药物诱导凋亡
毒性指标
LD50半数致死量（lethal dose 50%, LD50）：是指能够引起试验动物一半死亡的药物剂量，通常用药物致死剂量的对数值表示。
LD50及相应置信区间是由剂量-反应模型得出的最常用的统计量。
LD50是半数致死剂量，指在预定时间之内，如96h，导致50%被暴露个体死亡的剂量。
ED50：半数有效量(50% effective dose, ED50)在量反应中指能引起50%最大反应强度的药量，在质反应中指引起50%实验对象出现阳性反应时的药量。
意义：药物的ED50越小，LD50越大说明药物越安全ED50的计算方法回归法简单几率单位法寇氏法LC50 ：（Lethal Concentration 50，致死中浓度/半致死浓度/半数致死浓度）表示杀死50% 防治对象的药剂浓度，单位为PPm 。
半数致死浓度是衡量存在于水中的毒物对水生动物和存在于空气中的毒物对哺乳动物乃至人类的毒性大小的重要参数。
毒物的致死效应与受试动物暴露时间有密切关系。
如果用LC50表示水中毒物对水生生物的急性毒性，必须在LC50前标明暴露时间，如24小时LC50、48小时LC50和96小时LC50等。
如果用LC50表示空气中毒物对哺乳动物的急性毒性，一般是指受试动物吸入毒物2小时或4小时后的试验结果，可不注明吸入时间，但有时也可写明时间参数。
例如LCt50是指引起动物半数死亡的浓度和吸入时间的乘积，时间(t)一般用分钟表示。
在环境毒理学中1经口服，腹腔、静脉或皮下注入,皮肤染毒方式引起急性中毒的半数致死量以LD50表示; 2以吸入的染毒方式引起急性中毒的半数致死浓度以LC50表示。
但空气中的物理因素（如核辐射）引起哺乳动物半数死亡的剂量用LD50表示。
4计算方法计算毒物对水生动物的LC50常用直线内插法,即根据不同暴露时间,以及在等对数间距的各个试验浓度下测试动物的死亡率,求出不同暴露时间的LC50值。
计算时必须有使受试动物存活半数以上和半数以下的各种试验浓度。
顺铂诱导肝癌细胞凋亡的实验研究
顺铂诱导肝癌细胞凋亡的实验研究细胞凋亡作为生物细胞对内外信号刺激的一种反应，在正常细胞的发育过程中精确调控细胞的死亡过程。
肿瘤的发生与正常的细胞凋亡过程被抑制，破坏了细胞增殖与凋亡之间的平衡有一定关系。
顺铂因其可抑制癌细胞的DNA复制过程，抑制癌细胞分裂，而被广泛应用于临床治疗肿瘤。
我们观察了顺铂对肝癌细胞株HepG2凋亡的诱导作用，从而探讨其作用机制。
1 材料与方法1.1、药品和试剂：RPMI-1640培养基（购自Gibco公司），胎牛血清（coring公司），顺铂（Gibco公司），Annexin-V/PI试剂（Invitrogen公司）。
倒置显微镜（尼康TS100F）流式细胞仪（Beckman Coulter公司）。
1.2 方法1.2.1 细胞系及培养：人肝癌HepG2细胞株引自大连医科大学中心实验室。
用含10%胎牛牛血清、100 u/mL 青霉素、100 mg/L 链霉素的RPMI－1640 培养液, 在37 ℃、5% CO2 条件下作常规悬浮培养，每2-3天换液传代培养。
1.2.2 细胞培养及药物处理：取对数生长期细胞，细胞用0.25%胰蛋白酶消化后,配成5×105/L的细胞悬液分别接种于24孔板中培养，24 h细胞贴壁后，弃上清。
实验组分别加入浓度为200μg/mL，100μg/mL，50μg/mL，25μg/mL，12.5μg/mL的顺铂处理细胞，对照组不加药，另设空白对照组（只有培养基，无细胞），每组设置复孔，全湿条件下，37℃、5% CO2 培养箱中培养。
1.2.3 细胞形态学观察：取对数生长期细胞, 以每孔5×105个接种于6孔板中,24 h细胞贴壁后，弃上清。
分别加入不同浓度顺铂处理细胞，每6 h于倒置显微镜下观察活体细胞形态。
1.2.4 流式细胞仪分析细胞凋亡：实验组，对照组和空白对照组细胞培养24h，48h后用0.25%胰蛋白酶消化，PBS漂洗两次，调整细胞浓度至106/mL，取100μl细胞悬液，加入5μl Annexin－V/FITC 10μl及浓度为50μg/mL的PI液10μl，室温避光孵育15分钟后，加入PBS液400μl，用流式细胞仪进行流式细胞术定量检测。
药物对细胞凋亡途径的影响
药物对细胞凋亡途径的影响细胞凋亡是生物体内细胞自我调节的一种重要机制，对于维持组织内正常的细胞生长和分化至关重要。
药物作为影响细胞功能的重要手段之一，也会对细胞凋亡途径产生一定的影响。
本文将探讨药物对细胞凋亡途径的影响机制，并举例说明不同药物在细胞凋亡途径中的作用。
一、药物的直接调控作用1. 药物的抗凋亡作用许多药物通过直接抑制细胞凋亡途径中的关键分子，发挥抗凋亡作用。
例如，某些肿瘤抑制剂针对细胞凋亡途径中的Bcl-2家族蛋白进行直接抑制，阻断凋亡信号的传导，从而促进细胞存活。
此外，一些免疫抑制剂也通过干扰细胞凋亡途径，抑制免疫细胞的凋亡，达到抗炎和免疫抑制的效果。
2. 药物的促进凋亡作用另一些药物则通过直接刺激细胞凋亡途径，促使细胞进入凋亡状态。
例如，化疗药物顺铂通过与DNA结合，引起DNA损伤和细胞周期阻滞，从而诱导细胞凋亡。
类似地，某些植物提取物中的有效成分也可直接影响细胞凋亡途径，对肿瘤细胞具有明显的促凋亡作用。
二、药物的间接调控作用1. 药物的抗氧化作用一些药物可以通过抑制氧化应激反应，减少细胞内活性氧自由基的生成，从而抑制细胞凋亡的发生。
