人皮肤成纤维细胞的获取-
老化皮肤成纤维细胞的研究进展
白ＡＰ一１，调节帅一１，３基因的表达，从而调控删Ｐｓ的表达，
降解胶原【１９】。研究人员进一步证实，自然老化皮肤的胶原降 低是由于成纤维细胞合成胶原减少，分泌的ＭＭＰ一１，２增加， 而光老化皮肤的胶原减少主要是成纤维细胞分泌Ｍ肝增加， 而胶原合成下降不明显嘲。Ｍ肝活性增强，降解胶原纤维、弹 性纤维和基质增多，导致皮肤松弛，出现较深皱纹。 真皮组织结构的维持除了与ｌｄｌｄＰｓ活性有关之外，还与 其组织抑制剂ＴＩＭＰ关系密切。近年来相关研究表明［２１１，ＭＭＰｓ 分泌增加，或者ＴＩＭＰ分泌减少均使胶原分子细胞内降解增 加。例如局部应用脱氢表雄酮可以诱导成纤维细胞表达转化 生长因子一１３和结缔组织生长因子，抑制ⅦＶｌＰ－１合成，促进 ＴＩＭＰ一１分泌，使胶原合成增ｊ］ｇｔ２ｚｊ。
ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓ，２００１，３８９（１）：１－６．
［１６］Ｂｅｍｅｂｕｒｇ Ｍ，Ｐｌｅｔｔｃｎｂｅｒｇ Ｈ，Ｋｒｕｔｍａｌｍ Ｊ．Ｐｈｏｔｏａｇｉｎｇ ｏｆｈｕｍａｎ ｓｋｉｎ 硼．ＰｈｏｔｏｄｅｒｍａｔｏｌＰｈｏｔｏｉｍｍｕｎｏｌ Ｐｈｏｔｏｍｅｄ，２０００，１６（６）：２３９—２４４． 【１７］Ｋｏｎｄｏ Ｓ．Ｔｈｅ ｒｏｌｅｓ ｏｆｅｙｔｏｋｉｎｅｓ ｉｎ ｐｈｏｔｏａｇｉｎｇ【刀．Ｊ Ｄｃｒｍａｔｏｌ Ｓｃ皮肤科杂志，２００３，３２（Ｄ：４２４－４２６． 【１５］Ｂｉｅｓａｌｓｋｉ ＩｌＫ，Ｏｂｅｒｍｕｅｌｌｅｒ－Ｊｅｖｉｃ ＵＣ．ＵＶ ｌｉｇｈｔ，ｂｅｔａ－ｃａｒｏｔｅｎｅ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｓｋｉｎ－ｂｅｎｅｆｉｃｉａｌ ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｌｌｙ ｈａｒｍｆｕｌ ｅｆｆｅｃｔｓ【Ｊ】．Ａｒｃｈ
凋亡［７】。
星状。细胞核较大，扁卵徊形，着色浅，核仁明显Ⅲ。细胞质较 丰富，呈弱嗜碱性。胞质内有较多的核糖核酸，碱性磷酸酶的 活性很强。电镜下，细胞表面有一些微绒毛和粗短的突起，胞 质内富含粗面内质网、游离核糖体和发达的高尔基复合体。 成纤维细胞的超微结构表明，细胞合成蛋白质功能旺 盛。成纤维细胞既合成和分泌胶原蛋白，弹性蛋白，生成胶原 纤维、网状纤维和弹性纤维，也合成和分泌糖胺多糖和糖蛋 白等基质成分“】。在婴儿和青年人皮肤中，Ｉ犁胶原蛋白的含 量约占７０％，ＩＩＩ型胶原蛋白占３０％。在衰老过程中，成纤维 细胞合成Ｉｌｌ型胶原蛋白增加，Ｉ型胶原蛋白减少。成纤维细 胞受损，还町以产生大量异常弹性蛋白，导致皮肤弹性下降， 皱纹增多，且难以平复。
抗坏血酸_成纤维细胞培养_解释说明以及概述
抗坏血酸成纤维细胞培养解释说明以及概述1. 引言1.1 概述本文旨在探讨抗坏血酸在成纤维细胞培养中的作用机制，并解释其与成纤维细胞生物学过程的关联。
抗坏血酸，也被称为维生素C，是一种重要的水溶性维生素，在人体中扮演着多种重要的生理功能角色。
而成纤维细胞作为基质合成和调节过程中至关重要的一环，其培养方法及应用领域也备受研究者关注。
因此，深入了解抗坏血酸在成纤维细胞培养过程中的作用机制将对进一步揭示其生物学活性和应用前景具有重要意义。
1.2 文章结构本文将分为五个主要部分进行论述。
首先，引言部分将提供对文章主题的概述和定义以及文章整体结构。
