微生物的分离与纯化 优质课件
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实验二微生物的分离纯化_图文_图文
④真空冷冻干燥法 加有保护剂的菌悬液在冻结状态下予以真空干 燥。 适用于各种微生物，便于大量保藏，菌种存活 时间长，是目前最好的保藏方法。 ⑤液氮超低温保藏法 将菌种置于保护剂中，预冻后保存在液氮超低 温冰箱中（ -196℃）。 适用于各种微生物的较理想的保藏方法。
几种常用菌种保藏方法的比较
方法名称
实验二微生物的分离纯化_图文_图文.ppt
内容提要
• 分离 • 纯化 • 形态观察
（1）接种
• 半固体培养基：穿刺接种 • 液体培养基接种 • 普通琼脂培养基：涂布平板，平板划线接种，斜
面划线接种 • 浅盘固体接种
划线接种注意要点
• 划线时接种环与平皿约成30-40度角,轻轻接触, 以腕力在琼脂表面轻快滑动,不能划破琼脂.
同一细菌在不同的培养平板上形成不同的特征菌落
（4）菌种保藏
• 最常见的保藏方法：斜面 • 细菌的保藏：甘油保藏 • 真菌的保藏：石蜡油保藏、孢子保藏
菌种保藏的方法
菌 种 保 藏 方 法
连续在培养基上（内）移种
生活态 传代培养保藏法 连续在活宿主上（内）移种
固体斜面
湿法 半固体琼脂柱
真菌分离
• 利用低碳／氮比的培养基可使真菌生长菌落 分散，利于计数，分离和鉴定。这里主要是 利用营养成分的减少而使生长减慢，并由此 限制真菌的迁涉生长。
• 一般采用PDA培养基 • 改变培养温度将有利于不同嗜温区真菌的分
离。 • 有时，真菌子实体形成必须有光线，这在分
离培养时应加以考虑。
（2）纯化
2、琼脂平板在使用前应置于37℃培养箱中孵育l 、2天。
3、培养基的生物物理学参数，如pH及盐分也应 调节到与试样的生态系统参数值相近。
实验十二---土壤中微生物的分离纯化-PPT
三、实验器材
1、土壤样品（自带） 2、培养基：淀粉琼脂培养基（高氏Ⅰ号培养基），牛 肉膏蛋白胨琼脂培养基，马丁氏琼脂培养基。 3、溶液和试剂：10％酚，链霉素，盛9ml无菌水的试 管，盛99ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶。 4、仪器和其他用品：无菌玻璃涂棒，无菌吸管，无菌 培养皿等。
四、操作步骤
五、实验报告
１、将培养后菌落计数结果填入表格（实验教材P34表II-5） ２、你所做的涂布平板法是否较好地得到了单菌落？如果不 是，请分析其原因。 ３、在３种不同的平板上你分离得到那些类群的微生物？简 述它们的菌落形态特征。
六、思考题
1、如何确定平板上单个菌落是否为纯培养？请写出实验的主要步骤。 2、如果要分离得到极端嗜盐细菌，在什么地方取样，分离培养基有何 特点？说明理由。 3、怎样判断稀释涂布平板计数数据是否可靠？需要掌握哪几个关键？ 4、为什么高氏Ⅰ号培养基和马丁氏琼脂培养基中要分别加入酚和链霉 素？如果用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基分离一种对青霉素具有抗性的细 菌，你认为应如何做？ 5、某单位希望检测一种干酵母粉中的活菌存活率，请设计1-2种可行 的检测方法。
2、稀释土样
制备土壤稀释液称取土样10g，放入盛90ml无菌水并带有玻璃珠 的三角烧瓶中，振摇约20分钟，使土样与水充分混合，将菌分散。用 一支1ml无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液注入盛有9ml无菌水的试管中， 吹吸三次，使充分混匀。然后再用一支1ml无菌吸管从此试管中吸取 1ml注入另一盛有9ml无菌水的试管中，以此类推制成10-1、10-2、103、10-4、10-5、10-6各种稀释度的土壤溶液。
由于土壤具备了各种微生物生长发育所需要的营养、水分、空气、 酸碱度、渗透压和温度等条件，所以成了微生物生活的良好环境。可以 说，土壤是微生物的“天然培养基”，也是它们的“大本营”因此，土壤是 微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，人们可与从 中分离、纯生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。 因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征 等综合考虑。有些微生物的纯培养要经过一系列的分离与纯化过程和多种特征 （产酸产气情况、染色情况、营养要求、氧气需求、酸碱度、渗透压和温度等） 鉴定方能得到。从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过 程称为微生物的分离与纯化。