例如，抗氧化剂维生素C和维生素E可通过清除活性氧自由基，保护细胞免受氧化损伤，减少细胞凋亡的发生。
2. 药物的激活凋亡信号通路有些药物虽然不能直接调节细胞凋亡途径中的关键分子，但可以通过激活特定的信号通路来间接影响细胞凋亡的发生。
例如，激动剂通过与细胞表面受体结合，触发下游信号的传导，进而导致细胞凋亡。
这类药物在肿瘤治疗中常被使用，通过抑制肿瘤细胞的生长和扩散。
三、不同药物的作用示例1. 阿司匹林对细胞凋亡途径的影响阿司匹林是一种非甾体类抗炎药，研究发现其能够通过抑制炎症反应，减少炎症细胞的凋亡，从而缓解炎症反应引起的组织损伤。
此外，阿司匹林还可以通过抑制NF-κB信号通路，减少抗凋亡蛋白的表达，促进肿瘤细胞的凋亡，具有一定的抑制肿瘤生长的效果。
2. 顺铂对细胞凋亡途径的影响顺铂是一种常用的化疗药物，通过与DNA结合，干扰DNA复制和修复过程，引起DNA损伤和细胞周期阻滞。
Doxycycline诱导细胞凋亡及其机制
凋亡相关蛋白酶活力抑制对凋亡率影响为了阐明dc诱导细胞凋亡发生的机制分别用zvadrink广泛性caspa辩抑制剂zlehdrinkcaspase9特异性抑制剂zietdrinkcasp鹊e8特异性抑制剂和孛垦科学院上海生会科学磅究生硫生物化学s缅瞻生物学砩究所博士学位论文calpeptin瑚apaini和calpainii抑制剂来抑制蛋白酶活力
关键词：Ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ，线粒体，ｃａｓｐａＳｅ，钙依赖蛋白酶
中国科学院上海生命科学研究生院生物化学ｓ细魄生物学磅究所
博士学位论文
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中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所 博士学位论文
Ⅰ.Doxycycline诱导细胞凋亡及其机制;Ⅱ.GDNF修饰的人羊膜 上皮细胞在大鼠MCAO模型中的治疗作用 姓名：武家才 申请学位级别：博士 专业：细胞生物学 指导教师：郭礼和 20060601
肿瘤的诱导分化和凋亡疗法
01
干细胞是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为“万用细胞
02
干细胞
传统观念认为,肿瘤是由体细胞突变而成,每个肿瘤细胞都可以无限制地生长。但这无法解释肿瘤细胞似乎具有无限的生命力以及并非所有肿瘤细胞都能无限制生长的现象
Therapeutic implications of Cancer Stem Cells
Most therapies fail to consider the difference in drug sensitivities of cancer stem cells compared to their non-tumorigenic progeny. Most therapies target rapidly proliferating non-tumorigenic cells and spare the relatively quiescent cancer stem cells.
Distinct classes of cells exist within a tumor. Only a small definable subset, the cancer stem cells can initiate tumor growth.
Two General Models for Cancer Heterogeneity异质性
Origin of the Theory of Cancer Stem Cells
Only a small subset of cancer cells is capable of extensive proliferation Liquid Tumors In vitro colony forming assays: - 1 in 10,000 to 1 in 100 mouse myeloma cells obtained from ascites away from normal hematopoietic cells were able to form colonies In vivo transplantation assays: - Only 1-4% of transplanted leukaemic cells could form spleen colonies Solid Tumors - A large number of cells are required to grow tumors in xenograft models - 1 in 1,000 to 1 in 5,000 lung cancer, neuroblastoma cells, ovarian cancer cells, or breast cancer cells can form colonies in soft agar or in vivo
抗肿瘤细胞凋亡诱导药物的研发现状与未来趋势分析
抗肿瘤细胞凋亡诱导药物的研发现状与未来趋势分析近年来，随着全球癌症发病率和死亡率的不断攀升，抗肿瘤药物的研发成为了医学界关注的焦点。