其次，我们将介绍抗坏血酸（维生素C）的定义、特性、生理功能以及相关缺乏症状和食物来源。
第三部分则涵盖了成纤维细胞培养的概述、原理及其在科研和应用领域中的意义。
接下来，我们将详细解释抗坏血酸在成纤维细胞培养中的作用机制，包括抗氧化作用、与胶原合成的关联以及对细胞增殖和凋亡的调节效应。
最后，我们将总结并得出相关结论。
1.3 目的本文旨在全面阐述抗坏血酸在成纤维细胞培养中的作用机制。
通过深入了解抗坏血酸对成纤维细胞生物学过程的影响，希望能够揭示其在相关领域中的潜力和应用前景。
同时，本文也将为科学界提供更多关于抗坏血酸与成纤维细胞之间相互作用的理论依据，并为进一步研究该领域提供参考和指导。
2. 抗坏血酸2.1 定义和特性抗坏血酸，也称为维生素C，是一种水溶性维生素。
化学名为L-抗坏血酸，分子式为C6H8O6。
它是人体必需的营养物质之一，人体无法自主合成，因此需要通过食物摄入。
抗坏血酸具有许多特点和特性。
首先，它是一种强大的抗氧化剂，在体内可以中和自由基，并保护细胞免受氧化应激的伤害。
其次，抗坏血酸对于胶原蛋白的合成至关重要，它促进胶原蛋白的生成与修复，并维持皮肤、组织和器官的健康状态。
此外，抗坏血酸还能增强免疫系统功能、促进铁元素吸收以及参与多种生理过程。
2.2 生理功能抗坏血酸在人体中拥有多项重要的生理功能。
两种人包皮成纤维细胞分离培养方法的比较_NormalPdf
中南大学学报（医学版）J Cent South Univ (Med Sci)2021,46(8)两种人包皮成纤维细胞分离培养方法的比较曹卉1，王薇2，肖敬川1，黄邓高1，高元慧1，朱丹1（1.中南大学湘雅医学院附属海口医院中心实验室，海口570208；2.中南大学湘雅医学院附属海口医院皮肤科，海口570208）[摘要]目的：作为理想的种子细胞，成纤维细胞的高效获取及纯化尤为重要。
本研究通过比较改良组织块培养法(improved tissue culture method ，ITCM)及酶消化培养法(enzyme digestion method ，EDM)分离培养人包皮成纤维细胞(human foreskin fibroblasts ，HFF)，以探讨两种方法的优缺点。
方法：ITCM 是将剪碎的皮肤组织置0.1%II 型胶原酶中于4℃下消化过夜，分离表皮与真皮，对真皮组织采用0.25%胰酶于室温下再次消化15min ，待组织块贴壁于培养皿后进行培养。
EDM 是将剪碎的皮肤组织置0.25%胰酶中于4℃下消化过夜，分离表皮与真皮，将真皮组织再次于4℃下用0.1%II 型胶原酶消化过夜，然后将组织块与酶的混合物一起过滤、挤压，用含有胎牛血清的培养基冲洗滤网，对得到的细胞悬液进行培养。
ITCM 与EDM 均采用两种酶进行消化，但两种酶的使用顺序、消化时间及温度不同，最终接种于培养皿中进行后续培养的分别是组织块和细胞悬液。
本研究利用ITCM 和EDM 分离、培养HFF ，观察ITCM 组和EDM 组HFF 的原代至第3代(Passage 0~Passage 3，P0~P3)的细胞形态；染色波形蛋白、CD68和角蛋白以鉴定细胞纯度；绘制P3生长曲线对比两组细胞的增殖能力。
采取120mJ/cm 2的中波紫外线(medium-wave ultraviolet ，UVB)照射P3ITCM 组和EDM 组HFF ，建立光损伤模型。
成纤维细胞
成纤维细胞科技名词定义中文名称：成纤维细胞英文名称：fibroblast定义：普遍存在于结缔组织中的一种中胚层来源的细胞。
