血清IgG的分离制备盐析法
医学免疫学：血清免疫球蛋白的纯化
实验原理
• 蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质周围亲水 基团与水形成水化膜的程度，以及蛋白质分子带 有电荷的情况决定的。
• 当用中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的 亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化 膜层减弱乃至消失;同时，中性盐加入蛋白质溶液 后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大 量被中和，更加导致蛋白溶解度降低，使蛋白质 分子之间聚集而沉淀,这个过程叫做盐析。
• 边加PBS，边关注核酸蛋白检测仪的数值变化， 当数值到达5时收集核酸蛋白检测仪出水口的液体， 当数值下降到10时，停止收集。
• 将收集到的蛋白质液体用OD280和OD260测蛋 白质浓度。
实验结果
• 用紫外分光光度计测全血清和纯化后蛋白质溶液 的吸光度值，并求出蛋白质浓度。
蛋白质含量(mg/ml)= (1.45×OD280－0.74×OD260) ×稀释倍数
1.45和0.74是常数
注意事项
• 实验步骤中，用红色标出的地方。
实验原理—盐析
• 不同性质的蛋白质可通过加入不同浓度的中性盐 而分阶段从溶液中沉淀出来。
• 分离提纯IgG最常用的中性盐是硫酸铵。 • 30～50%的硫酸铵可以沉淀IgG。
实验原理—分子筛层析
• 凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。是利 用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分 离物质的分子大小不同来进行分离。它的突出优 点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷， 吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温 度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成 分理化性质的保持有独到之处。对于高分子物质 有很好的分离效果。
液。置室温15min，离心3500rpm×10min，弃 上清。 沉淀物用2mlPBS重悬。
生物化学实验 实验五 血清IgG粗品的制备
一、目的：
掌握盐析法分离蛋白质的基本操作。
二、原理：
蛋白质的分离纯化是一项十分重要的实验技术。 盐析法是经典的蛋白质沉淀分离方法之一，其原 理是利用中性盐类能破坏蛋白分子表面的水膜， 从而使蛋白质凝聚，并从溶液中沉淀析出。沉淀 不同蛋白质所需盐类的浓度不同。例如，50%饱 和的硫酸铵能使血清中的球蛋白沉淀，而33%饱 和的硫酸则使γ-球蛋白沉淀。因此，可根据所要 分离的蛋白质，选择不同饱和度的硫酸铵溶液进 行盐析。用硫酸铵分级盐析蛋白质时，盐析出某 种蛋白质成分所需的硫酸铵浓度一般以饱和度来 表示。实际工作中将饱和硫酸铵溶液的饱和度定 为100％。盐析某种蛋白质组分所需硫酸铵数量 折算成100％饱和度的百分之几，即称为该蛋白 盐析的饱和度。
沉淀用0.4 ml PBS溶解，再滴加饱和硫酸 铵溶液0.4 ml, 冰上静置10 min，使之充分 盐析，以5000 r/min离心5 min，去掉上 清液，沉淀为IgG粗品，加0.5 ml PBS。20℃保存备用。
五、结果及பைடு நூலகம்析
1、盐析沉淀蛋白变性了吗？可以重新溶解 吗？
2、样品为什么放在冰上？
磷酸盐缓冲溶液(Phosphate-buffered saline, PBS)：NaH2PO4-H2O 0.256 g、Na2HPO4-7H2O 2.248 g、NaCl 8.76 g，加蒸馏水至1000 ml，pH7.3。
四、步骤：
取血清0.4 ml，滴加饱和硫酸铵0.4 ml，注 意边加边混合，以防止硫酸铵局部过饱和。 混合时不要过于剧烈，以免导致蛋白质变性。 冰上静置10 min，使之充分盐析，以5000 r/min离心5 min，去掉上清液，沉淀为IgG 及杂蛋白。
IgG的分离、提取与鉴定
IgG分离、纯化与鉴定实验原理操作步骤：1、取2.5ml血清，加pH7.0 PBS 2.5ml，再逐滴加入（NH4）2SO4饱和溶液1.25ml，使成20%（NH4）2SO4溶液，边加边搅拌，充分混合后，静置20min。
2、3000r/min离心20min，弃去沉淀，以除去纤维蛋白。
3、在上清液中再加（NH4）2SO4饱和溶液3.75ml，使成50%（NH4）2SO4溶液，充分混合，静置20min。
4、3000r/min离心20min，弃上清，以除去白蛋白。
5、于沉淀中加5ml PBS，使之溶解，再加（NH4）2SO4饱和溶液3.2ml，使成33%（NH4）2SO4溶液，充分混合后，静置20min。
6、3000r/min离心20min，弃上清，以除去其它球蛋白。
7、用1ml PBS溶解沉淀，装入透析袋。
8、透析除盐，在蒸馏水中透析过夜，再在pH6.7的磷酸盐缓冲液中于4℃透析24h，中间换液数次。
8、SephadexG50 除盐：用蒸馏水浸泡5小时或在沸水浴中溶胀2小时，倾倒去水，加入磷酸盐缓冲液（0.0175mol/L，pH6.7）搅拌成悬浮液，按下述方法装柱。