在众多抗肿瘤策略中，诱导肿瘤细胞凋亡作为一种高效且具有选择性的治疗手段，受到了广泛的重视。
细胞凋亡，又称程序性死亡，是细胞在基因调控下主动结束生命的过程，对于维持生物体的稳态至关重要。
当细胞凋亡机制失控时，可能导致包括癌症在内的多种疾病。
因此，通过药物干预来恢复或增强肿瘤细胞的凋亡过程，成为了抗肿瘤治疗的重要研究方向。
本文将从理论研究的角度，对抗肿瘤细胞凋亡诱导药物的研发现状与未来趋势进行深入分析。
一、抗肿瘤细胞凋亡诱导药物的作用机制1.1 细胞凋亡的基本途径细胞凋亡主要通过两条途径实现：内源性途径（线粒体途径）和外源性途径（死亡受体途径）。
内源性途径主要由线粒体介导，当细胞受到内部损伤信号刺激时，线粒体释放细胞色素c等促凋亡因子，激活caspase家族蛋白酶，进而引发细胞凋亡。
外源性途径则由细胞表面的死亡受体（如Fas、TNF受体等）介导，当这些受体与相应的配体结合后，可以激活caspase8等启动型caspase，进而触发细胞凋亡。
这两条途径最终都汇聚于效应型caspase（如caspase3、6、7），导致细胞结构的解体和凋亡小体的形成。
1.2 抗肿瘤细胞凋亡诱导药物的作用靶点基于上述细胞凋亡途径，抗肿瘤细胞凋亡诱导药物主要针对以下几个靶点发挥作用：一是作用于线粒体，通过改变线粒体膜电位、促进细胞色素c释放等方式激活内源性凋亡途径；二是靶向死亡受体及其配体，通过模拟或增强死亡信号来激活外源性凋亡途径；三是直接激活caspase家族蛋白酶，尤其是启动型和效应型caspase，以加速凋亡进程。
还有一些药物通过调控凋亡相关基因（如Bcl2家族、IAPs等）的表达水平，间接影响细胞凋亡的发生。
二、抗肿瘤细胞凋亡诱导药物的研发现状2.1 现有药物概述目前，已有多款抗肿瘤细胞凋亡诱导药物获批上市或处于临床研究阶段。
关于丁卡因引导海拉细胞系凋亡的初步研究
丁卡因抑制HeLa细胞增殖和诱导凋亡的体外实验组员：陈浩、江林松、曲仲阳、毕海洋摘要：丁卡因对角膜细胞有诱导凋亡的作用。
原因可能是：药物本身对脊髓直接刺激诱导细胞凋亡。
因此，我们尝试对HELA细胞进行丁卡因处理，初步确定丁卡因对HELA细胞增殖、凋亡影响。
为此，我们设定了一系列的丁卡因浓度梯度，通过对相同条件培养的HELA细胞在不同时间、不同浓度下进行计数。
通过与正常生长的对照组进行比较初步确定丁卡因对HELA细胞生长的影响。
关键词：丁卡因、HeLa细胞系、细胞凋亡、细胞计数国内目前对于丁卡因的研究主要集中在丁卡因作为麻醉剂使用的药效及副作用上，对于细胞增殖的抑制和细胞凋亡的诱导并不常见。
有研究发现，丁卡因对角膜细胞有诱导凋亡的作用，同时，尤美琴等发现2% 丁卡因对脊髓细胞有损伤，促进细胞的凋亡。
原因可能是：药物本身对脊髓直接刺激诱导细胞凋亡；凋亡相关基因bax与bcl-2在丁卡因致脊髓神经系统毒性损伤后的各时相点的异常表达，可能参与了脊髓毒性损伤的发生和发展，但也不能排除它是由于丁卡因对脊髓血流的影响、渗透压的作用等因素所致。
因此，我们尝试对HELA细胞进行丁卡因处理，初步确定丁卡因对HELA细胞增殖、凋亡影响，为进一步寻找治疗子宫颈癌确定方向。
本次试验的主要目的在于研究丁卡因对Hela 细胞的体外作用和了解和探索科研实验的方法。
1.材料与方法1.1 实验材料实验中所用到的主要用品如下：C02培养箱（37℃、5%C02），4℃冰箱（保存胰酶及培养基），灭菌锅，烘箱；75%酒精，脱脂棉棉球，蒸馏水及三蒸水；24孔培养板，移液管，胶皮头；丁卡因：用完全培养液配制0.1%母液。
吖啶橙/溴化乙锭（AO/EB）染色液：用PBS配制100μg/mL AO 溶液，100μg/mL EB 溶液，按1：1混合使用。
根据计划取一24孔培养板，34支移液管，3个细胞培养瓶1.2实验方法1.2.1接种培养以上用品准备完毕之后开始进行接种培养。
药物对细胞凋亡的影响
药物对细胞凋亡的影响细胞凋亡是生命体内一种正常的、精确调控的细胞自杀程序，它在维持细胞数量平衡、清除异常细胞和调节发育等方面发挥着重要的作用。
然而，在某些情况下，细胞凋亡的过程可能被疾病或外界因素干扰，导致细胞凋亡异常，进而引发多种疾病的发生和发展。
为了调控细胞凋亡过程，药物被广泛应用于研究和临床治疗中。
本文将探讨药物对细胞凋亡的影响，并从多个角度进行讨论。
一、药物抑制细胞凋亡一些药物能够有效地抑制细胞凋亡的发生。
这类药物可以通过多个途径阻断细胞凋亡的信号通路，包括下调凋亡相关蛋白的表达、抑制凋亡相关酶的活性以及干扰细胞凋亡相关的信号转导。
例如，特定的抗凋亡蛋白可以结合到凋亡信号传导路线的关键蛋白上，从而抑制细胞凋亡的进程。
此外，通过适当调节凋亡相关的细胞因子和生长因子的分泌以及调整凋亡相关基因的表达水平，也能达到抑制细胞凋亡的目的。
二、药物促进细胞凋亡除了抑制细胞凋亡外，一些药物也能够促进细胞凋亡的发生。
这些药物通常作用于癌细胞等异常细胞，通过引发细胞凋亡来达到抗肿瘤和治疗疾病的效果。
这类药物的作用机制复杂多样，包括激活细胞凋亡相关的蛋白和酶、干扰生长因子信号通路、引发线粒体相关的细胞凋亡途径等。
通过促进细胞凋亡，这些药物能够清除异常和恶性细胞，达到治疗疾病的目的。
三、药物调节细胞凋亡的相关途径在探讨药物对细胞凋亡的影响时，不能忽视药物对细胞凋亡相关途径的调节作用。
细胞凋亡涉及多个信号网络和途径，如线粒体途径、死亡受体途径、内质网应激途径等。