分泌前胶原、纤连蛋白和胶原酶等细胞外基质成分，伤口愈合过程中可迁移到伤口进行增殖。
所属学科：细胞生物学（一级学科）；总论（二级学科）本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布百科名片疏松结缔组织中的成纤维细胞成纤维细胞（fibroblast）是疏松结缔组织的主要细胞成分，由胚胎时期的间充质细胞(mesenchymalcell) 分化而来。
成纤维细胞较大，轮廓清楚，多为突起的纺锤形或星形的扁平状结构，其细胞核呈规则的卵圆形，核仁大而明显。
根据不同功能活动状态，可将细胞划分成成纤维细胞和纤维细胞，成纤维细胞功能活动旺盛，细胞质弱嗜碱性，具明显的蛋白质合成和分泌活动，在一定条件下，它可以实现跟纤维细胞的互相转化。
成纤维细胞对不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损以及骨创伤的修复有着十分重要的作用。
目录细胞的功能活动状态划分来源特征创伤修复分离培养原代培养展望展开编辑本段细胞的功能活动状态划分根据不同的功能活动状态，将细胞分为成纤维细胞和纤维细胞二型：成纤维细胞乃是功能活动旺盛的细胞，细胞和细胞核较大，轮廓清楚，核仁大而明显，细胞质弱嗜碱性，具明显的蛋白质合成和分泌活动；纤维细胞（fibrocyte）功能活动不活跃，细胞轮廓不明显，核小着色深，核仁不明显，细胞质少。
此二型细胞可互相转化。
[1]编辑本段来源成纤维细胞：数目最多，胞体大，为多突的纺锤形或星形的扁平细胞，细胞核呈规则的卵圆形，细胞轮廓不清。
成纤维细胞摄取所需的氨基酸，如脯氨酸和赖氨酸等，在粗面内质网的核蛋白体上合成前α多肽链（proalphapolypeptidechain ），多肽链输送到高尔基复合体后，组成前胶原分子（procollagen ）。
前胶原分子由分泌囊泡带到细胞表面，然后通过胞吐作用释放到细胞外。
在前胶原肽酶催化下，将每一前α多肽链的尾段除去，成为原胶原分子（tropocollagen ）。
皮肤组织块培养获取原代细胞的实验观察
皮肤组织块培养获取原代细胞的实验观察目的：从皮肤组织块培养获取原代细胞。
方法：将皮肤组织块修剪成2mmX 2mm大小，放置到培养皿中，真皮层向下，观察细胞爬出的情况。
结果：组织块培养第3天，有角质形成细胞从组织块爬出，第7天左右组织块周围出现黑素细胞，随着培养时间的延长，组织块周围出现大量成纤维细胞。
结论：在组织块培养过程中，早期可以收集较纯的角质形成细胞，含血清的DMEM培养20d后，可以得到大量成纤维细胞。
标签：组织块培养；原代细胞；前体细胞皮肤原代细胞的获得与培养对于基础和临床研究有着重要的意义。
然而，通过中性蛋白酶和胰酶消化将表皮细胞游离，然后进行细胞的贴壁培养，继而经差别胰酶消化将细胞纯化，得到的角质形成细胞容易受到成纤维细胞的污染。
在本实验中，通过皮肤组织块的培养方法，通过不同细胞从组织块爬出的时间不同，探索获得原代细胞的方法。