学习情境九微生物的分离纯化与保藏技术优秀课件
分离(isolation)：从混杂微生物群体中获得只 含有某一种微生物的过程称为微生物分离与纯 化。
用固体培养基分离
用液体培养基分离
单细胞分离
富集分离
1. 利用固体培养基分离
原理：
微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落， 通常是由一个细胞繁殖而成的集合体
因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养
连续稀释的过程
平板划线分离的方法
1.斜线法 2.曲线法 3.方格法 4.放射法 5.四格法
2. 用液体培养基分离纯培养
稀释法原理： 连续稀释，使一只试管里分配不到一个微生物
如果大多数平行稀释管里没有微生物生长，那么 有微生物生长的试管得到的培养物就是纯培养物
3. 单细胞挑取分离法
4. 富集分离法
将菌种置于土壤、细纱、滤纸、硅胶等干燥材料上保藏。 如砂土管法，适用于放线菌、芽孢菌和某些真菌保藏， 保藏时间几至几十年。
④真空冷冻干燥法 加有保护剂的菌悬液在冻结状态下予以真空干燥。 适用于各种微生物，便于大量保藏，菌种存活时间长，是
目前最好的保藏方法。 ⑤液氮超低温保藏法 将菌种置于保护剂中，预冻后保存在液氮超低温冰箱中
（1）稀释倾注平板法（pour plate method）
•先将待分离的材料用无菌水作一系列的稀释（如 1 ∶ 10 、 1 ∶ 100 、 1 ∶ 1000 …） •然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至 45 ℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌 的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂 平板，保温培养一定时间即可出出菌落 •如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出 现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌 细胞繁殖形成的 •随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可 得到纯培养
用固体培养基分离
用液体培养基分离
单细胞分离
富集分离
1. 利用固体培养基分离
原理：
微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落， 通常是由一个细胞繁殖而成的集合体
因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养
连续稀释的过程
平板划线分离的方法
1.斜线法 2.曲线法 3.方格法 4.放射法 5.四格法
2. 用液体培养基分离纯培养
稀释法原理： 连续稀释，使一只试管里分配不到一个微生物
如果大多数平行稀释管里没有微生物生长，那么 有微生物生长的试管得到的培养物就是纯培养物
3. 单细胞挑取分离法
4. 富集分离法
将菌种置于土壤、细纱、滤纸、硅胶等干燥材料上保藏。 如砂土管法，适用于放线菌、芽孢菌和某些真菌保藏， 保藏时间几至几十年。
④真空冷冻干燥法 加有保护剂的菌悬液在冻结状态下予以真空干燥。 适用于各种微生物，便于大量保藏，菌种存活时间长，是
目前最好的保藏方法。 ⑤液氮超低温保藏法 将菌种置于保护剂中，预冻后保存在液氮超低温冰箱中
（1）稀释倾注平板法（pour plate method）
•先将待分离的材料用无菌水作一系列的稀释（如 1 ∶ 10 、 1 ∶ 100 、 1 ∶ 1000 …） •然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至 45 ℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌 的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂 平板，保温培养一定时间即可出出菌落 •如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出 现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌 细胞繁殖形成的 •随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可 得到纯培养
微生物的分离与纯化
过滤
矫正pH〔7.0-
7.6〕
分装过滤
灭菌〔121.3℃，20-30
分钟〕