9、DEAE-纤维素的活化：称取1g DEAE32或52，放入5ml量筒中，加蒸馏水浸泡过夜，观察溶胀后DEAE的体积。
根据所需层析柱的柱床体积计算所需DEAE的用量，称取所需DEAE 用蒸馏水浸泡过夜，其间换几次水，每次除去细小颗粒。
抽干，改用0.5mol/L NaOH溶液浸泡1h以上，抽干（可用布氏漏斗），用无离子水漂洗，使pH至8左右（用pH试纸检查）。
再改用0.5mol/L HCl溶液浸泡1h以上，去酸溶液，用无离子水洗至pH6左右。
本实验中在用前应以0.0175mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲液，浸泡平衡后使用。
10、装柱用0.0175mol/L, pH6.7, 磷酸盐缓冲溶液浸泡已处理好的DEAE-纤维素，并更换1～2次。
然后搅拌均匀，灌入层析柱中，直至纤维素柱床高约11mL处左右为止，在床面上放一张圆形滤纸片。
血清免疫球蛋白G的分离纯化及鉴定
血清免疫球蛋白G的分离纯化及鉴定实验八血清免疫球蛋白G的分离纯化及鉴定为了初步掌握蛋白质的分离纯化技术，选择了从家畜血清中分离纯化免疫球蛋白G （Immunoglobulin G，简称IgG）的实验。
血清中的蛋白质有数十种之多，IgG是球蛋白的一种。
分离纯化蛋白质的方法是利用不同蛋白质的某些物理、化学性质（如在一定条件下带电的情况、分子量、溶解度等）的不同而建立起来的，其中有盐析、离子交换、凝胶过滤、亲和层析、制备电泳和超速离心等。
在分离纯化时，要根据情况选用几种方法互相配合才能达到分离纯化一种蛋白质的目的。
本实验采用硫酸铵盐析、DEAE-纤维素离子交换及凝胶过滤等方法，提取家畜血清中IgG。
其原理及操作如下：㈠硫酸铵盐析1.试剂饱和硫酸铵溶液pH7.0：称取（NH4）2SO4760g,加蒸馏水至1000ml，加热至5℃，使绝大部分硫酸铵溶解，置室温过夜，取上清液，用氢氧化铵调pH至7.0。
（内含0.15mol/L NaCl，简称PBS）：取0.2mol/L Na2HPO4磷酸缓冲溶液（0.01mol/L，pH7.0）溶液30.5ml，0.2mol/L NaH2PO4溶液19.4ml，加NaCl8.5g，加蒸馏水至1000ml。
磷酸缓冲溶液（0.0175mol/L，pH6.7）（不含NaCl，简称PB）：取0.2mol/L Na2HPO4溶液43.5ml，0.2mol/L NaH2PO4溶液56.6ml混合，用蒸馏水稀释至1000ml。
2.操作①取家畜血清5ml，加磷酸缓冲溶液（0.1mol/L，pH7.0）5ml，混匀，滴加（边摇边搅拌）饱和硫酸铵4ml（此时溶液硫酸铵饱和度约为20%）。
静置20min，以3000r/min 离心15min，沉淀为纤维蛋白（弃去），上清液中含清蛋白、球蛋白。
②取上清液，再加饱和硫酸铵溶液6ml（方法同前），此时溶液硫酸铵饱和度为50%，静置20min，以3000r/min 离心15min，上清液中含清蛋白，沉淀为球蛋白。
血清IgG的分离
血清IgG的分离
引言
血清IgG的分离是一种常见的实验操作，用于从血清样品中纯化和分离出IgG抗体。
IgG作为一种免疫球蛋白，在研究和诊断中具有重要的应用价值。
本文将介绍一种简单的方法来实现血清IgG 的分离。
实验材料
- 血清样品
- 柱层析试剂盒（例如，Protein A/G柱）
- 洗涤缓冲液
- 结合缓冲液
- 洗脱缓冲液
- 分离缓冲液
操作步骤
1. 准备工作：
- 将柱层析试剂盒按照说明书准备好，确保所有的缓冲液和试剂适当配置。
- 样品处理前，将血清样品离心以去除杂质。
2. 结合IgG抗体：
- 将血清样品加入结合缓冲液中，根据比例稀释适量的样品。
- 在离心前，静置样品与结合缓冲液的混合物反应一段时间（例如，30分钟）。
3. 柱层析操作：
- 将混合物通过装有填充物的柱层析柱。
- 打开流量，并在结合完毕后关闭。
- 使用洗涤缓冲液进行洗脱，以去除非特异性结合物。
4. 洗脱和收集：
- 使用洗脱缓冲液进行洗脱，以从柱层析柱上洗脱结合的IgG 抗体。
- 收集洗脱液中的纯化的IgG抗体。
5. 质量检测：
- 通过测量IgG抗体的浓度或使用其他质量检测方法来确认分离的IgG抗体的纯度和活性。
结论
血清IgG的分离是一种简单且常用的实验方法，可以用于纯化和分离血清样品中的IgG抗体。
通过选择适当的柱层析试剂盒和正确操作步骤，可以高效地获得纯化的IgG抗体。
分离的IgG抗体可以用于各种研究和诊断应用中。
第五组血清IgG的分离纯化及鉴定
Байду номын сангаас样缓冲液
甘油：蛋白质沉到样品孔底部，不漂浮 β-巯基乙醇：切断二硫键，是蛋白质分 为两单条链 SDS:是蛋白质带负电荷并呈棒状
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（四）SDS-PAGE测IgG分子量结果
猪血清、纯化的IgG样品经SDS-PAGE电泳结果如下：
1标准蛋白
2 血清
3 纯化的IgG样品
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活性鉴定
琼脂扩散
开展讨论的过程中，同学们互相学习，对实验的
设计流程有了深刻的认识。实验其间，对于细节
上的问题我们更加耐心，为将来毕业论文的开展 提供了有力的基础。
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Contents