1 材料和方法1.1 材料1.1.1 包皮：包皮环切术中的包皮组织（提供者为18岁健康男性）1.1.2 试剂：中性蛋白酶（sigma），0.05%及0.25%的胰酶/0.53mmol/LEDTA （吉诺牛物公司），人黑素细胞培养基（Medium 254）及黑素细胞牛长添加成分（human melanocyte growth supplement，HMGS）（包含5μg/ml胰岛素，50μg/ml 维生素C，6mmol/LL一谷氨酰胺，0. 20mmol/L氯化钙等），人表皮细胞无血清培养基，角质形成细胞牛长添加成分（humankeratinocytegrowthsupplement，HKGS）（0. 18μg/ml氢化可的松、0.20ng/ml EGF、5μg/ml转铁蛋白、5μg/ml胰岛素和8μg、ml霍乱毒素）（美国Invitrogen公司），胎牛血清（四季青）（浙江天航牛物科技有限公司），兔抗人Vimentin单克隆抗体（福州迈新牛物科技有限公司），GTVisionTMⅢ抗鼠/兔通用型免疫组化检测试剂盒（上海基因科技有限公司）。
人皮肤成纤维细胞原代培养及生物学特性_王晓华
人皮肤成纤维细胞原代培养及生物学特性王晓华，王扬，蒋涛，付立业，姜又红（中国医科大学附属第一医院肿瘤研究所，沈阳110001）摘要：目的探索和建立人皮肤成纤维细胞原代培养的方法，为皮肤成纤维细胞在临床医学中的应用提供可靠的科学依据。
方法胰蛋白酶消化法分离培养人皮肤成纤维细胞；细胞生长曲线及MTT 法测定细胞增殖能力；流式细胞仪测定细胞生长周期及细胞增殖指数；倒置显微镜下观察成纤维细胞生长状态；HE 染色观察细胞爬片下的形态及着色；免疫组织化学染色观察成纤维细胞中间丝波形蛋白；电子显微镜下观察成纤维细胞超微结构。
结果体外用胰蛋白酶消化法建立了人皮肤成纤维细胞；传5代内细胞及传5代内冻存复苏后人皮肤成纤维细胞增殖能力均很强；倒置镜下观察、HE 染色、波形蛋白免疫组化染色及电镜下观察鉴定培养细胞的形态及生物学特性符合成纤维细胞。
结论本研究确立了体外人皮肤成纤维细胞原代培养。
关键词：人；皮肤；原代培养；成纤维细胞；细胞增殖指数；细胞形态学中图分类号：R318.08文献标志码：A文章编号：0258-4646（2010）12-1041-04Primary Culture and Biological Characteristics of Human Skin Fibroblasts 随着年龄的增长，皮肤会出现松弛、干燥粗糙、弹性下降、皱纹增多等老化现象，这些现象都与成纤维细胞数量减少以及分泌合成功能下降或异常有关［1］。
人皮肤成纤维细胞是皮肤真皮网织层中最重要的细胞，是皮肤衰老和细胞受损后的主要修复细胞之一［2］。
它不但能够促进表皮细胞的迁移、增殖和分化，还能分泌大量的胶原蛋白、弹性纤维蛋白及多种细胞修复因子，具有强大的自我更新能力［3］，从而修复老化的皮肤。
成纤维细胞是维持皮肤弹性和韧性的重要细胞［4］，因其特有的生物学特性，在抗皮肤衰老中起着重要的作用。
本研究拟通过皮肤成纤维细胞的分离和体外培养，观察、总结体外培养的成纤维细胞生物学特性，在细胞水平上对皮肤成纤维细胞的形态及生物学特性进行研究，以获得在体外稳定生长的皮肤成纤维细胞，为成纤维细胞在医学美容除皱术中的应用提供可靠的科学依据［5］。
人成纤维细胞提取方法
人成纤维细胞提取方法
人成纤维细胞的提取通常涉及以下几个步骤：
1. 组织取材：从健康的人体皮肤（通常是真皮层）中获取组织样本。
临床标本需要经过彻底清洗以避免污染，并且将真皮层尽可能剪碎，这有利于成纤维细胞的迁出。
2. 组织消化：使用适当的消化酶（如胶原酶）处理剪碎的组织，以帮助释放成纤维细胞。
新生儿真皮组织包含更多细胞和更少的细胞外基质，因此可以从新生儿组织中分离出细胞。
如果从成人皮肤中分离，可能需要使用更大量的起始组织并提高胶原酶浓度。
3. 细胞培养：将消化后释放出的细胞接种到培养皿中，并在适宜的培养条件下进行培养。