鉴定是否有菌
放入冰
箱冷藏备用
2、因高压之后pH值会下降0.1左右，所以矫 正pH时应比所需的pH高
3、鉴定是否有菌可将培养基置于37 ℃培养 24小时，然后观察
枯燥箱
细菌过滤器
用于滤过除菌的各式滤器
坐
手提式灭菌锅
式
灭
〔3〕溶解 向烧杯内参加所需的水量，将牛肉膏用 水洗下后，取出硫酸纸弃去。加热搅拌全溶后稍 放冷。
〔4〕调pH值 用酸度计或精细pH试纸测定其pH值， 并用10％NaOH调至所需pH值，必要时用滤纸 或脱脂棉过滤。一般比要求的pH高出0.2，因为 高压蒸汽灭菌后，pH常降低。
〔5〕分装 根据不同需要，可将配好的培养基分装 入配有棉塞的试管或三角瓶内〔附图1-1〕
养基的一般方法和步骤； 3、了解加压蒸汽灭菌的原理，并掌握其具
体操作方法； 4、了解土壤微生物的别离纯化的根本原理； 5、学习并掌握微生物别离纯化技术方法。
一、培养基的制备与灭菌
培养基是人工配制的微生物生活环境， 其主要用途是繁殖及别离接种微生物， 传代或保存微生物，鉴别微生物的类属， 研究微生物的生理及生化特性，制造菌 苗、疫苗或其他微生物制剂等。其营养 成分包括微生物生长所需要的水分、碳 源、氮源、无机盐及某些生长因子〔维 生素、辅酶〕等。
3.培养基、无菌水、器皿的灭菌
1.将培养基、无菌水放入高压蒸汽灭菌锅内， 湿热灭菌。
2.灭菌完毕，将试管培养基搁成斜面。 3.器皿放入干热灭菌箱内，加热灭菌。
二、土壤微生物的别离、纯化
土壤是微生物生活的大本营，其中含有大量不同 类型的微生物，可按照一定的方法将各类微生物 通过别离进展纯培养，并能对特定类群进展数量 测定。
微生物的分离和纯培养 PPT课件(共4个) 中图版
微生物的分离和纯培养
（实验11）
• 目的要求
1．学会将混杂的微生物分离成纯种，掌握 统计分析样品中微生物的种类和数量的 方法。
2．学会从菌落及培养形态特征区分细菌、 放线菌和霉菌。
3．掌握几种纯化微生物的基本操作技术 （制作平板、连续稀释、平板划线）
实验原理
• 自然界中不同种类的微生物混杂生活在一起， 要研究某种微生物的特性，必须从混杂的微生 物类群中分离它，使该微生物处于纯培养状态 这种获得纯培养的方法称为微生物的分离与纯 化。
•
27、我们无法选择自己的出身，可是我们的未来是自己去改变的。励志名言：比别人多一点执着，你就会创造奇迹
•
28、伟人之所以伟大，是因为他与别人共处逆境时，别人失去了信心，他却下决心实现自己的目标。
•
29、人生就像一道漫长的阶梯，任何人也无法逆向而行，只能在急促而繁忙的进程中，偶尔转过头来，回望自己留下的蹒跚脚印。
•
17、一个人只要强烈地坚持不懈地追求，他就能达到目的。你在希望中享受到的乐趣，比将来实际享受的乐趣要大得多。
•
18、无论是对事还是对人，我们只需要做好自己的本分，不与过多人建立亲密的关系，也不要因为关系亲密便掏心掏肺，切莫交浅言深，应适可而止。
•
19、大家常说一句话，认真你就输了，可是不认真的话，这辈子你就废了，自己的人生都不认真面对的话，那谁要认真对待你。
•
15、所有的辉煌和伟大，一定伴随着挫折和跌倒；所有的风光背后，一定都是一串串揉和着泪水和汗水的脚印。
• 1 土壤样品 • 2 培养基 （1）牛肉膏蛋白胨培养基 （2）高氏1号培养基 （பைடு நூலகம்）马铃薯培养基（PDA培养基）
实验方法与步骤
• 1.平板的制作： 将已灭菌的培养基融化，冷却到40-50℃， 倒平板。
（实验11）
• 目的要求
1．学会将混杂的微生物分离成纯种，掌握 统计分析样品中微生物的种类和数量的 方法。
2．学会从菌落及培养形态特征区分细菌、 放线菌和霉菌。
3．掌握几种纯化微生物的基本操作技术 （制作平板、连续稀释、平板划线）
实验原理
• 自然界中不同种类的微生物混杂生活在一起， 要研究某种微生物的特性，必须从混杂的微生 物类群中分离它，使该微生物处于纯培养状态 这种获得纯培养的方法称为微生物的分离与纯 化。
•
27、我们无法选择自己的出身，可是我们的未来是自己去改变的。励志名言：比别人多一点执着，你就会创造奇迹
•
28、伟人之所以伟大，是因为他与别人共处逆境时，别人失去了信心，他却下决心实现自己的目标。
•
29、人生就像一道漫长的阶梯，任何人也无法逆向而行，只能在急促而繁忙的进程中，偶尔转过头来，回望自己留下的蹒跚脚印。
•
17、一个人只要强烈地坚持不懈地追求，他就能达到目的。你在希望中享受到的乐趣，比将来实际享受的乐趣要大得多。
•
18、无论是对事还是对人，我们只需要做好自己的本分，不与过多人建立亲密的关系，也不要因为关系亲密便掏心掏肺，切莫交浅言深，应适可而止。
•
19、大家常说一句话，认真你就输了，可是不认真的话，这辈子你就废了，自己的人生都不认真面对的话，那谁要认真对待你。
•