材料与方法 结果与讨论
总结与感想
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一、材料与方法
（一）试验材料 1、试剂和材料
血清、饱和硫酸铵、0.01mol/L磷酸盐缓冲液（PH=7)、 吸管、高速冷冻离心机
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方法及步骤
方法 通过控制盐的浓度，使蛋白质混合溶液中 的各个成分分步盐析出来，达到目的蛋白质。 不同饱和度硫酸铵浓度：V=V0（C2-C1)/(1-C2) V 应加入饱和硫酸铵溶液的体积 V0 蛋白质溶液的原始浓度 C1 原来溶液的硫酸铵饱和度 C2 所要达到硫酸铵饱和度
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步骤
1、取5mL血清和5mL0.01mol/L磷酸盐缓冲 液于小烧杯中，混匀，滴加饱和硫酸铵 溶液，使溶液浓度达到20%，4℃静置 15min 2、4℃ 3000r/min离心10min,弃沉淀（沉淀 为纤维蛋白原） 3、向上清中滴加饱和硫酸铵溶液，使溶液 浓度达到50%，4℃静置15min
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4、4℃ 3000r/min离心10min,弃上清液（上 清为清蛋白，沉淀为球蛋白） 5、向沉淀中加5mL 0.01mol/L磷酸盐缓冲 液，重悬沉淀，滴加饱和硫酸铵溶液， 使溶液浓度达到35%，4℃静置20min 6、4℃ 3000r/min离心15min,弃上清液（上 清为α、β球蛋白）沉淀为IgG
血清中蛋白提取的方法与步骤
血清中蛋白提取的方法与步骤标题：血清中蛋白提取的方法与步骤引言：血清中蛋白质的提取是生物医学研究中常用的实验步骤之一。
蛋白质提取的目的是为了进一步的分析和研究，因此提取的方法很关键。
本文将介绍血清中蛋白质提取的几种常用方法，并提供详细的步骤说明。
我将分享对这些方法的个人观点和理解。
一、盐析法提取蛋白质盐析法是蛋白质提取中最常用的方法之一。
其原理是通过加入适量的盐来改变溶液的离子强度，从而使蛋白质发生沉淀。
具体步骤如下：1. 采集血清样品，并在低温（4°C）条件下保存，以避免蛋白质的降解。
2. 取出合适的血清样品量，加入等摩尔的盐溶液，如氯化铵或硫酸铵。
3. 溶液中的盐浓度随着时间的推移逐渐增加，可以通过离心将蛋白质沉淀至底部。
4. 轻轻将上清液倒掉，收集蛋白质沉淀。
5. 使用适当的缓冲液溶解沉淀的蛋白质。
个人观点和理解：盐析法是一种相对简单和快速的蛋白质提取方法，适用于提取较纯的蛋白质样品。
然而，该方法在某些情况下可能会导致蛋白质的不完全沉淀或聚集，因此在使用时需要小心操作。
二、电泳法提取蛋白质电泳法是一种常见且广泛应用于蛋白质提取的方法。
通过电泳，可以将血清中的蛋白质分离出来并收集。
以下是电泳法的具体步骤：1. 准备电泳胶和电泳缓冲液。
2. 将血清样品与电泳样品缓冲液混合。
3. 将混合样品加载到电泳胶槽中。
4. 运行电泳，在电压的作用下，蛋白质按照其电荷和大小分离迁移。
5. 根据需要，可以选择截取目标蛋白质带进行后续的分析和研究。
个人观点和理解：电泳法是一种非常有效的蛋白质提取方法，可以将血清样品中的蛋白质分离出来，并根据其迁移速率来判断其大小和电荷。
这种方法适用于从混合样品中提取特定的蛋白质。
总结与回顾：血清中蛋白质提取的方法有很多，其中盐析法和电泳法是常用的两种。
盐析法通过改变溶液中的盐浓度，使蛋白质发生沉淀，并通过离心进行分离；而电泳法则是利用电场的作用将蛋白质分离出来。
这两种方法各有优缺点，选择适合的方法取决于实验的目的和样品的特性。
免疫球蛋白的提取方法
免疫球蛋白的提取方法根据猪血中含有的各种蛋白质的分子大小、电荷多少、溶解度以及免疫学特征等,从血液中提取免疫球蛋白,常用的有盐析法、有机溶剂沉淀法、有机聚合物沉淀法、变性沉淀法等。
免疫球蛋白的提取盐析法盐析法是分离蛋白质的重要方法之一,是利用抗体与杂质之间对盐浓度敏感程度的差异性进行的。
选择一定浓度范围的盐溶液使部分杂质呈“盐析”状态,抗体成分呈“盐溶”溶解状态。
离心去除盐析沉淀状态的杂蛋白,得到的上清液再选择一定浓度范围的盐溶液使抗体成分呈盐析状态,离心得到的沉淀物即为纯化的目标抗体。
目前常用的盐析法有饱和硫酸铵分步盐析法、辛酸沉淀法、氯化铁沉淀法、多聚磷酸盐盐析法等。
饱和硫酸铵分步盐析硫酸铵是盐析法最常用的无机盐,主要原因是它溶解度大,随温度变化小,对蛋白质有保护作用,高浓度时可抑制微生物和蛋白酶的活性,价格也不贵。
免疫球蛋白的饱和硫酸铵分步盐析法操作简单,对设备和操作条件要求不高,便于工业化生产。
其具体步骤为:取一定量血浆,加生理盐水稀释,边搅拌边缓慢加入饱和硫酸铵溶液至硫酸铵终浓度20%,4℃静置1h,4000r/min离心10min,弃沉淀,上清液中继续加入饱和硫酸铵溶液至硫酸铵终浓度50%,浓氨水调pH值至7.0,4℃静置2h,4000r/min离心20m弃上清,将沉淀溶于生理盐水,超滤除盐浓缩,滤液中无S2- 4为止,即得IgG粗提物。
免疫球蛋白的辛酸沉淀法辛酸沉淀法提取IgG时,对设备和操作条件要求较高,在离心时,转速为10000 r/min,普通离心机达不到要求。
在调节溶液pH值时,要控制得当,pH值稍低或稍高对IgG的得率和纯度都有很大影响,这些都限制了它的广泛应用。