药物可以通过调节这些途径中的关键分子和蛋白的表达及活性，影响凋亡的过程和结果。
例如，某些化学药物能够控制细胞内钙离子浓度，从而调节内质网应激途径，影响细胞的生死决策。
四、药物对细胞凋亡的临床应用药物对细胞凋亡的影响已经被广泛应用于临床治疗中。
以抗肿瘤治疗为例，目前临床上采用的多种化疗药物能够通过诱导癌细胞凋亡来达到治疗效果。
此外，针对一些自身免疫性疾病和神经性疾病，药物也可以通过调节细胞凋亡来改善病情。
Hoechst_33258荧光染色观察药物诱导细胞凋亡
SOP13广东药学院药科学院新药筛选与药效评价中心Standard Operation Protocol（SOP）●技术方法名称:Hoechst33258荧光染色观察药物诱导细胞凋亡●基本原理:Hoechst 33258，也称bisBenzimide H33258或HOE33258。
分子式为C25H24N6O·3HCl，分子量为533.88，CAS Number 23491-45-4。
Hoechst 33258溶于水，溶解度可达10mg/ml。
Hoechst 33258是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，对细胞的毒性较低。
用于细胞核染色时，推荐的Hoechst 33258工作浓度为0.5-10μg/ml。
Hoechst 33258 为特异性DNA 染料，与 A-T 键结合，这种染料对死细胞或经 70% 冷乙醇固定的细胞可立即染色。
而活细胞的着色是渐进性的，在 10min 内可达饱和。
在荧光显微镜下，活细胞核呈弥散均匀荧光，出现细胞凋亡时，细胞核或细胞质内可见浓染致密的颗粒块状荧光。
Hoechst 33258染色常用于细胞凋亡检测，染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。
Hoechst 33258也常用于普通的细胞核染色，或常规的DNA染色。
Hoechst 33258的最大激发波长为346nm，最大发射波长为460nm；Hoechst 33258和双链DNA结合后，最大激发波长为352nm，最大发射波长为461nm。
●试剂与器材1. Hoechst 33258 贮存液：称取 Hoechst 33258 试剂1mg ，用 20ml 蒸馏水溶解后，滤过，4℃ 避光保存。
用时蒸馏水 10 倍稀释成染色液。
2. 封片液（ pH5.5 ）： 20mmol/L 柠檬酸； 50mmol/L 磷酸氢二钠； 50% 甘油，3. 细胞固定液 4%多聚甲醛，现配。
操作步骤1. 将贴壁细胞以5×105 /ml或其他适宜的密度接种于用35mm培养皿或其他培养器具中，35mm培养皿每孔1.5- 2ml，37℃ 、 5%CO 2孵箱中培养至细胞贴壁，加入实验药物，继续培养过夜。
绿原酸抗癌原理
绿原酸抗癌原理引言癌症是世界各国面临的严重健康问题之一。
在过去几十年里，科学家们一直在寻找新的抗癌药物。
绿原酸作为一种天然存在的化合物，近年来受到了越来越多的关注。
本文将深入探讨绿原酸抗癌的原理，以期能为抗癌药物的研发提供指导。
绿原酸的基本特性绿原酸是一种多酚类化合物，广泛存在于植物中，特别是茶叶和葡萄皮中。
它具有抗氧化、抗病毒、抗癌等多种生物活性。
研究表明，绿原酸可以通过多种途径发挥抗癌作用。
绿原酸对肿瘤细胞的影响绿原酸可以抑制肿瘤细胞的生长和增殖。
具体而言，它通过以下几种方式发挥作用：1. 诱导凋亡绿原酸可以诱导肿瘤细胞凋亡，从而促使肿瘤细胞死亡。
凋亡是一种程序性细胞死亡过程，它可以帮助维持机体的正常发育和功能。
2. 抑制增殖信号通路绿原酸可以抑制肿瘤细胞的增殖信号通路，阻断肿瘤细胞的生长。
这主要通过抑制蛋白激酶的活性来实现。
蛋白激酶在癌症中起着非常重要的作用，因此抑制蛋白激酶活性可以有效地抑制癌细胞的增殖。
3. 干扰DNA合成绿原酸可以干扰肿瘤细胞的DNA合成过程，使其失去正常的DNA复制能力。
这对于癌细胞的生长和分裂具有重要的影响，从而抑制了肿瘤的发展。
绿原酸对免疫系统的调节作用除了直接影响肿瘤细胞，绿原酸还可以通过调节免疫系统来发挥抗癌作用。
免疫系统在抵御肿瘤发展过程中起着重要的作用，而绿原酸可以通过以下方式增强免疫系统的活性：1. 激活免疫细胞绿原酸可以激活多种免疫细胞，如巨噬细胞和T细胞。
这些免疫细胞可以通过吞噬和杀伤肿瘤细胞来抑制肿瘤的发展。
2. 促进免疫细胞间的相互作用绿原酸可以促进不同免疫细胞之间的相互作用。
例如，它可以增强T细胞与抗原呈递细胞之间的相互作用，提高肿瘤特异性免疫应答的效率。
3. 调节免疫细胞的功能绿原酸可以调节免疫细胞的功能，使其更好地应对肿瘤的挑战。
例如，它可以增强抗体的产生和NK细胞的活性。
绿原酸与化疗的协同作用绿原酸可以与化疗药物发挥协同抗癌作用。
这主要是因为绿原酸可以增加化疗药物对肿瘤细胞的敏感性，从而增强化疗的疗效。
药物对肿瘤细胞凋亡的诱导机制
药物对肿瘤细胞凋亡的诱导机制肿瘤是一种严重威胁人类健康的疾病，而药物治疗一直是常见的治疗手段之一。
药物对肿瘤细胞凋亡的诱导机制是其治疗效果的关键。
凋亡是一种重要的细胞死亡方式，通过调控凋亡信号通路，药物可以诱导肿瘤细胞发生凋亡，从而达到治疗的目的。
本文将从凋亡的基本概念开始，详细介绍药物对肿瘤细胞凋亡的诱导机制。
一、凋亡的基本概念在细胞生命周期中，凋亡是一种正常的细胞死亡方式。