15、所有的辉煌和伟大，一定伴随着挫折和跌倒；所有的风光背后，一定都是一串串揉和着泪水和汗水的脚印。
• 1 土壤样品 • 2 培养基 （1）牛肉膏蛋白胨培养基 （2）高氏1号培养基 （பைடு நூலகம்）马铃薯培养基（PDA培养基）
实验方法与步骤
• 1.平板的制作： 将已灭菌的培养基融化，冷却到40-50℃， 倒平板。
《生物分离与纯化》课件
阻色谱等。
精细分离的效果取决于目标物质 的性质、分离方法和分离条件的 选择，需根据实际情况进行调整
。
纯化与鉴定
纯化与鉴定的目的是进一步去除杂质，提高目标物质的纯度和鉴定其性质 。
常用的纯化方法有超滤、结晶和电泳等。鉴定方法包括光谱分析、质谱分 析和免疫分析等。
纯化与鉴定的效果取决于目标物质的性质、纯化和鉴定方法的选择以及实 验条件，需根据实际情况进行调整。
离心法
离心法
利用不同物质在离心力场中的沉降速度不同 ，将悬浮液中的物质进行分离的方法。
速率区带离心法
利用不同颗粒在离心力场中的运动轨迹不同 ，将颗粒按大小和密度进行分离。
差速离心法
通过逐渐增加离心力，将不同大小的颗粒分 离开。
密度梯度离心法
在离心管中加入密度梯度介质，使不同密度 的颗粒在离心力场中分离。
实验效率的提高
提高实验效率是生物分离与纯化的关 键，可以缩短实验时间并降低成本。
优化实验流程，如减少样品处理时间 、提高自动化程度等，也可以提高实 验效率。
选择高效的分离方法，如高效液相色 谱、快速色谱等，可以显著提高实验 效率。
06
生物分离与纯化的未来发展
新技术的应用
1 2
人工智能与机器学习
初步分离的目的是将破碎后的细胞混合物分离成 各个组分，如蛋白质、核酸和脂质等。
常用的初步分离方法有离心分离、过滤分离和沉 淀分离等。
初步分离的效果取决于分离方法和分离条件的选 择，需根据实际情况进行调整。
精细分离
精细分离的目的是从初步分离后 的组分中进一步分离出目标物质
，如蛋白质、酶和核酸等。
常用的精细分离方法有亲和色谱 、离子交换色谱、凝胶色谱和排
电泳法
精细分离的效果取决于目标物质 的性质、分离方法和分离条件的 选择，需根据实际情况进行调整
。
纯化与鉴定
纯化与鉴定的目的是进一步去除杂质，提高目标物质的纯度和鉴定其性质 。
常用的纯化方法有超滤、结晶和电泳等。鉴定方法包括光谱分析、质谱分 析和免疫分析等。
纯化与鉴定的效果取决于目标物质的性质、纯化和鉴定方法的选择以及实 验条件，需根据实际情况进行调整。
离心法
离心法
利用不同物质在离心力场中的沉降速度不同 ，将悬浮液中的物质进行分离的方法。
速率区带离心法
利用不同颗粒在离心力场中的运动轨迹不同 ，将颗粒按大小和密度进行分离。
差速离心法
通过逐渐增加离心力，将不同大小的颗粒分 离开。
密度梯度离心法
在离心管中加入密度梯度介质，使不同密度 的颗粒在离心力场中分离。
实验效率的提高
提高实验效率是生物分离与纯化的关 键，可以缩短实验时间并降低成本。
优化实验流程，如减少样品处理时间 、提高自动化程度等，也可以提高实 验效率。
选择高效的分离方法，如高效液相色 谱、快速色谱等，可以显著提高实验 效率。
06
生物分离与纯化的未来发展
新技术的应用
1 2
人工智能与机器学习
初步分离的目的是将破碎后的细胞混合物分离成 各个组分，如蛋白质、核酸和脂质等。
常用的初步分离方法有离心分离、过滤分离和沉 淀分离等。
初步分离的效果取决于分离方法和分离条件的选 择，需根据实际情况进行调整。
精细分离
精细分离的目的是从初步分离后 的组分中进一步分离出目标物质
，如蛋白质、酶和核酸等。
常用的精细分离方法有亲和色谱 、离子交换色谱、凝胶色谱和排
电泳法
微生物的分离和纯培养ppt(共4个)精品课件
平均菌落数×稀释倍数 微生物的细胞个数（个/g）＝ 土壤克数
微生物分离基本方法及原则
分离微生物时一般是根据该微生物对营养， pH，氧气，温度等要求的不同，供给它们合 适的条件或加入某种抑制剂，形成只利于该菌 种生长，不利于其他菌种生长的环境，从而淘 汰不需要的菌种。
(1)分离细菌：取10-7、10-8两个稀释度各0.2ml加入 培养皿中，涂布牛肉膏蛋白胨平板，37℃倒置培 养，24小时。 (2) (2) 分离霉菌：取10-5、10-6两个稀释度各0.2ml，涂 布土豆平板（倒平板前在土豆培养基中加入80% 的乳酸5滴），28℃倒置培养，3～4天。 (3) 分离放线菌：取10-5、10-6两个稀释度各0.2ml， （制备菌悬液时，应先加入10%酚10滴）涂布淀 粉平板，28℃倒置培养，7～10天。
大肠杆菌菌落
伊红美蓝培养基
曲霉
酵母菌落
霉菌菌落 青霉
放线菌菌落
A：诺尔斯氏链霉菌 B：皮疽诺卡氏菌 C：酒红指孢囊菌 D：游动放线菌 E：小单胞菌 F：马杜拉放线菌
产抗菌素的放线菌
