丙酮、四氢呋喃等离 心分离，高速离心机（ ～15000×g ，5min）
上清液偏碱（pH8.5 ～ 9.5）
3. 干扰物之多 内源性物质 体内药物分析的特点：
1. 样品需经分离和浓集或化学衍生化 2. 要求分析方法灵敏度高、专属性强 3. 分析工作量大，结果数据处理繁杂
主要常用测定方法：色谱法、免疫学法、生物学法
如：GC、HPLC、LC-MS、LC-MS/MS、 LC-TOF-MS
建立可靠的和可重复的定量分析方法 是进行体内样品分析的基础，为保证方法 的可行性、可靠性，建立的分析方法在用 于实际样品分析前，必须进行充分地方法 学验证
1.血样采集 动物(采血不得超过总量的1/10）
人：静脉采血1-5ml
2.血浆的制备：将采取的全血置含有抗凝剂（肝素） 的试管中，混匀1000×g离心力5-10min，使血细胞分 离，分取上清液为血浆
3.血清的制备：采血后在室温下至少放置30min1h，凝结出血饼，剥去血饼， 1000×g离心力离心 5-10min，分取上清液为血清。
第五章
体内药物分析
体内药物分析
体内药物分析是指体内样品中药物、代谢物、 内源性物质的定量分析。
体内样品：生物体液、头发、脏器和组织。
其中血样是体内药物分析的主要样品 体内药物分析是测定以上样品中：
1. 原型药物 2. 代谢产物 3. 内源性活性物质 4. 结合物（缀合物） 5. 结合药物
体内药物分析经常用于： 1. 药代动力学研究（PK） C-t曲线 2. 代谢组学研究 3. 临床治疗药物检测（TDM） 4. 新药研究中药理、药效、毒性试验
血浆和血清中药物浓度值通常是相同的，血浆比血 清分离快，且制取量多（全血的50%～60%） 4.全血的制备：加抗凝剂采血不离心，放置室温后 可分层，上层血浆下层血细胞。
测定血细胞内、外药物浓度，血浆药物浓度波动 大、浓度低时应考虑用全血。
贮藏
采血后及时分离。 短期保存：4℃ 长期保存： -20℃或-70~-80℃ 全血未经分离不宜冷冻
的强酸：10%三氯醋酸、6%高氯酸、5%偏磷酸 等。（高速离心机离心约2min ）上清液近呈酸 性pH 0 ～ 4。不适宜在酸性中分解的药物。
④ 热凝固法
要求药物热稳定好，通常加热至90℃ ，使热 变性蛋白沉淀，高速离心或过滤法除去。
方法最简单，只能除去热变性蛋白。
（二）分离纯化与浓集
一般浓集方法： ①使被测组分提取体积小 ②挥去提取溶剂（使用尖锥形试管）残渣复溶于小体积
② 中性盐析法
加入中性盐（1:2混合）
——“盐析”沉淀蛋白质，使蛋白质脱水而沉 淀；离子强度发生变化使蛋白质分子间电排斥 作用减弱而凝集。
常用的中性盐有：硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、 氯化钠、磷酸钠等。
高速离心机离心约2min分离
上清液近中性pH7.0 ～ 7.7
③ 加入强酸（1:0.6混合） ——与蛋白质阳离子(铵基)形成不溶性盐沉淀常用
第一节 常用体内样品的制备与贮藏
一.体内样品种类
生物样本：生物体的任何脏器组织、体液均可 作为生物样本. 常用样本:血液（血浆、血清或全血）、尿液、 唾液、毛发
二、体内样品的采集和制备
（一）血样
适用－药物药动学研究、生物利用度、治疗药物检 测等研究与实际工作。
血药浓度通常指血浆、血清中的浓度。其中 的血药浓度能够反映药物在体内（靶器官）的 状况。是体内药物分析最常用的样本
(二) 尿液 适用－药物剂量回收、肾清除率和生物利
用度测定、药代动力学研究等.
体内药物的清除主要通过尿液的排出。药 物可以原型或代谢产物及缀合物等形式排出。
尿液中药物浓度高，收集量大、方便。但 尿液浓度通常变化较大。
尿液中药物浓度与血药浓度相关性差；不 宜采样的人群：肾功能不良者、儿童
采样后应立即测定。否则应加入防腐剂或冷藏
(三) 唾液
一些药物的唾液浓度S与血浆浓度P呈密切相关，因 此在TDM中测S替代 P。
唾液pH值在6.2-7.4；含有粘蛋白约为血浆的1/10、 电解质含量同细胞外液，粘度是水的1.9倍。 采样后经放置后除去泡沫后， 以3000r/min离心 10min分离，分取上清液作为药物浓度测定的样品。
唾液作为样品测定药物浓度优点：采样容易；有些 唾液中药物浓度可以反映血浆中游离型药物浓度。但 与血浆药物浓度相比易变动；浓度低需高灵敏度监测 仪器。
(四) 组织 常用的脏器组织：胃、肝、肾、心、脑等
1. 样品的制备 先制成匀浆液━━萃取药物 2.样品处理
①沉淀蛋白法 ②酸水解或碱水解法 ③酶水解法
(五) 毛发（头发）
适用：微量元素测定 方法：有机破坏法
湿法破坏 干法破坏 氧瓶燃烧法
测定方法为原子吸收分光光度法和电感耦 合等离子体发射光谱法。
第二节、体内样品分析的前处理技术
一般在测定前预处理:分离、浓集或改性
一、体内样品预处理的目的
1. 使药物游离，使蛋白结合型的药物中释出来测定 2. 满足测定方法的要求 分离与浓集 3. 改善分析环境 保护仪器性能，如HPLC色谱柱 二、常用体内样品处理方法
方法：（1）去蛋白质 （2）分离、纯化、浓集 （3）缀合物水解 （4）化学衍生化
通入氮气（氮吹仪）；减压挥干溶剂
①液相萃取法（LLE) 新方法新技术： ②固相萃取（SPE)
③超滤法
1.液-液萃取法（LLE）
多数药物：弱极性、亲脂性强。多为碱性
内源性杂质：强极性、水溶性强。酸性
根据溶剂、药物、内源性杂质的极性、酸碱性， 选择合适的溶剂分离杂质、纯化样品。
对有机溶剂的要求:①对药物分子未电离的可 溶、电离的不溶 ②沸点低易挥发③与水不相溶 ④无毒、不乳化。⑤较高稳定性、惰性⑥不影 响紫外检测