实验一 酶的底物专一性

支链淀粉
支链淀粉比直链淀粉由更多的 D- 葡萄糖组成，其连接方式也 有所不同。支链淀粉中D-葡萄糖之间以α-1，4苷键连接成主链，每 隔20－ 25个葡萄糖单位便分枝出 1 个支链，支链上还有分枝，而支 链的连接点即分枝处为α-l，6糖苷键。
CH2OH O OH O OH CH2OH O OH O OH α -1,4-苷键 O OH OH O OH CH2OH O OH O OH O OH CH2 O OH O CH2OH O OH O α -1,6-苷键 CH2OH O
生物化学实验40学时 （生物工程、生物信息、张之洞班）
生物化学技术60学时 （生物技术、应用生物技术、生物科学）
实验内容（40学时） （生物工程、 生物信息、张之洞班）
1. 酶的底物专一性（4） 2. 总糖和还原糖的测定（4） 2. 蛋白质N端分析（4） 4. 植物DNA的提取（4） 5. DNA的酶切和电泳（4） 6. 酵母醇脱氢酶的提取和纯化（12） 7. SDS-PAGE测定蛋白质分子量（8）
清洁卫生，做完后必须由实验老师检查 通过。
实验报告
●每人1份，下次实验课前交。
生物化学实验成绩
★ 出勤和实验室综合表现 ★ 实验报告 ★ 实验课考试
15分 35分 50分
实验一
酶的底物专一性
目 的

了解酶的专一性 掌握检查酶专一性的原理和方法 学会排除干扰因素，设计酶学实验
实验内容
半缩醛羟基在右边，即与氧环同侧——α -D-葡萄糖； 半缩醛羟基在左边，即与氧环异侧——β -D-葡萄糖。
试
剂
淀粉酶溶液：唾液2mL 倒入10mL量筒中（不包括泡沫），
用蒸馏水稀释到5mL，静置10分钟后，去掉上层泡沫和
下层的沉淀。（自制）
蔗糖酶溶液：干酵母1g置研钵中，加半勺石英沙及蒸馏
水少许（约4mL），用力研磨10分钟，转移到50mL离心 管中，另用25mL蒸馏水洗涤研钵，并将洗涤液一起转 移到离心管中，摇匀，静置5分钟，离心(离心前对称 放置的两只离心管要等重配平，精确到0.01g)，小心



淀

粉
直链淀粉: 由200-300个α-葡萄糖以α-1，4糖 苷键相连成一直链 支链淀粉:有α-1，4糖苷键和α-1，6糖苷键， 在直链淀粉的基础上形成分支

直链淀粉
直链淀粉的相对分子质量比支链淀粉小，直链淀粉的 分子是由许多 α-D- 葡萄糖经过 α-1 ， 4- 苷键反复连接而成 的线状聚合物。
2
2
2
摇匀，沸水煮2分钟
思考题
• 观察酶的专一性为什么要设计这3组实验？ • 每组各有什么意义？ • 每组中蒸馏水分别起什么作用？
• 将酶煮沸10分钟，重做可能会有什么结果？
实验要求