A：卡特利链霉菌 B：弗氏链霉菌 C：吸水链霉菌金泪亚种 D：卡那霉素链霉菌 E：除虫链霉菌 F：生磺酸链霉菌
实验材料
微生物的分离和纯培养
（实验11）
• 目的要求
1．学会将混杂的微生物分离成纯种，掌握 统计分析样品中微生物的种类和数量的 方法。 2．学会从菌落及培养形态特征区分细菌、 放线菌和霉菌。 3．掌握几种纯化微生物的基本操作技术 （制作平板、连续稀释、平板划线）
实验原理
• 自然界中不同种类的微生物混杂生活在一起， 要研究某种微生物的特性，必须从混杂的微生 物类群中分离它，使该微生物处于纯培养状态 这种获得纯培养的方法称为微生物的分离与纯 化。
微生物的分离纯化和培养技术124页PPT
查氏培养基冷却至55-60℃时，混匀后倒平板，牛肉膏蛋 白胨培养基倒4皿，高氏I号培养基和查氏培养基各倒3皿。
2、制备污水稀释液：10g土样，加入90ml无菌水中， 在三角瓶中振摇20min。取0.5ml 加入盛有4.5ml无菌水 的试管中，以此类推，制成不同稀释度。
3、涂布：将上述每种培养基平板底面标记稀释度，然 后用无菌吸管从最后三种稀释度，即10-4、10-5和10-6的 试管中吸取0.1ml对号放入平板上，用玻棒涂布。
微生物的分离、纯化及培养技术
分离与纯化：从混杂的微生物群体中获得 只含某一种或某一株微生物的过程。
为什么要进行纯培养：平板上的单一菌落 并不一定保证是一种菌。
常用的分离、纯化方法： 单细胞挑取法、稀释涂布平板法 稀释混合平板法、平板划线法
吉林大学生物基础实验教学中心
一. 目的要求 二. 实验原理 三. 微生物培养技术 四. 结果观察
（4）用小指、无名指和手掌拔下试管塞，并持于手中。 （5）将试管口在火焰上微烧一周。 （6）参照图（7-1） （7）将接种环抽出，灼烧管口。 （8）塞上棉塞。 （9）将接种环经火焰灼烧灭菌。
吉林大学生物基础实验教学中心
将已接种的斜面、半固体和液体 培养基放置培养箱中培养将生长好的 菌种用牛皮纸包好，置4℃冰箱中保 存。
接种
吉林大学生物基础实验教学中心
培养
吉林大学生物基础实验教学中心
微生物的纯化培养
吉林大学生物基础实验教学中心
吉林大学生物基础实验教学中心
平板划线法： 1、倒平板，标记培养基名称，编号和实 验日期。 2、划线方法
稀释混合平板法 ： 1、先加菌 2、倒平板时注意培养基温度 3、混合均匀
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2、制备污水稀释液：10g土样，加入90ml无菌水中， 在三角瓶中振摇20min。取0.5ml 加入盛有4.5ml无菌水 的试管中，以此类推，制成不同稀释度。
3、涂布：将上述每种培养基平板底面标记稀释度，然 后用无菌吸管从最后三种稀释度，即10-4、10-5和10-6的 试管中吸取0.1ml对号放入平板上，用玻棒涂布。
微生物的分离、纯化及培养技术
分离与纯化：从混杂的微生物群体中获得 只含某一种或某一株微生物的过程。
为什么要进行纯培养：平板上的单一菌落 并不一定保证是一种菌。
常用的分离、纯化方法： 单细胞挑取法、稀释涂布平板法 稀释混合平板法、平板划线法
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一. 目的要求 二. 实验原理 三. 微生物培养技术 四. 结果观察
（4）用小指、无名指和手掌拔下试管塞，并持于手中。 （5）将试管口在火焰上微烧一周。 （6）参照图（7-1） （7）将接种环抽出，灼烧管口。 （8）塞上棉塞。 （9）将接种环经火焰灼烧灭菌。
吉林大学生物基础实验教学中心
将已接种的斜面、半固体和液体 培养基放置培养箱中培养将生长好的 菌种用牛皮纸包好，置4℃冰箱中保 存。
接种
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培养
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微生物的纯化培养
吉林大学生物基础实验教学中心
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平板划线法： 1、倒平板，标记培养基名称，编号和实 验日期。 2、划线方法
稀释混合平板法 ： 1、先加菌 2、倒平板时注意培养基温度 3、混合均匀
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最新微生物分离与纯化技术PPT课件
法，从而获
得若干种微生物纯培养技能。
平板制作的操作注意：
➢融化培养基时不要溢出烧瓶或糊底 ➢无菌操作下，打开培养皿的操作 ➢一根１mL移液管多次移液先移低浓度悬浊液，再移高浓度悬浊液。 移液管可以用稀释悬浊液的那根在无菌操作下接着做，也可另取一根无菌的。 ➢为什么培养皿要倒置培养