其具体步骤为:取一定量0.1mol调pH值至4.5;室温下边搅拌边缓慢加入辛酸(按辛酸25 μl/mL血清混合液添加),继续搅拌30min 后,10000r/min离心30min,弃沉淀,留上清液,上清液用多层纱布过滤,留滤液,然后将滤液装入透析袋中析48h,每8～10h换一次透析液,最后超滤浓缩即得1gG粗提液。
牛血清免疫球蛋白的盐析法提取与纯化
牛血清免疫球蛋白的盐析法提取与纯化牛血清免疫球蛋白（bovine serum immunoglobulin）是一种重要的抗体蛋白，广泛应用于生物学研究、临床诊断和治疗等领域。
为了获得高纯度的牛血清免疫球蛋白，常常采用盐析法提取与纯化的方法。
盐析法是指利用不同浓度的盐水溶液，使溶液中的蛋白质发生沉淀或沉降，在不同盐浓度条件下，可以使目标蛋白质的沉降速度和其他蛋白质的分离。
以下将详细介绍牛血清免疫球蛋白的盐析法提取与纯化的步骤。
步骤1：收集牛血清首先需要收集牛血清样品。
血清样品可以通过动脉穿刺或静脉采血获得，通常采用无菌技术操作，防止外界污染。
采血后，将血样置于容器中，让其在室温下静置一段时间，等待血液自然凝固，然后离心分离出血清。
步骤2：去除悬浮物将收集到的血清转移到离心管中，进行离心处理。
通过离心可以使血清中的颗粒物（如红细胞、血小板等）和其他杂质沉淀于离心管底部。
离心速度和时间可以根据需要进行调整，通常为3000-4000 rpm 离心10-15分钟，使血清达到较好的清晰度。
步骤3：稀释血清将血清溶液转移至一个清洁的容器中，根据需要进行适当的稀释。
稀释血清的目的是使血清中溶解的蛋白质浓度适合盐析法的操作，并提高后续纯化过程的效果。
步骤4：准备盐析缓冲液根据实验需要，选择适当的盐析缓冲液。
常用的盐析缓冲液包括氯化钠、硫酸铵、硫酸钠等。
在制备盐析缓冲液时，需要确保pH值适宜，通常在7.0-8.0之间。
同时，也需要注意所选盐的浓度和离子强度。
步骤5：盐析实验将稀释后的血清与盐析缓冲液按一定比例混合，并充分搅拌均匀，形成混合溶液。
然后，将混合溶液置于低速离心机中，以适当的速度离心一段时间。
在不同离心过程中，目标蛋白质的沉淀速度和其他蛋白质的分离效果不同。
步骤6：收集沉淀根据盐析实验的结果，目标蛋白质的沉淀位置通常在溶液的上层或下层。
将沉淀层收集到离心管中，可以通过离心将沉淀与上清液分离。
收集到的沉淀即为牛血清免疫球蛋白。
实验四 血清IgG的分离制备—盐析法
实验四 血清IgG 的分离制备—盐析法实验类型：验证型目的和要求掌握盐析法的原理及操作。
原理IgG 是免疫球蛋白（Immunoglobulin ，简称IgG ）的主要成分之一，分子量约为15万~16万，沉降生活费数约为7s 。
IgG 是动物和人体血浆的重要成分之一。
血浆蛋白质的成分多达70余种，要从血浆中分离出IgG ，首先要进行尽可能除去其他蛋白质成分的粗分离程序，使IgG 在样品中比例大为增高，然后再纯化而获得IgG 。
盐析法是粗分离蛋白质的重要方法之一。
许多蛋白质在纯水或低盐溶液中溶解度较低，若稍加一些无机盐则溶解度增加，这种现象称为“盐溶”（Salting in ）。
而当盐浓度继续增加到某一浓度时，蛋白质又变得不深而自动析出，这种现象称为“盐析‘（Salting out ）。
这些现象的原理大致是由于蛋白质是亲水胶体，带有羧基解离的负电荷或氨基解离的正电荷，其极性基团使分子间相互排斥，同时与水分子形成水膜，这些因素保证蛋白质形成溶于水的溶胶状态。
当加入少量盐时，增多了蛋白质分子上的极性基团，因而增大了蛋白质在水中溶解度，出现“盐溶”现象。
但当盐浓度增加到一定浓度时，一方面大量的水同盐分子结合，使得蛋白质没有足够的水维持溶解状态，破坏了维持蛋白质亲水胶的水膜，容易沉淀出来；另一方面加入的盐离子中和了蛋白质分子相互磁撞时即发生相互聚集沉淀出来，这样就出现了“盐析”现象。
由于各种蛋白质“盐析”出来所需的盐浓度也各异，盐析所需的最小盐量称做盐析浓度。
盐析法就是通过控制盐的浓度，使蛋白质混合溶液中的各个成分分步“盐析”出来，达到分离目的蛋白质。
盐析法是1878年Hammarster 首次使用的，他用硫酸镁成功地将血清蛋白分成为清蛋白、球蛋白两部分。
自那以后曾使用过硫酸钠、氯化钠、磷酸钠和硫酸铵等中性盐来盐析蛋白质，其中运用最广的是硫酸铵。
因为硫酸铵有许多其他盐所不具备的优点，如在水中化学性质稳定；溶解度大，25℃时能达到4.1mol/L 的浓度；溶解度的温度系数变化较小，在0~30℃范围内溶解度变化不大，如25℃时饱和溶解度为4.12mol/L ，即767g/L ，0℃时饱和溶解度为3.9mol/L ，即676g/L 。
血清IgG的分离、鉴定(2011.11)
本上是相同的。
（3）长轴的长度则与亚基分子量的大小成 正比。
胶束在SDS-PAGE系统中的电泳迁移率 不再受蛋白质原有电荷的影响，而主要取 决于椭圆棒的长轴长度，即蛋白质或亚基 分子量的大小。
当蛋白质的分子量在15KD—200KD之
（四）凝胶浓度的选择
由于SDS电泳分离并不取决于蛋白质 的电荷密度，只取决于分子解聚后SDS蛋白质胶束的大小，因此凝胶浓度的选 择会直接影响分辨率。 不同分子量范围的蛋白质应选用不
带有烷基化作用的还原SDS处理： 烷基化作用可以很好地并经久牢固地保护 SH基团，而得到窄的电泳带。
（三）三大效应
A浓缩效应