按时上课，不得缺席 预习实验内容 认真观察实验现象，如实记录实验数 据 独立分析实验结果，按时完成实验报 告
实验室守则
★保持室内安静、整洁 ★严格按操作规程使用仪器设备，节约试
剂和实验材料 ★实验过程中注意水、电、门窗安全 ★实验完毕后，将仪器、器皿放归原处 ★做好实验室卫生
CH2OH O OH O OH O
CH2OH O OH O OH α -1,4-苷键
CH2OH O OH O OH
CH2OH O OH O OH
直链淀粉的形状并不是伸展状态的直链，而是有规律 的卷曲成螺旋状，每一螺旋圈约有 6个葡萄糖结构单位。
直链淀粉遇碘液显蓝色，加热煮沸时颜色消失，冷却 后又重新显色。这个反应很灵敏，常用来检验淀粉或碘的 存在。
特别注意
★若发生仪器故障其它事故，应立即切
断相关电源，及时报告老师 ★违反操作规程造成事故、仪器损坏， 将按学校有关规定赔偿
★每位学生一套基本的ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ验物品，放置在
抽屉中，对照有物品清单，每次做完实 验后，清点无误后归回抽屉；每次实验 另外发放的实验物品，用完清洗后放置 在实验台面上。
★每次做完实验后，由班长安排4名同学做
实验步骤
检查试剂
试管1
0.5%淀粉溶液/mL
试管2
试管3
3
2%蔗糖溶液/mL
蒸馏水/mL
3
3
Benedict试剂/mL
2
摇匀，沸水煮2分钟
2
2
观察记录结果
原因
淀粉酶的专一性
稀释的唾液淀粉酶/ml 0.5%淀粉溶液/ml 2%蔗糖溶液/ml 蒸馏水/ml 试管4 1 3 试管5 1 3 3 试管6 1
实验内容（60学时） （生物技术、应用生物技术、生物科学）
1. 2. 3.
4.
5. 6. 7. 8.
酶的底物专一性（4） 总糖和还原糖的测定（4） 蛋白质N端分析（4） 植物DNA的提取（4） DNA的酶切和电泳（4） 酵母醇脱氢酶的提取和纯化（12） 亲和层析分离纯化蛋白质（14） Western Blot鉴定目的蛋白（14）
摇匀，37℃保温30分钟
Benedict试剂/ml
观察记录结果
2
2
2
摇匀，沸水煮沸2分钟
原因
蔗糖酶的专一性
蔗糖酶溶液/ml 0.5%淀粉溶液/ml 2%蔗糖溶液/ml 蒸馏水/ml 试管7 1 3 试管8 1 3 3 试管9 1
摇匀， 37℃保温15分钟
Benedict试剂/ml
观察记录结果 原因
支链淀粉分枝状结构
蔗
糖
由α-葡萄糖和β-果糖以α-1，2糖苷键相连而 成的双糖
Benedict反应

Benedict试剂是碱性硫酸铜溶液，具有一定的氧 化能力，能与还原性糖的半缩醛羟基发生氧化还 原反应，生成氧化亚铜（Cu2O）砖红色沉淀。
淀粉和蔗糖都不能反应，而它们的水解产物葡萄 糖能够发生Benedict反应，所以，用颜色反应来 观察淀粉酶、蔗糖酶对淀粉及蔗糖的水解作用。
本实验以唾液淀粉酶（内含淀 粉酶及少量麦芽糖酶）、蔗糖酶对 淀粉及蔗糖的催化作用，观察淀粉 酶、蔗糖酶的底物专一性。
原
理
酶的专一性
酶的专一性是指一种酶只能对一种底物或一类底物起 催化作用，对其他底物无催化作用。 酶的专一性程度分为： 键专一性：只要求作用于一定类型的键，对键两端基团 无严格要求。如脂酶、核酶 基团专一性：只对键两端一个基团要求严格，如α-、β葡萄糖苷酶，转移酶 绝对专一性：只作用于一种底物，如某些核酸工具酶 立体异构专一性：旋光异构专一性和几何异构专一性

O + HO R' RC H
O HO C H H OH O HO H H OH H CH2OH β-D-葡萄糖 H HO H H C H OH H OH OH CH2OH
OH 半缩醛 R CH OR'
H H HO H H C O H C OH H OH O HO H H OH H CH2OH α--D-葡萄糖 OH H OH OH CH2OH
取出上清液（含蔗糖酶）备用。 （自制）
0.5%淀粉溶液（含0.3%NaCl） （取前摇匀） 2%蔗糖溶液 Benedict试剂
Benedict试剂

在600mL蒸馏水中溶解173g柠檬酸钠和100g 无水碳酸钠，冷却后稀释到850mL。

在100mL热蒸馏水中溶解17.4g无水硫酸铜。冷却 后稀释到150mL。把硫酸铜溶液缓缓倒入柠檬酸 钠－碳酸钠溶液中，边加边搅拌，如产生沉淀。 要过滤，班氏试剂配制后能长期使用。如存放较 久而产生沉淀时，可取上层清液使用，不必重配。