相对于坏死而言，凋亡具有以下特点：1）细胞通过凋亡过程有序地进行自我消亡，保持细胞膜的完整性，不会导致细胞内容物的泄漏和炎症反应；2）凋亡过程会涉及一系列调控因子和信号通路的参与，确保细胞凋亡的正确进行。
凋亡的主要特点包括凋亡核病变、DNA断裂和细胞膜翻转等。
二、药物对肿瘤细胞凋亡的诱导机制1. 细胞凋亡通路细胞凋亡通路是指一系列信号传导路径，参与调控细胞凋亡的各个阶段。
常见的凋亡通路包括内质网应激通路、线粒体通路和死受体通路等。
不同的药物可以通过激活或抑制这些通路来诱导肿瘤细胞的凋亡。
2. 药物诱导凋亡的机制（1）化疗药物化疗药物是一类常用的抗肿瘤药物，它们通过直接作用于肿瘤细胞，达到诱导凋亡的效果。
化疗药物可以通过调节凋亡通路上的关键蛋白，如Bcl-2家族和caspase家族，在肿瘤细胞中诱导凋亡。
例如，顺铂作为一种常用的化疗药物，通过抑制Bcl-2的表达，降低细胞内凋亡抑制因子的水平，促进肿瘤细胞的凋亡。
（2）靶向药物相比化疗药物，靶向药物更具有选择性，可以更精确地作用于特定的靶点。
靶向药物通过抑制特定信号通路的激活，干扰细胞的生长和凋亡平衡，从而诱导肿瘤细胞的凋亡。
以鱼腥草碱为例，它可以抑制蛋白酶的活性，干扰肿瘤细胞内抑制凋亡的分子相互作用，从而增加凋亡因子的表达并诱导肿瘤细胞凋亡。
（3）免疫治疗药物免疫治疗药物是近年来快速发展的一类新型抗肿瘤药物。
它们通过激活机体的免疫系统，诱导肿瘤细胞的凋亡。
常见的免疫治疗药物包括肿瘤免疫检查点抑制剂和细胞免疫疗法等。
仙鹤草素作为诱导肿瘤细胞凋亡的药物[发明专利]
![仙鹤草素作为诱导肿瘤细胞凋亡的药物[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/bf28fe618762caaedc33d48d.png)
专利名称：仙鹤草素作为诱导肿瘤细胞凋亡的药物专利类型：发明专利
发明人：徐安龙,彭文烈,马靖,梁东
申请号：CN99116051.7
申请日：19990205
公开号：CN1237450A
公开日：
19991208
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了中药仙鹤草天然提取物仙鹤草素的诱导人体肿瘤细胞凋亡的特性，尤其是能够诱导恶性肿瘤细胞的凋亡，而对正常的人体组织细胞无不良影响。
仙鹤草素可作为抗癌药物的先导化合物，也可以直接开发成抗癌新药或与其它药物配伍成抗癌新药。
仙鹤草素作为抗癌药物，具有效果明显、毒副作用小、易于人体吸收等特点。
申请人：广州穗金生物技术开发有限公司
地址：510240 广东省广州市江南大道中134号10楼
国籍：CN
代理机构：广东专利事务所
代理人：李永庆
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阿霉素诱导肿瘤细胞凋亡机制的研究进展
阿霉素诱导肿瘤细胞凋亡机制的研究进展【摘要】为了更有效地发挥阿霉素抗瘤作用,国内外专家对阿霉素的抗瘤机制做了大量研究,其中涉及到多种信号分子,如Bcl-2基因家族、PTEN及其底物FAK、Wnt通路抑制因子(DKK和FrpHE)、蛋白激酶C、TNF基因家族等。
【Abstract】To utilize the anti-tumor function of adriamycin,lots of studies were done by the specialists.Many signal molecules were proved to be involved,for example:Bcl-2,PTEN,Wnt,PKC and TNF.【Key words】Adriamycin; Tumor cells; Apoptosis阿霉素(doxorubicin hydrochloride,DOX,adriamycin,ADM)是一种周期非特异性抗癌药,对各期细胞均有作用,但对S期的早期最为敏感,M期次之,对G1期最不敏感[1]。
本药既含有脂溶性的蒽环配基,又有水溶性的柔红糖胺基,并有酸性酚羟基和碱性氨基,因此具有很强的抗癌活性。
ADM是蒽环类抗生素,其部分分子结构可嵌入到DNA双链中形成稳定的复合物,影响DNA的结构和功能,阻止DNA复制和RNA的合成[2]。
在临床应用时,主要通过药物插入DNA引发拓扑异构酶Ⅱ裂解DNA,从而破坏DNA三级结构。
其抗瘤谱较广,对乳腺癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、肝癌等多种癌症都有一定疗效,可引起恶心、呕吐、脱发、高热等不良反应[3]。
为了更合理地使用阿霉素,更有效地发挥抗瘤作用,国内外专家做了大量研究,现将近年来国内外有关阿霉素抗瘤机制的研究予以简要综述。
1 Bcl-2基因家族细胞凋亡受基因调控,是细胞主动参与其自身有序的生理性死亡过程。
抗肿瘤药物的治疗效果依赖于它们诱导肿瘤细胞凋亡的能力。
抗癌中药诱导凋亡与急性胰腺炎的治疗
中国中西 医结 合外 科杂志 ２０ ０２年 ６月第 ８卷第 ３ 期
抗 癌 中药 诱 导 凋 亡与 急性 胰 腺 炎 的治疗
邵宏伟
研究表明 、 临床 上很 多疾病 都与细 胞 凋亡 （ｐｐ ｓ ） ａｏｔ ｉ 有 ｏｓ 关。涉及凋亡凋节和执 行的药 物对 于疾 病诊 断和介Ａ 治疗 是扳具潜力的研 究方 向 ， 为许 多疾病 的治疗 带来 新的希 望。 中药是从我国特有 的天然植物 中提 取的 ， 源丰富。已经发 资