•缓冲液离子成分、PH的不连续性：电极缓冲 液通常为pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液，样品 及凝胶中缓冲液为pH6.7 Tris-HCL缓冲液。 电极缓冲液的pH=8.3，甘氨酸的电离小，有 效迁移率小，称为慢离子；浓缩胶中的氯离 子完全电离，有效迁移率大，称为快离子； 蛋白质在浓缩胶中介于二者之间。电泳开始 后，氯离子跑得最快，留下一段低电导区， 产生高电位梯度（电位与电导率成反比）， 使甘氨酸离子追赶氯离子，蛋白质夹在中间 而被压缩。1cm厚样品层可以压缩0.25μm的 厚度。
1. 标准曲线的制作及样品测定
在20～200µ g/ml范围内其峰值与RNA含量成正比 RNA标准溶液：40ug/mL
试管 标准RNA 蒸馏水 浓度 （ug/mL） 1 0 2.0 2 0.4 1.6 3 0.8 1.2 4 1.2 0.8 5 1.6 0.4 6
mL
样品 样品 1 2 2.0 2.0 2.0 0
40/1.1980
血清中蛋白提取方法
血清中蛋白提取方法血清中蛋白提取方法引言：血清中蛋白质的提取是生物化学和生物医学研究中非常重要的步骤之一。
血清中蕴含着丰富的信息，包括生物标志物、生长因子和激素等，这些成分对于研究疾病的发生机制以及诊断和治疗具有重要意义。
本文将介绍一些常用的血清中蛋白提取方法，帮助读者更好地理解和掌握这一技术。
一、盐析法盐析法是一种常用的分离和富集蛋白质的方法。
该方法通过在高盐浓度下使蛋白质发生沉淀，实现了与其他杂质的分离。
具体步骤如下：1. 准备工作：在试管中加入一定量的样品血清，并加入适量的盐溶液（如氯化铵溶液）。
2. 混匀：用试管摇床等设备将样品充分混匀，使盐溶液与血清充分接触。
3. 沉淀：将试管置于低温环境（如冰浴或低温离心机中）进行沉淀。
此时，沉淀的是蛋白质，而其他大部分成分仍溶于上清液中。
4. 离心：使用高速离心机将试管进行离心，离心速度和时间可根据样品的具体情况进行调整。
5. 分离：将上清液倒入新的试管中，留下的沉淀即为富含蛋白质的组分。
二、电泳方法电泳方法是一种常用的蛋白质分离和富集技术。
通过在电场的作用下，根据蛋白质的大小和电荷差异将其分离。
以下是一种常见的电泳方法：1. 准备样品：将一定量的血清样品进行处理，如去除脂肪和其他杂质。
2. 电泳凝胶：制备聚丙烯酰胺凝胶，并根据需要选择合适的凝胶浓度和孔径大小。
3. 样品加载：将样品血清溶液加载到凝胶孔中。
4. 电泳操作：将电泳装置连接到电源，并设定适当的电场强度和时间。
5. 分析和分离：在电泳运行后，通过染色或质谱等方法对蛋白带进行观察和分析，以确定所需蛋白质的位置。
三、亲和层析法亲和层析法是一种基于蛋白质与特定配体的亲和作用进行分离和富集的方法。
以下是该方法的一般步骤：1. 准备亲和层析柱：将具有亲和性的配体固定在柱子内部。
2. 样品准备：将血清样品进行前处理，如去除异物和杂质。
3. 样品加载：将经处理的血清样品加载到亲和层析柱中。
4. 洗脱：通过更改溶液条件或引入特定的试剂，洗脱所需的蛋白质。
IgG纯化指南
抗体的提取与纯化精制免疫球蛋白的方法很多。
一般采用综合技术，避免蛋白变性。
如分离IgG时，多结合使用盐析法与离子交换法，以求纯化。
提取IgM的方法也很多，如应用凝胶过滤与制备电泳法，或离子交换与凝胶过滤等。
一、盐析法1.取x ml血清加x ml生理盐水，于搅拌下逐滴加入2x ml饱和硫酸铵，硫酸铵的终饱和度为50%。
4℃，3h以上，使其充分沉淀。
2.离心（3000rpm）,20min,充上清，以x ml生理盐水溶解沉淀，再逐滴加饱和硫酸铵x/2ml。
置4℃3h以上（此时硫酸铵的饱和度为33%）。
3.重复上述第二步过程1～2次。
末次离心后所得沉淀物为γ-球蛋白，以 pH7.4 PBS溶解至x ml装入透析袋。
4.对PBS充分透析、换液3次，至萘氏试剂测透析外液无黄色，即无NH4+为止。
5.取透析袋内样品少许作适当倍数稀释后，以751型紫外分光光度计测定蛋白含量。
影响盐析的因素很多，如蛋白质的浓度，盐的浓度，饱和度和pH，温度等都可影响盐析的结果，操作时要充分注意。
（1）蛋白质的浓度盐析时，溶液中蛋白质的浓度对沉淀有双重影响，既可影响蛋白质沉淀极限，又可影响蛋白质的共沉作用。
蛋白质浓度愈高，所需盐的饱和度极限愈低，但杂蛋白的共沉作用也随之增加，从而影响蛋白质的纯化。
故常将血清以生理盐水作对倍稀释后再盐析。
（2）离子强度各种蛋白质的沉淀要求不同的离子强度。
例如当硫酸铵饱和度不同，析出的成分就不同，饱和度为50％时，少量白蛋白及大多数拟球蛋白析出；饱和度为33％时γ球蛋白析出。
（3）盐的性质最有效的盐是多电荷阴离子。
（4）PH值一般说来，蛋白质所带净电荷越多，它的溶解度越大。
改变PH改变蛋白质的带电性质，也就改变了蛋白质的溶解度。
（5）温度盐析时温度要求并不严格，一般可在室温下操作。
血清蛋白于25℃时较0℃更易析出。
但对温度敏感的蛋白质，则应于低温下盐析。
（6）蛋白质沉淀后宜在4℃放3小时以上或过夜，以形成较大沉淀而易于分离。
血清IgG的分离纯化及测定
SPA-sepharose亲合层析法
• protein A上柱
•
• •
血清与protein A结合
清洗掉杂蛋白 洗脱下所需IgG
IgG浓度测定
• 物理性质：紫外分光光度法 化学性质：凯氏定氮法、双缩脲法、Lowry 法 (Folin-酚法)， BCA法，胶体金法 染色性质：考马氏亮蓝染色法、银染法 其他性质：荧光法Βιβλιοθήκη 体分离多抗纯化方法有很多种：