(二)平板划线分离法（以分离细菌为例）
➢ 每组准备两套无菌培养皿,在皿底菌名、班级、组别。 ➢融化培养基，在45-50℃ 恒温水浴锅中备用 ➢制备平板：无菌操作下，打开培养皿，倒入45-50℃融化的 细菌培养基约1/4-1/3培养皿高度。培养皿平放在桌上，培养 基冷凝后即成平板。
➢ 平板划线:无菌操作下,用接种环挑取一环10-1土壤悬浊液, 在平板上轻轻划线(切勿划破培养基)划线的方式可取下图
➢恒温培养:平板倒置于28-30℃恒温箱中,培养１-２天后观 察细菌菌落形态。 ➢转接纯化:挑取单个菌落,接种到新鲜平板上,培养观察,直至 纯化
平板划线的操作注意：
➢ 接种换环的使用 ➢ 分区域划线，划完第一个区域，烧掉接种环上的剩余物，
接种环冷却后，通过第一次划线部分，做第二次划线，依 次类推，目的是稀释微生物浓度，使长成单个菌落。
结束语
谢谢大家聆听！！！
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得若干种微生物纯培养技能。
平板制作的操作注意：
➢融化培养基时不要溢出烧瓶或糊底 ➢无菌操作下，打开培养皿的操作 ➢一根１mL移液管多次移液先移低浓度悬浊液，再移高浓度悬浊液。 移液管可以用稀释悬浊液的那根在无菌操作下接着做，也可另取一根无菌的。 ➢为什么培养皿要倒置培养
(二)平板划线分离法（以分离细菌为例）
➢ 每组准备两套无菌培养皿,在皿底菌名、班级、组别。 ➢融化培养基，在45-50℃ 恒温水浴锅中备用 ➢制备平板：无菌操作下，打开培养皿，倒入45-50℃融化的 细菌培养基约1/4-1/3培养皿高度。培养皿平放在桌上，培养 基冷凝后即成平板。
➢ 平板划线:无菌操作下,用接种环挑取一环10-1土壤悬浊液, 在平板上轻轻划线(切勿划破培养基)划线的方式可取下图
➢恒温培养:平板倒置于28-30℃恒温箱中,培养１-２天后观 察细菌菌落形态。 ➢转接纯化:挑取单个菌落,接种到新鲜平板上,培养观察,直至 纯化
平板划线的操作注意：
➢ 接种换环的使用 ➢ 分区域划线，划完第一个区域，烧掉接种环上的剩余物，
接种环冷却后，通过第一次划线部分，做第二次划线，依 次类推，目的是稀释微生物浓度，使长成单个菌落。
结束语
谢谢大家聆听！！！
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体操作方法； 4、了解土壤微生物的分离纯化的基本原理； 5、学习并掌握微生物分离纯化技术方法。
一、培养基的制备与灭菌
培养基是人工配制的微生物生活环境， 其主要用途是繁殖及分离接种微生物， 传代或保存微生物，鉴别微生物的类属， 研究微生物的生理及生化特性，制造菌 苗、疫苗或其他微生物制剂等。其营养 成分包括微生物生长所需要的水分、碳 源、氮源、无机盐及某些生长因子（维 生素、辅酶）等。
四、实验方法和步骤
1、微生物常用玻璃仪器的包扎和棉塞的制作 培养皿的包装每10套一包，用旧报纸包扎 （或放在特制铁皮圆筒里，加盖扣严）。 吸管的包装首先在吸管的上端塞上一小段棉
花，用长纸条包扎、打结。 玻璃涂布棒的包装方法同吸管的包装。 三角瓶的包扎
1.牛肉膏蛋白胨培养基的制备
（1）计算
（2）称量 准确称取各种成分。
（3）溶解 向烧杯内加入所需的水量，将牛肉膏用 水洗下后，取出硫酸纸弃去。加热搅拌全溶后稍 放冷。
（4）调pH值 用酸度计或精密pH试纸测定其pH值， 并用10％NaOH调至所需pH值，必要时用滤纸或脱 脂棉过滤。一般比要求的pH高出0.2，因为高压 蒸汽灭菌后，pH常降低。
（5）分装 根据不同需要，可将配好的培养基分装 入配有棉塞的试管或三角瓶内（附图1-1）
（6）包扎 试管扎成捆。
（7）灭菌 高压蒸汽灭菌15~20min。
1、牛肉膏蛋白胨培养基配方：牛肉膏 3.0g、蛋白胨 10g、 NaCl 5.0g、水1000ml、 PH7.4-7.6
2、高氏1号培养基（放线菌）
可溶性淀粉 20g 、 NaCl 0.5g、琼脂 15-20g、 FeSO4·7H20 0.01g、MgSO4·7H20 0.5g 、 KNO3 1g 、 K2PO4·3H20 0.5g、水 1000ml、 PH7.47.6
＝平均菌落数×稀释倍数 土壤样品水分系数 ＝1∕（1–样品水分百分数） 土壤样品细菌数量（个∕克干土） ＝每克湿土样细菌数量×样品水分系数
思考题
1.培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如何检 查灭菌后的培养菌是无菌的？
2.加压蒸汽灭菌的原理是什么？是否只要压力表 上的指针指到所需的压力时就能达到所需灭菌温 度？为什么？
（2）试管斜面固体培养基的制备
