花生毛状根诱导及其体外培养_刘杰

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安徽农业科学
2012 年
MS 固体培养上，25 ℃ 避光共培养 1 ～ 4 d 后，将外植体转移 至含有 400 mg / L Cef 的无激素 MS 固体培养基上除菌。3 周 后，外植体的伤口处开始有白色毛状根产生，切下毛状根转 移至含抗生素的培养基上继续除菌，每隔 7 d 转移至新的培 养基上除菌，直至无菌。毛状根诱导率 = （ 诱导产生毛状根 外植体数 / 农杆菌侵染外植体数） × 100% 。 1． 2． 5 毛状根冠瘿碱鉴定。参考李雅丽等［12］采用硅胶薄层 层析法对毛状根冠瘿碱进行鉴定。分别称取适量鲁花 11 号 和花育 27 号的毛状根及未转化花生根，液氮研磨呈粉，加入 75% 乙醇，过夜，12 000 r / min 离心 10 min，分别点样于 HSG 型硅胶板的不同上样点，以丙酮∶ 乙酸∶ 水 = 6∶2∶2 为展开剂。 层析结束后，分别用丙酮配制的硝酸银溶液和乙醇配制的 0. 5 mol / L 氢氧化钠溶液进行显色，出现斑点的为阳性，表示 有冠瘿碱，无斑点则无冠瘿碱。 1． 2． 6 毛状根培养。选择生长良好的 10 条长约 1 ～ 2 cm 的 花育 11 毛状根（ 鲜重约 0． 040 g） 分别继代于无激素的 MS、 B5 固 体 和 液 体 培 养 基 中，液 体 培 养 基 于 （ 25 ± 1 ） ℃ 、 120 r / min条件下暗培养，固体培养于（ 25 ± 1） ℃ 暗培养。20 d 后取出培养物，用蒸馏水洗去表面残留培养基后滤纸吸干 水分称重，再将培养物于 45 ℃ 烘箱干燥至恒重，取出于干燥 器内冷至室温，万分之一天平称重。毛状根生长曲线测定： 配制最佳培养基，于 150 ml 三角瓶中装入 30 ml 无激素 MS 液体培养基，共 25 瓶，每隔 4 d 取出 3 瓶，进行鲜重和干重测 量，3 次重复取平均值，以培养时间（ d） 为横坐标，培养物鲜 重和干重（ g / 瓶） 为纵坐标，绘制生长曲线。 1． 2． 7 次级代谢物质的提取及检测方法。提取方法： 分别 精确称取未转化花生根粉末、花生毛状根粉末适量于 10 ml 容量瓶中，加适量甲醇，于 25 ℃ 、功率 300 W 超声波清洗器 中提取 20 min，离心收集上清液，沉淀悬浮后重复提取 2 次， 合并上清液并定容至刻度。检测方法： 白藜芦醇及白藜芦醇 苷高效液相色谱检测（ HPLC） ，采用刘宏胜等［13］方法，条件 为色谱柱 C18 ，流动相为乙腈∶ 水 = 40∶60（ V / V，% ） ，柱温为室 温，流速为 1． 0 ml / min，检测波长 306 nm，进样量为 20 μl。 2 结果与分析 2． 1 发根农杆菌对 Cef 敏感性 外植体在发根农杆菌侵染 共培养后需进行除菌，防止农杆菌过度繁殖，使外植体褐化 死亡。文中采用不同浓度 Cef 进行抑菌试验，在接种后第 7 天，2 种农杆菌在对照平板（ 无 Cef） 中大量繁殖，而在含 Cef 平板上未能生长。14 d 后，在含 200 mg / L Cef 平板中 2 种农 杆菌菌落均开始出现，而在抗生素浓度 400 mg / L 以上的平 板中无农杆菌生长，由此可以确定最佳的 Cef 抑菌浓度为 400 mg / L（ 表 1） 。 2． 2 不同理化因素对毛状根诱导影响 2． 2． 1 不同发根农杆菌对外植体侵染能力比较。由表 2 可 知，2 种农杆菌对花生幼叶都能诱导出毛状根，鲁花 11 号的 幼叶毛状根（ 图 1A） 诱导率明显高于花育 27 号； 在不同菌株 间比 较，ACCC10060 诱 导 幼 叶 毛 状 根 的 比 率 略 高 于 ATCC11325； 在 子 叶 与 胚 轴 的 毛 状 根 诱 导 试 验 中，菌 株
白藜芦醇（ Resveratrol，简称 Res） ，学名为 3，5，4' － 三羟 基-二苯乙烯，也称芪三酚，是植物在受到外界刺激情况下产 生具有保 护 作 用 的 一 种 多 酚 物 质，因 具 有 抗 氧 化［1 －2］、抗 癌［3］、抗菌［4］、保护心血管［5］ 等保健药用功能，成为研究热 点。1940 年，首次从毛叶黎芦分离得到白藜芦醇［6］，至今已 确定至少有 21 科 31 属 72 种植物中存在白藜芦醇，有葡萄科 的葡萄属、蛇葡萄属，豆科的花生属、决明属等。现在的研究 主要集中在虎杖［7 －8］、葡萄和花生等植物上，其中花生在我 国的研究起步最晚，特别是采用生物技术方法提高花生白藜 芦醇代谢能力的研究。Anne［9］等于 1983 年研究了花生愈伤 组织在紫外诱导下能合成白藜芦醇，Fabricio 等［10］采用发根 农杆菌诱导花生产生毛状根，经过乙酸钠诱导 24 h 后可显著 提高白藜芦醇合成量。国内姚庆收［11］ 等采用发根农杆菌 R1601 诱导花生产生毛状根，但未对毛状根培养进行研究。 笔者在国内首次研究不同理化因素对花生毛状根诱导的影 响，并对花生毛状根培养条件进行初步研究。 1 材料与方法 1． 1 材料 1． 1． 1 主要试剂及仪器。试剂： 植物组织及农杆菌培养用