培养条件通常包括非动物源性或含血清的培养基，以及恒温恒湿的培养环境。
4. 细胞传代：当细胞达到一定的密度时，需要进行传代培养，以确保细胞的持续生长和扩增。
5. 细胞鉴定：通过形态学观察和特定的免疫化学标记来鉴定所提取的细胞是否为成纤维细胞。
成纤维细胞在形态上通常呈梭型或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。
总的来说，在进行人成纤维细胞的提取和培养时，需要在无菌条件下操作，使用二级生物安全柜，并采取适当的个人防护措施，如佩戴双层手套、护目镜和实验服。
同时，处理人体组织时应采取通用预防措施，并妥善处置受污染的材料。
人皮肤瘢痕成纤维细胞的原代培养及鉴定
表 １ 合 并 带 状 疱 疹 后 疼 痛 发 生 情 况 ３ 结 果
３１ ．护理干预前后带状疱疹神经痛程度比较见表 ２ 由表 ２可见对并发带状疱 。 疹的肿瘤 患者 ， 带状疱 疹的发生 、 针对 发展与转归的特点， 进行心理 、 皮肤和疼
痛等综合护理干预措施后， 例患者疼痛程度明 １ ４ 显减轻， 疼痛缓解有效率为
９ ． 与干预前比较差异有显著性意义 ＜ ．１ ３ ％， ３ ， Ｏ） ０ 。
表 ２ 护 理干 预 前 后 带状 疱 疹 疼 痛 程 度 比 较
３ 经过综合 治疗 和精心护理， ． ２ 所有患者 ｌ４周后痊愈， ～ 疱疹面均愈 合完好，
等具有较 强的抗疱疹病毒作用 的药物， 可减少新损害 的形成， 制止病 毒扩 散和 减少 内脏并发症 。 ４ — ２ｈ内给予效果好， 在 ８ ７ 能缩短疼痛时间， 减轻瘢痕形成１ ３ １ 。 护理人员应熟练掌握带状疱疹的早期临床症状 ， 在护理工作 中要 勤观察， 多巡 视。 当患者主诉局部皮肤有针刺样感 、 瘙痒感 、 潮红或神 经痛等不适时 ， 应警惕 带状疱疹 的发生 ， 一旦 发病应及 早涂药 。本 组病例 能早期应 用干扰 素、 阿昔洛 韦等药膏涂擦患处， 多数患者 １ 周内疱疹开始萎陷、 结痂 、 局部灼痛减轻。
痛的知觉。 ） （音乐有 明显 的镇静 、 ３ 镇痛功效。 指导患者疼痛时做深呼吸 ， 目 闭 聆 听柔和节奏的音乐 ， 可舒缓情绪 ， 保持心情平和安定。 ２ 心理护理 心理因素在疾病 的发生、发展 和转 归过程中具有十分重要 的 ． ３ 意义。 身患肿瘤对患者来说 已是一个不小的打击， 而突发带状疱疹 对患者 又是 种严 峻的考验。 这种双重打击使患者 脆弱的心理更容易出现障碍， 又因疼痛 剧 烈极易产生绝望 心理。因此， 护理人员 应重视患者 的主诉 ， 真诚地劝 导 、 安
人皮肤成纤维细胞库的构建
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成纤维细胞培养
人皮肤成纤维细胞库的构建试剂：胶原酶(Sigma),优质胎牛血清(GibCo),胰蛋白酶(Sigma),中性蛋白酶(Sigma),DMEM培养基(Sigma),二甲基亚碉(MerCk)O配液:成纤维细胞培养基配制:DMEM1.Og,NaHC033.7g,HEPES2.4g,优质胎牛血清IOOn1.1,青霉素IOoOoOU,链霉素IOoOOOU,超纯水加至IoOOm1,用INNaOH调PH值至7-2〜7.4,0.22Pan孑1.滤膜过滤除菌，90m]/瓶分装，一20℃贮存备用。