• • • • • 盐析法 辛酸-硫酸铵沉淀 冷酒精沉淀 离子交换层析 Protein A,G亲和层析
盐析法
• 蛋白质溶液中加入中性盐后，由于中性盐与水分 子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的 水化层减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质 溶液后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电 荷大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，导 致蛋白质分子之间聚集而沉淀。
1000—10000 540 20—500 750 595
考马氏亮蓝G-250 50—500
BCA
20—200
562
紫外吸收法测蛋白质含量
• 因蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在 280nm处具有最大吸收量，且各种蛋白质的这三 种氨基酸的含量差别不大，因此测定蛋白质溶液 在280nm处的吸光度值是最常用的紫外吸收法。
• 葡萄球菌A蛋白（SPA）具有与多种哺乳动物IgG 分子fc段结合的能力，并与不同IgG亚类的结合力 有所差别。改变pH及离子强度可洗脱结合于SPAsepharose 柱上的IgG或不同的IgG亚类，可直接纯 化血清或小鼠腹水中的IgG抗体。
SPA-sepharose亲合层析法
• • • • • Protein A — 葡萄球菌A蛋白 Buffer A — PH8.6 磷酸盐缓冲液 Buffer B1 — PH5.5 枸橼酸缓冲液 Buffer B2 — PH4.0 枸橼酸缓冲液 Buffer C — PH8.6 Tris缓冲液
免疫球蛋白IgG的提取-3
免疫球蛋白IgG的提取-3五、蛋白质的盐析法向蛋白质溶液中加入不同浓度的中性盐，可以把不同的蛋白质分别沉淀出来。
这种方法称为蛋白质的盐析。
利用蛋白质的盐析法，可以得到我们所需的不同的免疫球蛋白。
最常用的中性盐包括，硅酸铵、硫酸镁、硫酸钠等，其中以硫酸铵最为常用：（一）、优点1、在水中溶解度大，其饱和溶液含有大量盐；2、在水中的溶解度受温度的影响很小；3、一般不会引起蛋白变性。
（二）、缺点提取的纯度较差，所以只能用它作为粗提。
饱和硫酸铵溶液配法：取760g～800g硫酸铵，放人70～80℃蒸馏水1000mL中，搅拌约20min，室温静置过液，硫酸铵结晶析出，即上清为饱和硫酸铵，再用NH40H调pH为7.0。
六、实验内容（一）稀释血清向血清中加入生理盐水，做1�U1稀释，主要目的，以防蛋白质溶液浓度过稠，引起其它蛋白质共沉，或局部蛋白质变性。
（二）用50%饱和度硫酸铵提取免疫球蛋白将用生理盐水按l�U1稀释的动物血清置于三角烧瓶或烧杯中，在电磁搅拌器不断搅拌下，逐滴加入与稀释的蛋白液等量的饱和硫酸铵（血清1体积+生理水1体积+饱和硫酸铵2体积），搅拌的目的是为了防止局部硫酸铵浓度过高。
搅拌后，室温放置0.5～1h，或置4℃冰箱过夜，次日取出，以每分钟4000转离心30min（离心管周围加冰块或冰水），离心后弃上清（内含白蛋白等），沉淀物中即含γ和β球蛋白。
硫酸铵溶液的饱和度是指在整个溶液中所占的百分比，与原蛋白液的浓度无关。
分子量大的蛋白质先沉淀，分子量小的蛋白质后沉淀，球蛋白的分子量20～30万，而白蛋白的分子量只有69000，所以50%饱和度硫酸铵沉淀的是球蛋白，而白蛋白则留在上清液中。
（三）用33%饱和度硫酸铵提取血清中的γ球蛋白当血清中饱和硫酸铵为50%饱和度时，沉淀三次，仍含有大量的α、β球蛋白及极少量的白蛋白，当硫酸铵饱和度由50%减少到33～35%时，沉淀蛋白质中的α、β球蛋白和白蛋白的含量相应逐渐减少，而γ球蛋白的纯度逐渐提高，第三次沉淀物只含有少量的α、β球蛋白及白蛋白。
盐析法粗提Ig实验讨论
盐析法粗提Ig实验讨论
1、盐析法优点是盐析法简单方便，可用于蛋白质抗原的粗提、丙种球蛋白的提取、蛋白质的浓缩等。
缺点是盐析法提纯的抗原浓度不高，只用于抗原的初步纯化。
2、有机溶剂沉淀法
优点是是分辨能力比盐析法高，溶剂容易除去且可回收，沉淀的蛋白质不需要脱盐处理，缺点是有机溶剂易使蛋白质或酶变性，常采用降低温度的方法进行有效控制，而且有机溶剂使用量大，溶剂的使用及回收；储存都比较困难或麻烦。
从细胞中提取出来的生物大分子是不纯净的，必须进一步分离纯化才能获得纯品。
在生物大分子制备工作中，分离纯化是比较复杂和重要的一个环节。
对于异类的物质，如提纯蛋白质和酶时混杂着核酸，提纯核酸时混杂着蛋白质或多糖，一般可用专一性酶水解、有机溶剂抽提、选择性分部沉淀等方法处理，小分子物质常在整个制备过程中多次液相与固相互相转化被分离或最后用透析方法除去。
而对同类物质，如酶和杂蛋白，RNA和DNA以及不同结构的蛋白质、酶、核酸之间的分离，情况则复杂得多，主要应用的方法有盐析法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、吸附法、结晶法、电泳法、超速离心法、柱层析法等。
其中盐析法、等电点法、结晶法用于蛋白、酶的提纯较多；有机溶剂抽提和沉淀用于核酸提纯较多；柱层析法、梯度离心法在蛋白质和核酸的提纯工作中应用均十分广泛。
血浆IgG的分离_纯化及鉴定实验报告
血浆IgG的分离，纯化及鉴定实验报告一、实验目的掌握盐析法的原理及盐析法分离制备血浆IgG的基本过程。