老的细胞通 过一种遗传 的程序性细胞死亡方式牺牲 自己。
１２ 凋亡细胞 的特征 ． 凋亡 和坏死 具有 各 自不同 的特征 ， 是两种完全不同的死亡过程 （ 见表 １ 。以何种方式死 亡取 ） 决于死亡 的环境和原因。
为我们提供一个新的治疗 急性 胰腺炎方法 。
表 １ 凋 亡和坏死主要特征的比较
齐清会
Ｉ 凋 亡
ｌ 凋 亡的概念 ｌ
Ｋ ｒ等人 于 １７ 年发理 了一种不同于坏 ｅｒ ９２
死的细胞死 亡方式 ， 并称之为捅亡 凋亡亦称 程序性 细胞死 亡 （ｒ ｒ ｅ ｅ ｅｔ，Ｃ 是细胞 死亡的一 种形 式 ， ｐｏ ａ ｄｃｌｄａｈ Ｐ Ｄ） ｇ ｍｍ ｌ 是指 在正常 生理情况下 ， ｒ整个 生物 体的更大 利益 ， 为 受伤或 衰
Ｉ２ ２ 罚亡细胞 的形态学特征 凋亡 细胞 的形 态学特 征表
现为核 周缩 ， 染色质浓 聚， 碎片形成 ， 核 细胞质 浓缩 ， 线粒体 变大 ， 嵴增多 ， 继而窑 泡化 ， 内质网腔扩大 ， 细胞膜上微绒毛 、 细胞 突趁 及细胞 表 面皱 褶 消失 ， 胞变成 表面光 滑 的球 形 细 细胞体急剧变小 ， 细胞骨架解体 ， 凋亡小体形成。 １２３ 凋亡 细 胞的生 化特征 ． 细胞 凋亡 时， 内源性核 酸内 切酶将核小体 间的连接 Ｄ Ａ降解 ， Ｎ 形成长 度为 １０～２０ｂ ８ ０ ｙ 整倍 数的寡聚核苷酸 片段 。其 Ｄ Ａ琼脂糖凝胶 电泳呈 特征 Ｎ 性 的“ 梯状条带 ” Ｄ Ａ ｌ ｄｒ。 （ Ｎ ｄｅ） ａ
细胞凋亡诱导剂.doc
细胞凋亡诱导剂在凋亡研究中，成功的诱导细胞凋亡是最关键的前提条件。
凋亡诱导试剂多种多样，每种诱导剂均有其敏感的细胞，而不同的细胞也有其最佳的诱导剂。
因此，选择合适的、有效的、特异性的诱导剂也就成为至关重要的问题。
Biovision公司作为世界主要的凋亡试剂供应商，提供各种不同的凋亡诱导剂供研究者选择。
放线菌素D（Actinomycin D）放线菌素D是一种抗肿瘤的抗生素类药物。
通过脱氧鸟苷残基与DNA形成复合物，从而抑制DNA依赖的RNA聚合酶的活性，阻断转录过程。
是多种哺乳动物细胞强有力的凋亡诱导剂(1)。
Camptothecin可以结合并稳固拓普异构酶－DNA复合物，从而达到可逆性的抑制拓普异构酶I活性的目的，而诱导细胞凋亡。
可抑制Tat介导的HIV-1的转录。
常用于诱导Jurkat、骨肉瘤和肝细胞癌细胞的凋亡。
Cycloheximide是一种非常有效的抗多种酵母和真菌的抗生素，可抑制真核生物蛋白质的合成，而多数原核生物则无效。
在100ug/ml的浓度时可抑制多种霉菌，而对大部分的致病细菌则无抑制作用。
通过作用于真核细胞60S核糖体而抑制蛋白质合成的起始和延长过程。
常被作为抑制剂用于研究真核生物无细胞蛋白质合成，也被用于阻断体外核糖体依赖的多肽合成。
可诱导多种细胞的凋亡。
Dexamethasone是一种具有抗炎症作用的皮质类固醇，同时具有抗炎症和抗风湿的特性。
可抑制血管内皮细胞表达诱导型一氧化氮合酶（iNOS），但对cNOS则无效。
在主动脉平滑肌细胞通过刺激Na+-K+泵，可加速活化阳离子的转位。
一般用于诱导人胸腺细胞凋亡（500-1000nM，37°C 6小时）Etoposide是拓普异构酶II的抑制剂。
是从鬼臼毒素来源的衍生物，主要可以抑制多种肿瘤，包括生殖细胞肿瘤、小细胞肺癌、恶性淋巴瘤。
可用于诱导人T细胞、小鼠胸腺细胞、HL-60细胞凋亡。
StaurosporineStaurosporine是蛋白激酶C和其他大部分激酶（包括酪氨酸蛋白激酶）强有力的抑制剂。
Hoechst_33258荧光染色观察药物诱导细胞凋亡
SOP13广东药学院药科学院新药筛选与药效评价中心Standard Operation Protocol（SOP）●技术方法名称:Hoechst33258荧光染色观察药物诱导细胞凋亡●基本原理:Hoechst 33258，也称bisBenzimide H33258或HOE33258。
分子式为C25H24N6O·3HCl，分子量为533.88，CAS Number 23491-45-4。
Hoechst 33258溶于水，溶解度可达10mg/ml。
Hoechst 33258是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，对细胞的毒性较低。
用于细胞核染色时，推荐的Hoechst 33258工作浓度为0.5-10μg/ml。
Hoechst 33258 为特异性DNA 染料，与 A-T 键结合，这种染料对死细胞或经 70% 冷乙醇固定的细胞可立即染色。
而活细胞的着色是渐进性的，在 10min 内可达饱和。
在荧光显微镜下，活细胞核呈弥散均匀荧光，出现细胞凋亡时，细胞核或细胞质内可见浓染致密的颗粒块状荧光。
Hoechst 33258染色常用于细胞凋亡检测，染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。
Hoechst 33258也常用于普通的细胞核染色，或常规的DNA染色。
Hoechst 33258的最大激发波长为346nm，最大发射波长为460nm；Hoechst 33258和双链DNA结合后，最大激发波长为352nm，最大发射波长为461nm。
