生物工程设备综合实验指导定稿

生物工程设备综合实验指导讲义

实验名称：生物反应器使用及酵母培养

1.实验目的

本课程是配合生物工程设备课程教学设置的独立实践环节，通过实验，使学生加深对生物工程设备所学知识的理解，进一步使学生掌握生物工程企业的设备流程、设备结构及工作原理，了解设备的安装与维护。通过本课程的学习，使学生初步具有独立分析和解决生产及试验研究中工程设备问题的能力。

2.实验原理

生物反应器是一个容器，在此容器里，人们对生物有机体进行有效控制和培养以生产某种产品，或进行特定的反应。生物反应器最早的形式是发酵罐（fermentator）。生物反应器与化学反应器在使用中的主要不同点是生物（酶除外）反应都以“自催化”（autocatalysis）方式进行，即在目的产物生成的过程中产物自身要生长繁殖。另外，由于生物反应速率较慢，生物反应器的体积反应速率不高；与其它相当生产规模的加工过程相比，所需反应器体积大；对好氧反应，因通风与混合等，动力消耗高；产物浓度低。

生物反应器的作用就是为生物体代谢提供一个优化的物理及化学环境，使生物体能更好地生长，得到更多所需的生物量或代谢产物。

高效生物反应器的特点是设备简单，结构严密，良好的液体混合性能，较高的三传（动量传递、质量传递、热量传递）效率，能耗低，易于放大，具有配套而又可靠的检测及控制仪表灯。判断生物反应器好坏的标准应是该装置能否适合工艺要求，以获得最大的生产效率。

3.实验器材与试剂

3.1实验器材

5L发酵罐，控制台，pH电极，溶氧电极，蒸汽高压灭菌锅，高速离心机，分光光度计（包括比色皿），恒温水浴槽，电热恒温鼓风干燥箱、1000mL棕色试剂瓶、100mL容量瓶，20mL试管、10mL离心管。

3.2实验材料和试剂

（1）材料

菌种：面包酵母

培养基：①种子活化培养基（g/L）：酵母膏10，蛋白胨20，葡萄糖10，pH自然；②液体培养基（g/L）：酵母膏10，蛋白胨20，葡萄糖20，pH自然.

葡萄糖（分析纯）、氢氧化钠、酒石酸钾钠、结晶酚、亚硫酸钠、蒸馏水（2）试剂

1mg/mL葡萄糖标准溶液：准确称取分析纯葡萄糖100mg，置于100mL容

量瓶中，用蒸馏水溶解并定容至100mL，摇匀，在冰箱中保存。

3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂：准确称取185g酒石酸钾钠，用50℃左右的蒸馏水溶解。向此酒石酸钾钠热水溶液中先加入6.3gDNS和262mLNaOH溶液，再加入5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌，使其溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000mL，储存于棕色试剂瓶中，一周后使用。

4. 实验方法

4.1 发酵罐的实罐灭菌

（1）在罐内放入发酵培养液；拔下pH、DO电极及电机的电器插头；

（2）注意拔下的接头不能缠绕接触、不可与罐体接触，放在干燥平台上；（3）使用内六角扳手旋松搅拌电机固定螺栓，取下电机，横放在柔软、干燥桌面上；

（4）将发酵罐放入高压蒸汽灭菌锅，设置好灭菌温度（121℃）及时间（20min）后开始进行灭菌；

（5）当设定的灭菌时间到时，仪器鸣叫报警，此时将灭菌锅电源关闭，让罐体自然冷却；

（6）当灭菌锅内温度降到90℃以下时，打开溢流阀排出剩余蒸汽；

（7）当灭菌锅内常压状态时，打开灭菌锅，小心取出发酵罐，放置在基座上冷却备用。

4.2pH电极及溶氧电极校正

（1）pH电极的校正

pH电极先后放入pH=6.86及4.0的标准溶液中进行标定。

（2）pH电极的维护

●pH电极不用时应将其浸泡在3mol/L的KCl溶液或KCl饱和溶液中，严

禁将电极浸泡与蒸馏水或自来水中。

●若电极被无机物污染，可用0.1mol/L的HCl或NaOH溶液清洗数分钟，

然后用蒸馏水洗净。

●若电极被有机物污染，可用酒精或丙酮清洗，然后用蒸馏水洗净。

●严禁用水或潮湿空气侵蚀电极上端和电缆线相连接处的高阻抗部件。（3）DO（溶氧电极的校正）

将溶氧电极分别放入4%的亚硫酸钠溶液中（校正零点）及空气中（100%标定）。

（4）溶氧电极的维护

●长期不用应将电极取下，放入电极盒。

●严禁用液体浸泡、用蒸汽或潮湿空气侵蚀电缆线接头盒电极接头。

●在每次换模或换电解液后，电极必须重新极化和校准。

●极化需连续通电7h以上。

4.3还原糖测定

通过准确、快速测定发酵液总糖或还原糖的含量，可及时了解微生物对还原

糖的消耗情况，并将此消耗情况与pH的变化情况进行关联分析，得到补料分批式发酵过程的补糖策略，从碳源调控的角度实现发酵过程的优化。

本次实验采用3，5-二硝基水杨酸（DNS）比色法测定发酵液中还原糖含量。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类。在糖类中，分子中含有游离醛基或酮基的单糖和含有游离酮基的二糖都具有还原性。

还原糖在碱性条件下加热，被氧化成糖酸及其他产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅度呈一定比例关系。利用分光光度计，在540nm波长下测定反应后混合溶液的吸光度，查标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖的含量。

DNS法操作简便、快速、杂质干扰较少，故该法已逐渐得到推广和普及。由于发酵液一般会有颜色，而且不同的发酵过程及不同发酵时期，发酵颜色的深浅不一，采用DNS法测发酵液中总糖的含量时，应视情况不同对发酵液进行适当倍数的稀释，并离心分离出其中的固形物。在测吸光度时，建议用稀释后上清液作为对照样品将其脱色后再进行测定。具体实验步骤如下：

（1）发酵液的预处理：取20mL发酵液，在高速离心机中以3000r/min的转速离心10min，取上清液。如果上清液颜色较深，可用活性炭脱色（参考用量：0.5%~5%）。

（2）标准曲线绘制：取6支20mL试管（有准确刻度），分别编号为0,1,2,3,4,5，按表1 分别加入葡萄糖标准溶液（浓度为1mg/mL）、蒸馏水和DNS 试剂，配制成不同葡萄糖含量的反应液。

将各试管振摇，使反应液混匀，然后将试管置于沸水浴中，5min后取出，迅速冷却至室温，并加入蒸馏水9mL，加塞后摇匀。在540nm波长处测0~5号试管中溶液的吸光度，以吸光度为纵坐标，以葡萄糖含量为横坐标作图，再进行线性拟合，得到标准曲线方程。

表1 不同葡萄糖含量的反应液的配制

试管号1mg/mL葡萄

糖标准溶液体

积（mg/mL）蒸馏水体积

/(mL)

DNS试剂体积

/(mL)

反应液中葡萄

糖含量

（mg/mL）

0 0 1.0 2.0 0

1 0.

2 0.8 2.0 0.2

2 0.4 0.6 2.0 0.4

3 0.6 0.

4 2.0 0.6

4 0.8 0.2 2.0 0.8

5 1.0 0 2.0 1.0 （3）上清液还原糖含量测定：取20mL试管（有标准刻度），按表1 中7