二、实验原理1.血浆IgG是免疫球蛋白（简称Ig）的主要成分之一，相对分子质量为15~16万。
要从身姿中分离出血浆IgG，首先要尽可能除去其他蛋白质成分的粗分离程序，使血浆IgG在样品中比例大为增高，然后再纯化而获得血浆IgG。
2.盐析法是粗分离蛋白质的重要方法，许多蛋白质在纯水或低盐溶液中溶液度低，若稍加一些无机盐则溶解度增加，这种现象为盐溶。
而当盐浓度继续继续增加到某一浓度时，蛋白质又变得不溶而自动析出，这种现象称为盐析。
这现象的原理大致是由于蛋白质带有羟基解离的负电荷或氨基解离的正电荷，其极性基团使分子间相互排斥，同时与水分子形成水膜，这些因素保证了蛋白质不溶于水，当加入少量盐后，破坏水膜结构，增多了蛋白质的极性基团，蛋白质的溶解度增大，出现盐溶的现象，另一方面加入的盐离子中和蛋白质表面电荷，蛋白质分子相互蛋白质混合溶液中的各个成分分步盐析出来，达到分离目的蛋白质。
3.用硫酸铵分级盐析蛋白质时，盐析出某种蛋白质成分所需的硫酸铵浓度一般饱和度来表示。
实际工作中将饱和硫酸铵溶液的饱和度为100%或1。
盐析某种蛋白质成分所需的硫酸铵数量折算成100%或1的百分之几。
即称为该蛋白质盐析的饱和度。
4.饱和度可以用饱和硫酸铵溶液法计算：在蛋白质要求达到50%以下时采用：V＝V0*（C2－C1）/（1－C2）V0－－蛋白质溶液的原始体积C1－－所要达到硫酸铵饱和度C2－－原来溶液的硫酸铵饱和度三、试剂与仪器饱和硫酸铵溶液，0.01mol/l,PH7.0的磷酸盐缓冲溶液，0.0175mol/L,PH6.7的磷酸盐缓冲溶液四、实验步骤1.取1支离心管，向其中加入5ml血浆和5ml0.01mol/l,PH7.0的磷酸盐缓冲溶液，混合。
向其中加入2.5ml饱和硫酸铵溶液，使其饱和度为20%（加入过滴加边搅拌），加完后，应在4度放置15min，使之充分盐析，然后以3000r/min离心10min，弃去沉淀（沉淀为纤维蛋白）2.量取10ml清液体积，置于另一离心管，用滴管加入6ml饱和硫酸铵溶液，使其饱和度达到50%，加完后，4度放置15min，以3000r/min离心10min，弃去溶液，留下沉淀。
igg分离纯化和鉴定
igg分离纯化和鉴定分离纯化和鉴定是在生物技术领域中常用的实验技术，用于提取目标物质并确定其纯度和特性。
下面以IGG为例，介绍分离纯化和鉴定的步骤和方法。
分离纯化IGG的第一步是蛋白质提取。
可以选择适当的提取缓冲液，将IGG所在的样品（如血浆或细胞培养液）与提取缓冲液进行适当的混合，使细胞或组织中的蛋白质释放出来。
提取后，可以使用离心等方法去除杂质。
将混合物进行离心，使得IGG和其他蛋白质分离。
离心后，可以将上清液取出，其中含有较高纯度的IGG。
为了进一步提高IGG的纯度，可以使用亲和层析等技术。
亲和层析是利用IGG与特定配体之间的亲和力进行分离的方法。
可以将配体固定在柱子上，然后将提取的上清液通过柱子，IGG会与配体结合，其他蛋白质则流过。
最后，通过改变柱子的条件，如改变pH值或添加特定溶剂，可以使IGG与配体解离，从而获得纯净的IGG。
获得纯净的IGG后，需要对其进行鉴定。
常用的鉴定方法包括SDS-PAGE和Western blotting。
SDS-PAGE可以将蛋白质按照分子量分离出来，可以通过与已知分子量的标准蛋白进行比较，确定IGG的分子量。
Western blotting则可以通过与特异性抗体的结合来确认IGG的存在。
除了分子量和存在性，还可以使用其他方法对IGG进行鉴定，如免疫荧光和ELISA等。
免疫荧光可以通过特异性抗体与IGG结合后的荧光信号来检测IGG的存在。
ELISA可以通过与特异性抗体的结合来定量IGG的含量。
总的来说，分离纯化和鉴定IGG是一个复杂的过程，需要使用多种技术和方法。
通过合理的实验设计和操作，可以获得高纯度的IGG，并对其进行准确的鉴定。
这些技术的应用不仅可以用于IGG的分离纯化和鉴定，还可以应用于其他蛋白质的研究和应用中。
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血清IgG的分离制备—盐析法
原理
IgG是免疫球蛋白（Immunoglobulin，简称IgG）的主要成分之一，分子量约为15万~16万，沉降生活费数约为7s。
IgG是动物和人体血浆的重要成分之一。
血浆蛋白质的成分多达70余种，要从血浆中分离出IgG，首先要进行尽可能除去其他蛋白质成分的粗分离程序，使IgG 在样品中比例大为增高，然后再纯化而获得IgG。
盐析法是粗分离蛋白质的重要方法之一。
许多蛋白质在纯水或低盐溶液中溶解度较低，若稍加一些无机盐则溶解度增加，这种现象称为“盐溶”（Salting in）。
而当盐浓度继续增加到某一浓度时，蛋白质又变得不深而自动析出，这种现象称为“盐析‘（Salting out）。
这些现象的原理大致是由于蛋白质是亲水胶体，带有羧基解离的负电荷或氨基解离的正电荷，其极性基团使分子间相互排斥，同时与水分子形成水膜，这些因素保证蛋白质形成溶于水的溶胶状态。
当加入少量盐时，增多了蛋白质分子上的极性基团，因而增大了蛋白质在水中溶解度，出现“盐溶”现象。
但当盐浓度增加到一定浓度时，一方面大量的水同盐分子结合，使得蛋白质没有足够的水维持溶解状态，破坏了维持蛋白质亲水胶的水膜，容易沉淀出来；另一方面加入的盐离子中和了蛋白质分子相互磁撞时即发生相互聚集沉淀出来，这样就出现了“盐析”现象。
