基因重排检测技术诊断脾脏淋巴瘤

基因重排检测技术诊断脾脏淋巴瘤

朱少君李艳红张伟王姝妹巩丽兰淼

【摘要】目的: 利用B和T淋巴细胞产生的抗原受体分子基因重排检测技术，探讨1例原发性脾脏恶性淋巴瘤(PLS)基因重排检测结果. 方式: 从组织蜡块中切取组织片5~10张，提取基因组DNA，PCR扩增，聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染显示基因重排结果. 结果: 脾脏淋巴瘤免疫组化证明为B细胞性滤泡性淋巴瘤. 从24个不同部位取得的组织经PCR均扩增成功，所有部位组织T细胞受体基因重排阴性，22个部位组织B细胞单克隆性免疫球蛋白基因重排阳性，基因重排阳性率%. 结论: 应用PCR法检测B淋巴细胞IgH和T淋巴细胞TCR基因重排可作为淋巴细胞来源的良、恶性病变的一种辅助诊断手腕，对脾脏淋巴瘤有较高的诊断价值.

【关键词】淋巴瘤；基因重排；聚合酶链反映；脾脏

【Abstract】 AIM: To assess the significance of detecting the gene rearrangements of IgH and TCR in the diagnosis of primary malignant lymphoma of the spleens (PLS). METHODS: Twenty four samples were taken from different places of the PLS. Genomic DNA was extracted, and amplified via PCR. The products were resolved on denaturing polyacrylamide gels and visualized through silver staining. RESULTS: All samples were successfully

amplified. Gene rearrangements of IgH and TCR were negative in 10 cases of reactive lymphoid hyperplasia. In all of the 24 samples from PLS, gene rearrangements of TCR γ and TCR β were not found, and IgH gene rearrangements were found in 22 samples %). There was remarkable difference between PLS group and benign group in gene rearrangment (P<. CONCLUSION: Detection of the gene rearrangements of IgH and TCR by PCR could be a kind of subsidiary means to diagnose the lymphoproliferative disease. It is very helpful in the diagnosis of splenic lymphoma.

【Keywords】 lymphoma; gene rearrangement; polymerase chain reaction; spleen

0引言

恶性淋巴瘤(malignant lymphoma)是脾脏最多见的恶性肿瘤，一样为全身性疾病的一部份. 原发性脾脏淋巴瘤(primary lymphoma of the spleen, PLS)少见，占所有淋巴瘤的1%~3%. 通过基因重排，机体产生大量多样的重排构型，编码种类繁多的抗原特异性抗体. 但关于一个个体及其后代，只含有其独特的重排构型，也确实是说，一个T, B细胞或其克隆性后代，均只含一种独特的分子遗传学标记. 一旦某一克隆的淋巴细胞发生恶性转变, 即可呈现特异的基因重排［1］. 因此, 对基因重排类型进行检测可用于对淋巴细胞增殖

性疾病的诊断. 咱们应用这一手腕，探讨1例脾脏淋巴瘤的基因重排检测结果，并对该技术在脾脏淋巴组织增生性病变中的诊断价值进行探讨.

1材料和方式

材料

脾脏恶性淋巴瘤标本 1 例来自第四军医大学第二附属医院病理科. 女，69岁. 已排除淋巴瘤或白血病累及脾脏. 标本为40 g/L 中性甲醛液固定,石蜡包埋. 制备厚度为4 μm的切片6张，贴于载玻片上，常规烤片、二甲苯脱蜡、酒精冲洗，切片自然干燥. 用无菌双面刀片将组织刮入 mL的离心管中，按以前的方式［2-3］提取基因组DNA. 引物序列由上海生工生物工程技术公司合成. 引物序列为: β球蛋白基因内对照PC03：ACACAACTGTGTTCACTAGC, PC04：CAACTTCATCCACGTTCACC; 免疫球蛋白基因重排(IgH) FR3A：ACACGGCTGTGTATTACTGT, LJH：TGAGGAGACGGTGACC, VLJH：GTGACCAGGGTACCTTGGCCCCAG; T细胞受体基因重排(TCR β链和γ链) Db1: CAAAGCTGTAACATTGTGGGGAC, Jb2:AGCACTGTGAGCCTGGTGCC, TVG: AGGGTTGTGTTGGAATCAGG, TJX: CGTCGACAACAAGTGTTGTTCCAC, Vγ11: TCTGGAGTCTATTACTGTGC, Vγ101: CTCACACTCTCACTTC, Jγ12: CAAGTGTTGTTCCACTGCC, Jp12: GTTACTATGAGCTAGTCC.

方式

PCR扩增在PT200型热循环仪（MJ Research）上进行. 反映体系为25 μL，含10 mmol/L dNTP（Gibco BRL） 2 μL，10×缓

冲液μL，50 mmol/L MgCl2 μL，Taq DNA聚合酶（Gibco BRL） nkat，20 pmol/L引物1 μL，DNA样品1~5 μL. IgH基因采纳半巢氏PCR 扩增: 第1轮引物为FR3A和LJH, 95℃预变性3 min, 然后94℃变性40 s, 62℃退火50 s, 72℃延伸40 s, 共30个循环; 最后72℃延伸10 min. 扩增产物经1∶100稀释后取1 μL进行第2轮扩增, 引物为FR3A和VLJH, 95℃预变性3 min，然后94℃变性40 s，60℃退火50 s, 72℃延伸40 s, 共30个循环; 最后72℃延伸10 min. FR 3A与VLJH 扩增产物为100~120 bp. TCRβ和TCRγ采纳40个循，其中TCRγ引物为Vγ11, Vγ101和Jγ12或Vγ11, Vγ101和Jp12的混合物. 95℃预变性3 min，然后94℃变性40 s，56℃退火50 s，72℃延伸40 s；最后72℃延伸10 min. TCRβ扩增产物为65~ 85 bp. TCRγ各组扩增产物在70~200 bp不等. β球蛋白基因引物作为内对照进行扩增，共40个循环. 95℃预变性3 min，然后94℃变性40 s，60℃退火50 s，72℃延伸40 s；最后72℃延伸10 min. 产物长度为110 bp. 琼脂糖凝胶（20 g/L）电泳评判扩增成效后，将3 μL产物和等体积的上样缓冲液［3］（990 mL/L甲酰胺，1 g/L溴酚蓝，1 g/L二甲苯青）混匀后加到厚度为 mm的聚丙烯酰胺凝胶（100 g/L，含尿素8 mol/L），应用miniVE系统（Amersham Pharmacia Biotech）泳动8 h（80 V）. 掏出后按以前的方式［3］银染，别离用UVP凝胶分析系统（UVP, Cambridge，UK）和光学照相记录数据，依照IgH及TCR相应阳性位置判定结果. 阳性结果判定标准：① PCR扩增电泳条带清楚，宽度不大于1 mm，边缘锐利；②片段大小与估量范围相符,与期望值相差不超