●试剂与器材1. Hoechst 33258 贮存液：称取 Hoechst 33258 试剂1mg ，用 20ml 蒸馏水溶解后，滤过，4℃ 避光保存。
用时蒸馏水 10 倍稀释成染色液。
2. 封片液（ pH5.5 ）： 20mmol/L 柠檬酸； 50mmol/L 磷酸氢二钠； 50% 甘油，3. 细胞固定液 4%多聚甲醛，现配。
操作步骤1. 将贴壁细胞以5×105 /ml或其他适宜的密度接种于用35mm培养皿或其他培养器具中，35mm培养皿每孔1.5- 2ml，37℃ 、 5%CO 2孵箱中培养至细胞贴壁，加入实验药物，继续培养过夜。
药物诱导凋亡
实验步骤
6. 向吸附柱CB3中加入600 μl 漂洗液PW（使用前请先检查是 否已加入无水乙醇），12,000 rpm (~13,400×g)离心30 sec， 倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
7. 重复操作步骤6。 8. 将吸附柱CB3放回收集管中，12,000 rpm(~13,400×g)离心2
实验步骤
1. 在细胞悬液中加入20 μl Proteinase K溶液，混匀。 2. 加入200 μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10 min，
溶液应变清亮，简短离心以去除水珠。 3. 加人200 μl 无水乙醇，充分振荡混匀15 sec，此时可能
会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。 4. 将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中
（吸附柱放入收集管中），12,000 rpm (~13,400×g)离 心30 sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。 5. 向吸附柱CB3中加入500 μl缓冲液GD （使用前请先检查 是否已加入无水乙醇），12,000 rpm (~13,400×g)离心 30 sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
凋亡的细胞的核DNA的断裂发生在核小体之间，因此 产生的断裂DNA在电泳时会呈180-200bp整数倍大小 的阶梯状条带，这是识别凋亡细胞的可靠生化特征。 能诱导细胞凋亡的枉法有很多，这里主要采取化疗 药物诱导细胞凋亡
化疗药物诱导细胞凋亡并产生“阶梯”效应
实验材料
HepG2 肝癌细胞株，DNA提取试剂盒， 移液器，EP管，PBS，低温离心机
min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底 晾干吸附材料中残余的漂洗液。 9. 吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位 悬空滴加50-200 μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5 min， 12,000 r心管 中。
样本细胞凋亡实验报告(3篇)
第1篇一、实验背景细胞凋亡是细胞程序性死亡的过程，是生物体内重要的细胞生物学现象之一。
细胞凋亡在维持生物体内细胞数量的动态平衡、清除异常细胞以及抵御病原体入侵等方面发挥着至关重要的作用。
本研究旨在通过实验方法检测细胞凋亡的发生，探讨细胞凋亡在特定条件下的生物学意义。
二、实验目的1. 探讨细胞凋亡在特定条件下的发生机制。
2. 检测细胞凋亡的发生，并分析其与细胞增殖的关系。
3. 研究细胞凋亡在生物体内的生理和病理作用。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：细胞培养液、细胞裂解液、Annexin V-FITC/PI染色试剂盒、流式细胞仪等。
2. 实验仪器：细胞培养箱、显微镜、离心机、流式细胞仪等。
四、实验方法1. 细胞培养：将细胞接种于细胞培养瓶中，置于细胞培养箱中培养至对数生长期。
2. 处理细胞：将细胞分为实验组和对照组，实验组给予特定处理，对照组不做处理。
3. 细胞裂解：将细胞用细胞裂解液裂解，收集细胞裂解液。
4. Annexin V-FITC/PI染色：将细胞裂解液与Annexin V-FITC/PI染色试剂盒混合，室温避光孵育。
5. 流式细胞术检测：将染色后的细胞用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。
五、实验结果1. 实验组细胞凋亡率显著高于对照组（P<0.05），表明特定处理可以诱导细胞凋亡。
2. Annexin V-FITC染色结果显示，实验组细胞膜上磷脂酰丝氨酸（PS）外翻，表明细胞凋亡早期发生。
3. PI染色结果显示，实验组细胞核DNA降解，形成DNA ladder，表明细胞凋亡晚期发生。
六、实验讨论1. 本实验结果表明，特定处理可以诱导细胞凋亡，提示细胞凋亡在特定条件下受到严格调控。
2. Annexin V-FITC染色和PI染色结果显示，细胞凋亡过程分为早期和晚期两个阶段。
早期阶段，细胞膜上PS外翻，细胞膜完整；晚期阶段，细胞核DNA降解，细胞膜通透性增加。
3. 细胞凋亡在生物体内具有重要作用。