由于各种蛋白质“盐析”出来所需的盐浓度也各异，盐析所需的最小盐量称做盐析浓度。
盐析法就是通过控制盐的浓度，使蛋白质混合溶液中的各个成分分步“盐析”出来，达到分离目的蛋白质。
盐析法是1878年Hammarster首次使用的，他用硫酸镁成功地将血清蛋白分成为清蛋白、球蛋白两部分。
自那以后曾使用过硫酸钠、氯化钠、磷酸钠和硫酸铵等中性盐来盐析蛋白质，其中运用最广的是硫酸铵。
因为硫酸铵有许多其他盐所不具备的优点，如在水中化学性质稳定；溶解度大，25℃时能达到4.1mol/L的浓度；溶解度的温度系数变化较小，在0~30℃范围内溶解度变化不大，如25℃时饱和溶解度为4.12mol/L，即767g/L，0℃时饱和溶解度为3.9mol/L，即676g/L。
而且硫酸铵价廉易得，分段效果比其他盐好，性质温和，即使浓度很高时也不会影响蛋白质的生物学活性。
因此，现在所指的盐析法实际上多为硫酸铵盐析法。
用硫酸铵分级盐析蛋白质时，盐析出某种蛋白质成分所需的硫酸铵浓度一般以饱和度来表示。
实际工作中将饱和硫酸铵溶液的饱和度定为100%或1。
盐析某种蛋白质成分所需的硫酸铵数量折算成100%或1饱和度的百分之几，即秒为该蛋白盐析的饱和度。
饱和度可以根据情况用下述两种方法计算。
1．饱和硫酸铵溶液法在蛋白质溶液的总体不大，要求达到饱和度在50%以下时，可选用此方法。
在已知盐析出某各蛋白质成分所要过到饱和度时，可按下列公式计算出应加入饱和硫酸铵溶液的数量：
式中：V0——蛋白质溶液的原始体积；
C2——所要达到硫酸铵饱和度；
C1——原来溶液的硫酸铵饱和度；
V——应加入饱和硫酸铵溶液的体积。
将计算所得体积的饱和硫酸铵溶液加入到混合蛋白质溶液中，即可达到盐析的目的。
严格讲，混合两不同溶液时，混合后的总体积并不等于混合前两种溶液体积之和，而上式中是按相等于计算的，所以会产生误差。
但实验证明所造成的误差一般小于20%，故可忽略不计。
2．固体硫酸铵法所需达到的饱和度较高，而蛋白质溶液的体积又不能再过分增大时，采
用直接加入固体硫酸铵的方法。
欲达到某到饱和度可按下列公式计算出应加入固体硫酸铵的数量：
X是将1L饱和度为C1溶液提高到饱和度为C2时，需要加入固体硫酸铵的重量（g）。
G和A 为常数，数值与温度有关。
现在已将达到各种饱和度所需固体硫酸铵的数量列成表，使用时不需计算可直接从表中查出。
市售固体硫酸铵中一般残留有硫酸，所以制备的饱和硫酸铵溶液的PH常在4.5 ~5.5之间，作用之前应该用氢氧化铵调节，使其PH为7。
用固体硫酸铵盐析时，蛋白质应溶解于具有一定缓冲能力的溶液中，并且在加入硫酸铵中还含有一些重金属离子，用量大时易使蛋白质变性，在这种情况下可加入一些EDTA等螯合剂以螯合这些金属离子。
硫酸铵盐析法可使蛋白质的纯度提高约5倍，而且可以除去DNA，RNA等。
但盐析后的蛋白质中仍含有一些杂蛋白，所以盐析产生的产品为粗分离产品需要进一步纯化。
本实验中利用离子交换层析法纯化。
在离子交换层析之前，由于盐析所得的蛋白质中含有大量硫酸铵，将影响离子交换层析。
所以，在层析之前需要“脱盐”。
“脱盐”有凝胶过滤法和透析法，本实验将采用凝胶过滤法。
试剂和器材
（1）饱和硫酸铵溶液：取化学纯（NH4）2SO4800g，加蒸馏水1000ml，不断搅拌下加热至50~60℃，并保持数分钟，趁热过滤，滤液在室温中过夜，有结晶析出，即达到100%饱和度，作用时用浓NH4OH调至PH7.0。
（2）0.01mol/L，PH7.0，磷酸盐缓冲溶液：取0.2mol/L Na2HPO4溶液61.0ml，0.2 mol/L Na2HPO4溶液39.0ml，混合，用酸度计检查PH应为7.0。
取该混合液50ml，加入7.5gNaCl，用蒸馏水1000ml。
（3）0.0175mol/L，PH.7，磷酸盐缓冲溶液：取0.2 mol/L Na2HPO4溶液43.5ml与0.2 mol/L Na2HPO4溶液56.5ml相混合，用酸度计检查PH应为6.7。
取该混合液87.5ml，用蒸馏水稀释至1000ml。
操作方法
（1）在1支离心管中加入5ml血清和5ml 0.01mol/L，PH7.0 磷酸盐缓冲液，混匀。
用皮头滴管吸取饱和硫酸铵溶液，边滴加边搅拌于血浆溶液中，使溶液的最终饱和度为20%（应加入饱和硫酸铵溶液多少毫升？），用滴管边加边搅拌，是为防止饱和硫酸铵1次性加入或搅拌不均匀造成局部过饱和的现象，使盐析达不到预期的饱和度，得不到目的蛋白质。
搅拌时不要过急以免产生过多泡沫，致使蛋白质变性。
加完后应在4℃放置15min，使之充分盐析（蛋白质样品量大时，应放置过夜）。
然后以3000r/min离心10min。
弃去沉淀（沉淀为纤维蛋白原），在上清液中为清蛋白、球蛋白。
（2）量取上清液的体积，置于另一离心管中，用滴管继续在上清液中滴加饱和硫酸铵溶液，使溶液的饱和度达到50%（应加饱和硫酸铵溶液多少毫升？）。
加完后在4℃放15min，以3000r/min离心10min，清蛋白在上清液中，沉淀为球蛋白。
弃去上清液，留下沉淀部分。
（3）将所得的沉淀再溶于5ml0.01mol/L，PH7.0磷酸盐缓冲液中。
滴加饱和硫酸铵溶液，使溶液的饱和度达35%（应加入饱和硫酸铵溶液多少毫升？）。
加完后4℃放置20min，以3000r/min离心15min，(，(球蛋白在上清液中，沉淀为IgG。
弃去上清液，即获得粗制的IgG 沉淀。
为了进一步化，操作（3）可得1~2次。
将获得的粗IgG沉淀溶解于2ml0.0175mol/L，PH6.7磷酸盐缓冲液中备用。