2020年生物化学实验课件-西南科技大学生命科学与工程学院首页参照模板

操作步骤
准确称取0.5g植物材料，加入2ml预冷的提 取缓冲液，0.1g聚乙烯吡咯烷酮PVP和50μl 的β-巯基乙醇，置冰浴研磨匀浆后,转移到 10ml塑料离心管，用3ml提取液分两次洗涤 研钵，提取液总体积5ml，10000g下离心 10min，上清液为可溶性蛋白的粗提液。
二、植物可溶性蛋白含量的测定
离心机基本原理
⒈离心力（centrifugal force，Fc）离心作用 是根据在一定角度速度下作圆周运动的任何物体 都受到一个向外的离心力进行的。离心力（Fc） 的大小等于离心加速度ω2X与颗粒质量m的乘积， 即：
FC＝m ω2X 其中ω是旋转角速度，以弧度/秒为单位；X是 颗粒离开旋转中心的距离，以cm为单位；m是质 量，以克为单位。
⒉相对离心力（relative centrifugal force，RCF）由于各种 离心机转子的半径或者离心管至旋转轴中心的距离不同， 离心力而受变化，因此在文献中常用“相对离心力”或 “数字×g”表示离心力，只要RCF值不变，一个样品可以 在不同的离心机上获得相同的结果。 RCF就是实际离心场转化为重力加速度的倍数。
• 原理
• 考马斯亮蓝 G-250 （ Coomassie brilliant blue ， G-250 ）法是利用蛋白质 -染料结合的原理，定量 地测定微量蛋白质浓度的快速、灵敏的方法。
• 考马斯亮蓝 G-250 存在着两种不同的颜色形式， 红色和蓝色。它和蛋白质通过范德瓦尔键结合， 在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符 合比尔定律。此染料与蛋白质结合后颜色由红色 形式转变成蓝色形式，最大光吸收由 465 nm 变 成 595 nm ，通过测定 595 nm 处光吸收的增加量 可知与其结合蛋白质的量。
RCF＝F离心力/F重力＝ m ω2X/mg=1.118×10－5 . N . X N（rpm）=RCF×105 /（1.18×X）
式中X为离心转子的半径距离，以cm为单位；g为地球重力 加速度（980cm/sec2）；N为转子每分钟的转数（rpm）。
植物细胞破碎后通过差数离心形成的沉淀
沉淀 A B
C D E F
转速×时间 150g×20min 1000g×20min
内含物 完整细胞 细胞核，细胞碎片
3000g×6min
叶绿体
10000g×20min 线粒体、溶酶体、微体
100500g×20min 微粒体
100500g×20min 核糖体
＋0.26%脱氧胆酸
实验注意事项：
• 整个操作过程在0－4℃低温下进行； • 研磨必须充分；
试剂与仪器设备
• 冷冻离心机，研钵，烧杯，离心管， • （二）试剂 • 1. 标准蛋白质溶液（ 100 μg ／ mL 牛血清白蛋白）：称
取牛血清蛋白 25 mg ，加水溶解并定容至 100 mL ，吸取 上述溶液 40 mL ，用蒸馏水稀释至 100 mL 即可。 • 2. 考马斯亮蓝试剂：称取 100 mg 考马斯亮蓝 G-250 ，溶 于 50 mL 90 ％乙醇中，加入 100 mL 85 ％（ W ／ V ） 的磷酸，再用蒸馏水定容到 1000 mL ，贮于棕色瓶中。 常温下可保存一个月。 • （三）仪器设备 • 分光光度计，烧杯，量瓶，移液管，试管等。
• 蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约 2 min 即可反应完全，呈现最大光吸收，并 可稳定 1 h ，之后，蛋白质–染料复合物发 生聚合并沉淀出来。此法灵敏度高（比
Lowry 法灵敏 4 倍），易于操作，干扰物 质少，是一种比较好的定量法。其缺点是
在蛋白质含量很高时线性偏低，且不同来 源蛋白质与色素结合状况有一定差异。
• 加蛋白酶抑止剂（PMSF 苯甲基磺酸氟）或抗
氧化剂； • 提取的蛋白一般需要分装后，在液氮或－80℃低
温下保存。
实验材料、试剂与仪器设备
（一）实验材料 自选植物材料，至少三种以上处理，例如： 1、不同植物的叶片； 2、同一植物的根、茎、叶、花等不同组织器
官； 3、同一植物不同发育状态如嫩叶、成熟叶和
蛋白质含量 0 （ μg ）
管号
2
3
4
5
6
0.20 0.40 0.60 0.80 1.00
0.80 0.60 0.40 0.20
0
20
40
60
80
100
ห้องสมุดไป่ตู้
2. 样品测定
吸取先前提取的可溶性蛋白提取液 0.1 mL （视蛋白质含量适当稀释），放入试管 中（每个样品重复 2－3 次），加入0.9ml蒸 馏水，加入 5 mL 考马斯亮蓝试剂，摇匀， 放置 2 min 后在 595 nm 下比色，测定吸光 度，并通过标准曲线查得蛋白质含量。
一、不同植物样品可溶性蛋白的提取
• 原理 植物材料中通常含有两类蛋白，一种是易溶
于水主要存在于细胞基质、叶绿体基质和线粒体 等细胞器基质中的可溶性蛋白，另一类是难溶于 水主要存在于各种细胞器膜上的膜结合蛋白。将 植物材料在一定的提取缓冲液和0～4℃低温下充 分研磨，可溶性蛋白将溶解在提取缓冲液里，通 过离心将未破碎细胞器和膜蛋白去除，得到的离 心上清夜就是可溶性蛋白的粗提物。
操作步骤
1. 标准曲线的绘制
取 6 支试管，按下表 加入试剂，摇匀，向各管中加入 5 mL 考马斯亮蓝试剂，摇匀，并放置 5 min 左右，以 0 号试管为空白对照，在 595 nm 下比色测定吸光度。以 蛋白质含量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
试剂
1
标准蛋白质 0 （ mL ）
蒸馏水量 1.00 （ mL ）
老叶； 4、或者叶片用不同的高温处理等等。
（二）试剂
1．提取缓冲液：0.125 mol 的Tris-HCl, pH7.0，称取12.5gTris于烧杯，用适量双蒸 水溶解，HCl调pH至7.0,定容至1000ml。
2．聚乙烯吡咯烷酮（PVP）
3．β-巯基乙醇
（三）设备
冷冻离心机，研钵，烧杯，量瓶，移液管， 试管等
不同植物样品可溶性蛋白 含量和多肽组分的差异
实验目的
• 掌握冷冻离心机的操作使用方法。 • 掌握植物可溶性蛋白的提取方法和原理。 • 掌握分光光度计的使用方法和原理。 • 掌握可溶性蛋白的定量测定方法和原理。 • 掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理和基
本操作过程。
实验包括三个部分内容： 一、不同植物样品可溶性蛋白的提取。 二、植物可溶性蛋白含量的测定。 三、聚丙烯凝胶电泳分离可溶性蛋白。