IC50——精选推荐
IC50IC50是指“反应”被抑制⼀半时抑制剂的浓度，这⾥的反应可以是酶催化反应、抗原抗体反应等。
在凋亡⽅⾯，可以理解为⼀定浓度的某种药物诱导肿瘤细胞凋亡50%，该浓度称为50%抑制浓度，即凋亡细胞与全部细胞数之⽐等于50%时所对应的浓度，IC50值可以⽤来衡量药物诱导凋亡的能⼒，即诱导能⼒越强，该数值越低,当然也可以反向说明某种细胞对药物的耐受程度。
半抑制浓度（或称半抑制率），即IC50。
在间接竞争ELISA标准曲线中是⼀个⾮常重要的数据，标准曲线是⼀个S型曲线。
ICELISA中，不添加抑制物质的对照孔的OD值为B0，添加了抑制物质的孔的OD值为BB/B0% 就叫做结合率，在结合率为50%时所对应的抑制物质的浓度就叫做IC50。
⼀般IC50的数值越⼩，说明你的抗体的特异性能越强！最⼩检测限为试剂盒标准曲线的最⼩的浓度，⼩于最⼩浓度或⼤于最⼤浓度，即不在曲线范围内的都不准确，⼤于最⼤浓度可以稀释后测。
IC50为50%抑制浓度即B/B0=50%时所对应的浓度，半数抑制是⽤来衡量抗体灵敏度的半数抑制越低，说明抗体的灵敏度越⾼。
通常来说，试剂盒最⼤和最⼩量程应该是该抗体⽤来检测标准品的检测限，检测限分最⼤和最⼩检测限。
检测下限⼀般为理论值，是根据标准曲线算出来的理论上可以检测到的最⼩的值；定量限为实际检测时可以定量的最低的值；⽽最⼤检测限就是实际操作中抑制率达到100%时的药物浓度。
检测下限（LOD）对应的OD值：OD(LOD) =B0－3SD定量限（LOQ）对应的OD值：OD（LOQ）= B0－10SD酶活⼒单位（U，active unit）酶活⼒的度量单位。
1961年国际酶学会议规定：1个酶活⼒单位是指在特定条件（25℃，其它为最适条件）下，在1分钟内能转化1微摩尔底物的酶量，或是转化底物中1微摩尔的有关基团的酶量。
酶活⼒单位：⽤来表⽰酶活⼒⼤⼩的单位，通常⽤酶量来表⽰。
其中⼀个称酶活⼒国际单位，规定为：在特定条件下，1分钟内转化1微摩尔底物，或者底物中1微摩尔有关基团所需的酶量，称为⼀个国际单位（IU，⼜称U）。
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讨论
DNA提取过程中哪些步骤会导致样品不纯，为 什么？ 化疗药物诱导细胞凋亡的机制是什么？
化疗药物诱导细胞凋亡并产生“阶梯”效应
实验材料
HepG2
肝癌细胞株，DNA提取试剂盒， 移液器，EP管，PBS，低温离心机
实验步骤
1.Βιβλιοθήκη 2.3.4.5.
在细胞悬液中加入20 μl Proteinase K溶液，混匀。 加入200 μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10 min， 溶液应变清亮，简短离心以去除水珠。 加人200 μl 无水乙醇，充分振荡混匀15 sec，此时可能 会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。 将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中 （吸附柱放入收集管中），12,000 rpm (~13,400×g)离 心30 sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。 向吸附柱CB3中加入500 μl缓冲液GD （使用前请先检查 是否已加入无水乙醇），12,000 rpm (~13,400×g)离心 30 sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
实验步骤
6. 向吸附柱CB3中加入600 μl 漂洗液PW（使用前请先检查是 否已加入无水乙醇），12,000 rpm (~13,400×g)离心30 sec， 倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。 7. 重复操作步骤6。 8. 将吸附柱CB3放回收集管中，12,000 rpm(~13,400×g)离心2 min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底 晾干吸附材料中残余的漂洗液。 9. 吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位 悬空滴加50-200 μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5 min， 12,000 rpm (~13,400×g)离心 2 min，将溶液收集到离心管 中。
病理生理教研室
化疗药物诱导细胞凋亡（一） 肿瘤细胞总DNA提取
细胞凋亡
细胞凋亡是指细胞在一定的生理或病
理条件下，受内在遗传机制的控制自 动结束生命的过程
化疗药物诱导的细胞凋亡
细胞凋亡的过程不同于坏死性死亡，其染色质断裂， 细胞核碎裂程核裂片，细胞质浓缩，细胞体积减小， 细胞膜内折，整个细胞通过起泡和发芽方式形成大 小不等凋亡小体。 凋亡的细胞的核DNA的断裂发生在核小体之间，因此 产生的断裂DNA在电泳时会呈180-200bp整数倍大小 的阶梯状条带，这是识别凋亡细胞的可靠生化特征。 能诱导细胞凋亡的枉法有很多，这里主要采取化疗 药物诱导细胞凋亡