杂质 自身对照 校正因子

杂质测定中加校正因子的主成分自身对照法：

在杂质研究中，因某一杂质与主成分在某一波长下的响应因子不在0.9-1.1范围内，可考虑采用加校正因子的主成分自身对照法。此校正因子可直接载入各品种项下，用于校正杂质的实测峰面积。这些需做校正因子的杂质，通常以主成分为参照，采用相对保留时间定位，其数值一并载入各品种项下。（可以理解为校正因子具有法律效应的作用）

关于校正因子的理论知识如下：

色谱定量分析的依据是被测组分量与检测器的响应信号(峰面积或峰高)成正比。但是同一种物质在不同类型检测器上往往有不同的响应灵敏度；同样，不同物质在同一检测器上的响应灵敏度也往往不同，即相同量的不同物质产生不同值的峰面积或峰高。这样，各组分峰面积或峰高的相对百分数并不等于样品中各组分的百分含量。

色谱的检测器对不同物质有不同的响应，换句话说，1mg化合物A在检测器上能产生1000mAu的响应，但同样是1mg的化合物B在该检测器上也许就只能产生847mAu的响应，所以我们不能在检测器输出1000mAu的响应时就认定样品中一定含有1mg化合物，这时就必须引入定量校正因子。校正后的峰面积或峰高可以定量地代表物质的量，校正因子的作用就是反映某物质的量与检测器响应之间的关系。

定量校正因子分为两种：

1、绝对定量校正因子f；f=M/A，（其中M代表被测物质的量，A代表检测器信号响应，可以是峰面积或峰高），其意义为单位响应所反映的物质量。绝对定量校正因子，即单位峰面积所代表的物质量。这是以峰面积表示的定量校正因子，也可以用峰高来表示定量校正因子。此外，也有用它们的倒数来表示的，简称为响应值。绝对定量校正因子的值随色谱实验条件而改变，因而很少使用。

2、相对定量校正因子f'；f'=fi/fs=（Mi/Ai）/(Ms/As)=（Mi*As）/（Ms*Ai）,（其中i代表被测定物质，s代表选定的基准物质）。定义为某物质i与所选定的基准物质s的绝对定量校正因子（即单位峰面积所代表的物质的量）之比。

绝对定量校正因子一般用于外标法，相对定量校正因子一般用于内标法。

色谱法的含量测定中之所以要先用待测成分的对照品来建立校准曲线，然后才用这个曲线来计算待测样品中该化合物的含量，实际上就是在测定样品前先确定校正因子。日常操作中我们都是以：M标/A标=M样/A样直接计算样品含量了，所以没太注意有什么校正因子，事实上只要将公式作一个简单的变形：M样=A 样*（M标/A标），不难看出式中的（M标/A标）其实正是定量校正因子f，那么M样=A样*f了。（简单来说可以理解为标准曲线的斜率)

所以，用面积归一化比法做含量测定时，不可简单地认为各成分的峰面积百分比就是它们的含量百分比哦，理由如上所述，各成分含量与响应的比例关系可不一定都相同啊！

理论知识已经放在前面了，那就来实际操作的，在杂质分析的测定中，加校正因子的主成分自身对照法，那校正因子究竟怎么测定呢？

有几个问题需要明确的：

1、测定校正因子时，如何取主成分的浓度，如何取杂质的浓度？药典上说：精密称取杂质对照品和待测成分对照品各适量，配制测定杂质校正因子的溶液，进样测定计算。那“适量”是如何确定的呢？范围是多少？

2、主成分取几个浓度，杂质取几个浓度？要做线性吗？校正因子的测定浓度应该要在线性范围内？否则无法定量，而不同浓度进样的校正因子误差要符合什么要求？

3、需要求多少的F值（F值究竟是多大）才能够符合做标准的规定。因为是加校正因子的主成分的自身对照法，F值必须是在一定范围内是一个定数，才能写到标准里面去吧？

4、响应因子与校正因子是成倒数关系，计算响应因子是否需要做RSD，那计算响应因子的主成分和杂质的浓度是选择多少为合适？

5、测定相对校正因子是否需要做方法学验证？验证的内容有哪些？（线性范围？重复性？还有么？需要做线性吗？相似浓度下或线性范围内的校正因子的重复性是不是应该在2%以内？）

6、若已知杂质（合成的中间体，自己可以合成，但买不到对照品，只能做结构确认）无标准品，只用面积归一化法测定该物质的百分含量，再测水分、干燥失重、残渣作为必要的补充和扣除就可以了么？测定时首先准确称量主成分和已知杂质，然后将它们混合均匀进样，分别测出其峰面积，再进行计算。这样就可以了么？

7、测定校正因子后，操作方法可如下：

取供试品溶液和自身对照溶液，分别进样，测量供试品溶液色谱图上杂质的峰面积，分别乘以相应的校正因子后与对照溶液主成分的峰面积比较，依法计算各杂质含量。

原理：C杂质=f*A杂质/（A供试品/C供试品）

杂质%=C杂质/C供试品*100%

因供试品溶液浓度大，误差大，采用自身对照法。

若为1%自身对照，则C杂质=f*A杂质/（A自对照/（C供试品/100））=f*A杂质*C供试品/A自/100

杂质%=f*A杂质*C供试品/A自/100/C供试品*100%=f*A杂质/A自*1%

若为2%自身对照，可以把上面的C供试品/100换为C供试品/50

杂质%=f*A杂质/A自*2%。

有一个比较简便的方法：

假设杂质的限度是0.5%，那就把主成分和杂质的浓度配成0.5%的浓度（同一溶液），连续进样6针，计算平均峰面积，峰面积相除就可以了。如杂质限度是0.5%，供试品浓度是0.2mg/ml，那就把主成分和杂质的浓度均配成1ug/ml，连续进样6针，计算峰面积，计算即得。

同时，采用校正因子的主成分自身对照法，要采用相对保留时间，必须要把柱子型号、牌子、粒度等参数写到标准里去，可以省去方法学验证了。

同时，用作测定校正因子的杂质，纯度系数必须为一个明确的值，如93%，97%都可以，即用面积归一化法测定该物质的百分含量，再测水分、干燥失重、残渣作为必要的补充和扣除，当然如果有容量法测定含量，两者比较，不要差异太大即可。

稀释100倍的供试液我们暂且称1%自身对照液，如果供试液中杂质峰面积不大于1%自身对照液主峰面积的0.5，就相当于供试液中杂质峰面积不大于供试液中主峰面积的0.5%.供试液的浓度很大，此时杂质含量高，峰形良好，但主成分峰可能都平顶了，面积无法计算，而1%自身对照液中主成分峰面积峰形可能都好，但是杂质含量太低，可能峰都没跑出来。所以才用1%自身对照液中主成分峰跟供试液中杂质峰比较。

至于为什么用自身对照，不用杂质对照品，是因为有些杂质并不易得，买不到，还有一些杂质根本就是未知的，故不能用外标法定量杂质。主成分自身对照法分为两种，一种不加校正因子的，前提是假定杂质与主成分的响应因子基本相同，一般杂质与主成分的分子结构相似，响应因子不会差太多，但是还是有一定误差的。

还有一种加校正因子的主成分自身对照法，在建立方法的时候需要用杂质对照品，算出校正因子，这样日常检验时就省去了杂质对照品，但是此时杂质的定位必须采用相对保留时间。