D-Hanks平衡盐液：NaC1.8.0g,KC1.0.4g,Na2HPO4∙12H：0134.4mg,KH~P040.06g,NaHC030.35g,酚红0.02g,青霉素IO(X)OOU,链霉素IooooOU,超纯水加至1OOorn1,用INNaoH调PH值至7.2-7A,0.22tun孔滤膜过滤除菌，90m1./瓶分装，一20C贮存备用。
方法:乙醇棉球将标本用力擦拭3遍；标本移至培养皿中，用D-Hanks平衡盐液反复用力彻底冲洗标本5遍，直至标本发白，轻度发胀；在培养皿中修剪皮下筋膜组织及多余的皮下脂肪，将标本剪成0∙3cmx2.Oem大小的皮条，置于培养皿中，加0.25%胰蛋白酶浸没组织，4°C冰箱中消化14~16h,以用眼科镣能轻轻揭下表皮为度；消化后的标本置于超净工作台上。
吸出胰蛋白酶，用DMEM漂洗2遍，中止胰蛋白酶消化作用；用眼科镜轻轻揭下表皮，置于另一培养皿中(用于培养角质形成细胞)，真皮置于培养皿中，用眼科剪将真皮成分剪成糊状(组织大小约为0.1CmXo.1CmX0.1cm),加入0.2%胶原酶浸没组织，37。
C孵箱中消化1.~4h,以将组织基本上消化散开，看不到组织块为度；力IW-HankS平衡盐液1500#Inin离心5min,5遍，以洗去胶原酶，沉淀即为成纤维细胞，弃上清，力口DMEM制成细胞混悬液，接种至50In1.培养瓶中，置37°C、5%C0：、湿度95%的CO孵箱中培养131。
人成纤维细胞的体外分离、纯化培养及细胞鉴定
人成纤维细胞（ Fibroblasts，Fbs） 是由胚胎时期间充质细胞 分化而来。成纤维细 胞 主 要 存 在 于 结 缔 组 织，且 细 胞 取 材 方 便、增殖能力强、生长旺盛，体外培养后细胞生物学特性稳定。 本研究旨在探讨人成纤维细胞分离、纯化培养的技术，为成体 细胞移植奠定基础。
人 成 纤 维 细 胞 的 体 外 分 离 、纯 化 培 养 及 细 胞 鉴 定
王玲玲1 马 峰2 张玉成 杜珍武 张桂珍 （ 吉林大学中日联谊医院中心研究室，吉林 长春 130033）
〔摘 要〕 目的 对人皮肤成纤维细胞进行分离、纯化、培养及细胞鉴定，探讨一种高效的分离及纯化方法，为细胞移植提供种子细胞。方法 使用酶消化法原代提取人成纤维细胞，快速贴壁法纯化细胞，对细胞进行形态学观察、HE 染色，免疫细胞化学鉴定细胞标志物 Vimentin。结果 利 用倒置显微镜及 HE 染色，可见细胞为散在分布的梭形贴壁细胞，当细胞汇流时，呈鱼群样或漩涡状排列，且细胞在 15 代内形态保持不变。结论 成 功地发现快速提取成人成纤维细胞的方法，为成人自体细胞移植的研究奠定了基础。
1 北华大学附属医院神经内科 2 吉林大学中日联谊医院放射线科 通讯作者： 张桂珍（ 1955-） ，女，博士生导师，教授，主要从事糖尿病分子
诊断与治疗研究。 第一作者： 王玲玲（ 1983-） ，女，主治医师，在读博士，主要从事糖尿病分
子诊断与治疗研究。
液重悬，加 入 24 孔 板，每 孔 加 0. 5 ml 细 胞 悬 液； 将 其 置 于 37℃ ，5% CO2 孵箱继续培养，待细胞融合达 80% ，吸弃原培养 液，加入 0. 01 mol / L PBS 冲洗 5 min，重复 2 次； 4% 多聚甲醛 固定，室温 20 min，蒸馏水冲洗 5 min，重复 2 次。 1. 5 细胞 HE 染色 将 1. 