a.称量按培养基配方比例依次准确地称取药 品，放入在瓷缸内。 （注意药品称量顺序） b. 加入定量的琼脂、水，煮沸，溶解 c.完全溶解后，补充水分，调pH值 d.，包 扎，灭菌，灭菌完后摆斜面。
3. 土壤微生物分离要注意什么问题？ 4.管口、瓶口为什么要用棉塞？能否用木塞或棉
过滤
矫正pH（7.0-7.6）
分装过滤
灭菌（121.3℃，20-
30分钟） 鉴定是否有菌
放入冰
箱冷藏备用
2、因高压之后pH值会下降0.1左右，所以矫 正pH时应比所需的pH高
3、鉴定是否有菌可将培养基置于37 ℃培养24 小时，然后观察
干燥箱
细菌过滤器
用于滤过除菌的各式滤器
坐
手提式灭菌锅
式
灭
菌
锅
卧式灭菌锅
高压蒸汽灭菌器
三、实验器材
1、试剂：牛肉膏、蛋白胨、可溶性淀粉、 NaCl、PH试纸、琼脂、葡萄糖、孟加拉红、 FeSO4·7H20、MgSO4·7H20、 KNO3、 K2PO3·3H20
2.仪器及其它
试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻棒、天平、药匙、高压蒸 汽灭菌锅、pH试纸(5.5-9.0)、棉花、牛皮纸、记号笔、麻 绳、纱布、干燥箱、培养皿、涂布棒、吸管（1ml）、玻 璃珠
3、马丁氏培养基（真菌）
KH2PO4 1g、 MgSO4·7H20 0.5g 、蛋白胨 5g、葡 萄糖 10g、琼脂 15-20g、水 1000ml、 PH
2. 培养基的制备与分装
（1）三角瓶固体培养基的制备 1.称量按培养基配方比例依次准确地称取药 品，放入在瓷缸内。 （注意药品称量顺序） 2. 加入定量的琼脂、水，煮沸，溶解 3.完全溶解后，补充水分，调pH值（不要调 过头） 4.分装置三角瓶中，注意装液量 5. 加棉塞，包扎，高压蒸汽灭 菌,121℃,0.10Mpa,20min
2、制备土样稀释液 吹吸几次混匀 另留一管不稀释留作对照（CK）
无菌操作
倾注法接种
先按10-6，10-5的顺序将不同稀释度菌悬液接 入对应平皿中（每个平皿接入1ml），再向每 个平皿倾注约15 ml的牛肉膏蛋白胨培养基 （48℃）待冷凝，混合均匀。
分区划线法纯化
计数
要求30~300之间计数。CK除外 每克湿土样细菌数量
实验一、微生物的分离与纯化
一、培养基的制备与灭菌
1.牛肉膏蛋白胨培养基（细菌） 2.高氏1号培养基（放线菌） 3.马丁氏培养基（真菌）
二、土壤微生物的分离、纯化
实验目的
1、熟悉培养基制作原理； 2、通过对几种培养基的配制，掌握配制培
养基的一般方法和步骤； 3、了解加压蒸汽灭菌的原理，并掌握其具
基本原理：是通过稀释使菌体细胞充分 分散，单细胞得以生长发育形成菌落， 可使用稀释法或平板划线法进一步纯化， 还可通过平板菌落计数，推算单位重量 土壤样品含有微生物的数量。
实验步骤：
1、采样一般定点于耕作层0--20cm，先除 去表土1--2cm，以无菌铲采土足量充分混 匀后用无菌塑料袋分装。
3.培养基、无菌水、器皿的灭菌
1.将培养基、无菌水放入高压蒸汽灭菌锅内， 湿热灭菌。
2.灭菌完毕，将试管培养基搁成斜面。 3.器皿放入干热灭菌箱内，加热灭菌。
二、土壤微生物的分离、纯化
土壤是微生物生活的大本营，其中含有大量不同 类型的微生物，可按照一定的方法将各类微生物 通过分离进行纯培养，并能对特定类群进行数量 测定。
二、实验原理
1、满足微生物生长培养所需的营养要素： 碳源、氮源、无机盐、维生素、生长因子等 2、合适PH值 3、抑制其它微生物生长的物质。
分类
主要用于增菌 用于检测动力及保存菌种 用于分离鉴定细菌
分类
普通琼脂培养基 血液琼脂培养基 三糖铁培养基 SS培养基 庖肉培养基
培养基的制备程序
1、调配
一、培养基的制备与灭菌
培养基是人工配制的微生物生活环境， 其主要用途是繁殖及分离接种微生物， 传代或保存微生物，鉴别微生物的类属， 研究微生物的生理及生化特性，制造菌 苗、疫苗或其他微生物制剂等。其营养 成分包括微生物生长所需要的水分、碳 源、氮源、无机盐及某些生长因子（维 生素、辅酶）等。
四、实验方法和步骤
1、微生物常用玻璃仪器的包扎和棉塞的制作 培养皿的包装每10套一包，用旧报纸包扎 （或放在特制铁皮圆筒里，加盖扣严）。 吸管的包装首先在吸管的上端塞上一小段棉
花，用长纸条包扎、打结。 玻璃涂布棒的包装方法同吸管的包装。 三角瓶的包扎
1.牛肉膏蛋白胨培养基的制备
（1）计算
（2）称量 准确称取各种成分。
（3）溶解 向烧杯内加入所需的水量，将牛肉膏用 水洗下后，取出硫酸纸弃去。加热搅拌全溶后稍 放冷。
（4）调pH值 用酸度计或精密pH试纸测定其pH值， 并用10％NaOH调至所需pH值，必要时用滤纸或脱 脂棉过滤。一般比要求的pH高出0.2，因为高压 蒸汽灭菌后，pH常降低。
（5）分装 根据不同需要，可将配好的培养基分装 入配有棉塞的试管或三角瓶内（附图1-1）