试剂均为国产分析纯； 无水乙醇、DMSO、头孢霉素（ Cef） 为国 产分析纯； 乙酰丁香酮（ AS） 、白藜芦醇及白藜芦醇苷标准品 为 sigma 公司生产。仪器： 紫外分光光度计、超净台、摇床、烘 箱、超声波清洗器、高速冷冻离心机、恒温培养箱等。 1． 1． 2 供试材料。鲁花 11 号、花育 27 号花生品种由山东省 花生研究所提供。侵染菌种采用发根农杆菌 ATCC11325 购 于广东省微生物菌种保藏中心； 发根农杆菌 ACCC10060 由 大连工业大学生物工程学院张宗申教授提供。 1． 2 方法 1． 2． 1 无 菌 外 植 体 制 备。花 生 种 子 先 经 75% 乙 醇 消 毒 1 min后，用无菌水洗涤 1 次，再用 0． 1% HgCl2 消毒 15 min， 无菌水洗涤 4 ～ 5 次，剥去种皮后种植在无激素的 MS 固体培 养基上，置于温度（ 25 ± 1） ℃ 、光照 16 h / d 的培养室内培养。 1． 2． 2 菌种活化培养。将 － 70 ℃ 保存农杆菌甘油菌划线于 YEB 固体培养基上，28 ℃ 活化 3 次，挑取单菌落接种于 YEB 液体培养基中，28 ℃ 、160 r / min 振荡培养 16 h 即可用于外植 体侵染诱导毛状根。 1． 2． 3 发根农杆菌对头孢霉素敏感性研究。将过夜培养的 发根农杆菌用 YEB 液体培养基稀释至 OD600 = 0． 2，分别吸取 100 μl 发根农杆菌涂布于含有不同浓度 Cef 的 YEB 固体培 养基上，14 d 后观察记录发根农杆菌的生长情况。 1． 2． 4 毛状根诱导。采用浸泡的方法进行转化，将萌发 8 ～ 10 d 的幼叶、子叶、下胚轴浸泡于活化的菌液中侵染 5 ～ 25 min，取出并在 灭 菌 滤 纸 上 吸 去 多 余 的 菌 液，置 于 无 激 素 的
基金项目 作者简介
收稿日期
科技部作物种业科技工程（ 2011BAD35B04） 。 刘杰（ 1985 － ） ，男，江苏连云港人，硕士研究生，研究方向： 微生物生物制药技术。* 通讯作者，研究员，硕士生导师， 从事花生生物技术育种研究，E-mail： yuanbeauty@ 126． com。 2011-11-09
Induction and in vitro Culture of Hairy Roots in Peanut （ Arachis hypogaea L． ） LIU Jie et al （ School of Biological Engineering，Dalian Polytechnic University，Dalian，Liaoning 116034） Abstract ［Objective］To optimize the induction conditions of hairy roots in peanut，so as to lay foundation for producing resveratrol and the propagation of root-knot nematode．［Method］Effects of different Agrobacterium rhizogenes strains，explants type，bacteria concentration，co-culture time，infection time and AS concertration on the induction of hairy roots in peanuts were studied．［Result］Agrobacterium rhizogenes ACCC10060 had higher induction rate of hairy roots than strains ATCC11325． Leaflet had higher induction rate of hairy roots than cotyledon，the optimal bacteria concentration was 0． 2 － 0． 4 ，the optimal co-culture time was 2 d，the best infection time was 10 － 15 min，the dose of 75 μmol / L acetosyringone（ AS） could improve induction rate of hairy roots． Hairy roots could grow independently on MS medium without hormone，and presence of opines from hairy roots of peanut confirmed that Ri plasmid of Agrobacterium rhizogenes was integrated into the genome of peanut． Hairy roots grew faster in liquid culture than in solid culture，and the optimal medium was MS liquid medium without hormone． ［Conclusion］ Establishment of hairy roots culture system of peanut provided a foundation for the improvement of peanut transgenic technique，industrial production of resveratrol and propagation of sterile root-knot nematodes． Key words Arachis hypogaea L． ； Agrobacterium rhizogenes； Hairy roots； in vitro culture