4 中处理的盖玻片进行以下步骤： 二甲苯（ Ⅰ） 5 ～ 10 min； 二甲苯（ Ⅱ） 5 ～ 10 min； 95% 乙醇（ Ⅰ） 1 ～ 3 min； 95% 乙 醇 （ Ⅱ） 1 ～ 3 min； 80% 乙 醇 1 min； 蒸 馏 水 1 min； 苏木精液染色 5 ～ 15 min； 流水稍洗去苏木精液 1 ～ 3 s； 1% 盐酸乙醇 1 ～ 3 s； 稍水洗 10 ～ 30 s； 促蓝液返蓝 10 ～ 30 s； 流 水冲洗 10 ～ 15 min； 蒸馏水过洗 1 ～ 2 s； 0. 5% 曙红液染色1 ～ 3 min； 蒸馏水稍洗 1 ～ 2 s； 80% 乙醇稍洗 1 ～ 2 s； 95% 乙醇（ Ⅰ） 3 ～ 5 min； 95% 乙醇（ Ⅱ） 3 ～ 5 min； 无水乙醇 5 ～ 10 min； 无水乙 醇 5 ～ 10 min； 二甲苯（ Ⅰ） 3 ～ 5 min； 二甲苯（ Ⅱ） 2 ～ 5 min； 二甲 苯（ Ⅲ） 3 ～ 5 min； 中性树胶封固定图片。 1. 6 细胞免疫组化 将 1. 4 中处理的盖玻片进行以下步骤： 细胞 上 滴 加 0. 1% TritonX-100，10 min，0. 1 mol / L PBS 冲 洗 5 min，2 次； 3 % H2 O2 溶液阻断 15 min，0. 1 mol / L PBS 冲洗 5 min，3 次； 血清封闭 30 min，滤纸擦掉多余血清； 加一抗孵育 液（ 稀释度为 1∶ 100） ，4℃ 过夜； 0. 1 mol / L PBS 冲洗 5min，3 次； 加入二抗 20 min，0. 1 mol / L PBS 冲洗 5 min，3 次； DAB 发色，水 洗终止； 苏木精复染细胞核，常规脱水透明，中性树脂封片。 对照组中一抗二抗均为 PBS。
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人皮肤成纤维细胞的获取
一、材料：手术过程中获取的老年人皮肤组织
二、所需试剂：DMEM高糖培养基，胎牛血清，胰蛋白酶，PBS缓冲液，青霉素，链霉素
三、方法：
1.提前准备好含有添加过青霉素和链霉素的PBS缓冲液的15ml离心管低温放置。
2.将得到的皮肤组织置于含有PBS（添加300U/ml青霉素和300μg/ml链霉素）的15ml
离心管中，并以冰盒存放拿至实验室立马进行实验。
3.在生物安全柜中将得到的皮肤组织于培养皿内用（含300U/ml青霉素和300μg/ml链霉
素）的PBS缓冲液反复漂洗3-5次。
4.用无菌手术刀片和镊子轻轻剪除、刮去皮下肌肉和脂肪组织。
或在PBS清洗前，用70%
酒精浸泡半分钟。
5.清理干净的皮肤组织转移至新培养皿内，用含抗生素的PBS反复清洗后，取出皮肤组织
转移到新的皿中。
6.用剪刀将皮肤剪成体积约1mm3大小的组织块。
7.将小组织块贴附于一新的培养皿底部，每平方厘米均匀接种10-15块组织。
8.5-10分钟后（以团块贴紧培养皿为准），加入少量含10%FBS的DMEM培养液，使组织
块刚刚接触培养液即可（不能浸没组织，防止组织块飘起来），置于CO2培养箱。
9.2-3h后沿培养皿边缘缓慢加入含10%FBS的DMEM培养液浸没组织块，随后将培养皿
轻轻放置于培养箱内，在移动过程中严禁剧烈晃动培养皿影响组织块的贴壁。
10.间隔2-3天观察组织块贴壁情况，并进行换液。
11.观察细胞爬出情况，当组织块周边细胞生长汇合率达90%以上时进行胰蛋白酶的消化传
代。
剩余的组织块加入10%FBS的DMEM培养液继续培养，细胞达到融合后，再消化传代，然后剩余组织块加入10%FBS的DMEM培养液继续培养，反复上面的步骤。