（6）包扎 试管扎成捆。
（7）灭菌 高压蒸汽灭菌15~20min。
1、牛肉膏蛋白胨培养基配方：牛肉膏 3.0g、蛋白胨 10g、 NaCl 5.0g、水1000ml、 PH7.4-7.6
2、高氏1号培养基（放线菌）
可溶性淀粉 20g 、 NaCl 0.5g、琼脂 15-20g、 FeSO4·7H20 0.01g、MgSO4·7H20 0.5g 、 KNO3 1g 、 K2PO4·3H20 0.5g、水 1000ml、 PH7.47.6
＝平均菌落数×稀释倍数 土壤样品水分系数 ＝1∕（1–样品水分百分数） 土壤样品细菌数量（个∕克干土） ＝每克湿土样细菌数量×样品水分系数
思考题
1.培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如何检 查灭菌后的培养菌是无菌的？
2.加压蒸汽灭菌的原理是什么？是否只要压力表 上的指针指到所需的压力时就能达到所需灭菌温 度？为什么？
（2）试管斜面固体培养基的制备
a.称量按培养基配方比例依次准确地称取药 品，放入在瓷缸内。 （注意药品称量顺序） b. 加入定量的琼脂、水，煮沸，溶解 c.完全溶解后，补充水分，调pH值 d.，包 扎，灭菌，灭菌完后摆斜面。
3. 土壤微生物分离要注意什么问题？ 4.管口、瓶口为什么要用棉塞？能否用木塞或棉
过滤
矫正pH（7.0-7.6）
分装过滤
灭菌（121.3℃，20-
30分钟） 鉴定是否有菌
放入冰
箱冷藏备用
2、因高压之后pH值会下降0.1左右，所以矫 正pH时应比所需的pH高
3、鉴定是否有菌可将培养基置于37 ℃培养24 小时，然后观察
干燥箱
细菌过滤器
用于滤过除菌的各式滤器
坐
手提式灭菌锅
式
灭
菌
锅
卧式灭菌锅
高压蒸汽灭菌器
三、实验器材
1、试剂：牛肉膏、蛋白胨、可溶性淀粉、 NaCl、PH试纸、琼脂、葡萄糖、孟加拉红、 FeSO4·7H20、MgSO4·7H20、 KNO3、 K2PO3·3H20
2.仪器及其它
试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻棒、天平、药匙、高压蒸 汽灭菌锅、pH试纸(5.5-9.0)、棉花、牛皮纸、记号笔、麻 绳、纱布、干燥箱、培养皿、涂布棒、吸管（1ml）、玻 璃珠
3、马丁氏培养基（真菌）
KH2PO4 1g、 MgSO4·7H20 0.5g 、蛋白胨 5g、葡 萄糖 10g、琼脂 15-20g、水 1000ml、 PH
2. 培养基的制备与分装
（1）三角瓶固体培养基的制备 1.称量按培养基配方比例依次准确地称取药 品，放入在瓷缸内。 （注意药品称量顺序） 2. 加入定量的琼脂、水，煮沸，溶解 3.完全溶解后，补充水分，调pH值（不要调 过头） 4.分装置三角瓶中，注意装液量 5. 加棉塞，包扎，高压蒸汽灭 菌,121℃,0.10Mpa,20min
2、制备土样稀释液 吹吸几次混匀 另留一管不稀释留作对照（CK）
无菌操作
倾注法接种
先按10-6，10-5的顺序将不同稀释度菌悬液接 入对应平皿中（每个平皿接入1ml），再向每 个平皿倾注约15 ml的牛肉膏蛋白胨培养基 （48℃）待冷凝，混合均匀。
分区划线法纯化
计数
要求30~300之间计数。CK除外 每克湿土样细菌数量
实验一、微生物的分离与纯化
一、培养基的制备与灭菌
1.牛肉膏蛋白胨培养基（细菌） 2.高氏1号培养基（放线菌） 3.马丁氏培养基（真菌）
二、土壤微生物的分离、纯化
实验目的
1、熟悉培养基制作原理； 2、通过对几种培养基的配制，掌握配制培
养基的一般方法和步骤； 3、了解加压蒸汽灭菌的原理，并掌握其具
基本原理：是通过稀释使菌体细胞充分 分散，单细胞得以生长发育形成菌落， 可使用稀释法或平板划线法进一步纯化， 还可通过平板菌落计数，推算单位重量 土壤样品含有微生物的数量。
实验步骤：
1、采样一般定点于耕作层0--20cm，先除 去表土1--2cm，以无菌铲采土足量充分混 匀后用无菌塑料袋分装。
3.培养基、无菌水、器皿的灭菌
1.将培养基、无菌水放入高压蒸汽灭菌锅内， 湿热灭菌。
2.灭菌完毕，将试管培养基搁成斜面。 3.器皿放入干热灭菌箱内，加热灭菌。
二、土壤微生物的分离、纯化
土壤是微生物生活的大本营，其中含有大量不同 类型的微生物，可按照一定的方法将各类微生物 通过分离进行纯培养，并能对特定类群进行数量 测定。
二、实验原理
1、满足微生物生长培养所需的营养要素： 碳源、氮源、无机盐、维生素、生长因子等 2、合适PH值 3、抑制其它微生物生长的物质。
分类
主要用于增菌 用于检测动力及保存菌种 用于分离鉴定细菌
分类
普通琼脂培养基 血液琼脂培养基 三糖铁培养基 SS培养基 庖肉培养基
培养基的制备程序
1、调配