蛋白质一级结构的测定
蛋白质一级结构测定
氨基酸与肽的定量组成测定
定量组成测定，第一步是将蛋白质水解 为基组成氨基酸。 蛋白质的水解方法有： 1、酸水解法：用6MHCl于100~120℃下在真 空的安瓿瓶内进行，水解10~24小时
特点： （1）所得的氨基酸不消旋；但色氨酸全部被破坏。 （2）天冬酰胺和谷氨酰胺的酰胺基被水解下来而转 变为相应的氨基酸，酰胺基的总量由产生的氨算出。
2013年11月12日星期二
1
蛋白质的一级结构是指蛋白质分子中 氨基酸的组成、排列顺序连接方式和 二硫键的位置。 在生物化学与分子生物学中不少问题 都面临着需要知道蛋白质一级结构的 情况。如研究蛋白质的结构与功能的 关系、酶的结构与功能的关系、一级 结构与高级结构的关系等。因此，只 有把一级结构研究清楚之后，我们才 能研究生命过程中的许多复杂问题。
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（2）三价铁显色法： 含有色氨酸的样品，与铁离子的醋 酸溶液混合，加入浓硫酸，振荡之后呈 玫瑰红色，在545nm比色测定。 此法测定简便、快速，线性关系较 好。但反应混合物中的含水量对显色有 一定影响。因此，不如对-二甲基氨基 苯甲醛法使用广泛。
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氨 基 端 的 分 析
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丹磺酰氯（DNS-Cl）法：Harytley 等1956年报告了丹磺酰氯与氨基酸、肽 或蛋白质的氨基反应产生黄色的荧光， 由此产生了测定N末端的新方法，称 DNS法。 本法测定N末端的原理与DNP法有 相似之处。但比DNP法的灵敏度提高了 100倍，使用更为广泛。
对氯汞苯甲酸与巯基反应， 形成巯基的对氯汞苯甲酸 衍生物（PCMB）。PCMB 最大吸收在233nm摩尔消光 值为1.96×104。与巯基形 成硫醇盐以后，增加到2.2 ×104从图中可以看出在 250nm处差值最大，这个差 值与参与反应的试剂量有 直接关系。测定时，用含 巯基化合物支滴定固定量 的汞试剂，直至吸收差值 不再增加为止，根据汞试 剂的量可以计算出巯基数 量。由于测定是在蛋白质 的吸收范围内进行，因此 必须作蛋白质含量对吸收 36 影响的校正。
第三章蛋白质一级结构的测定
不带电荷极性R基团氨基酸
O N HH2＋ 3N CH C CH2 CH2 C NH2 O OH O－
蛋白质中20种常见氨基酸的结构
－按R基团的极性分类
天冬氨酸 Aspartate
带负电荷氨基酸（酸性氨基酸）
O H2N H3N＋ CH C CH2 C OH O
O－ OH
-氨基丁二酸
蛋白质中20种常见氨基酸的结构
-氨基--羟基丁酸
蛋白质中20种常见氨基酸的结构
－按R基团的极性分类
甘氨酸 Glycine 丝氨酸 Serine 苏氨酸 Threonine 半胱氨酸 Cysteine
不带电荷极性R基团氨基酸
O ‖ HH2＋ O－ 3N N－CH－C－OH │ CH2 │ SH
-氨基--巯基丙酸
蛋白质中20种常见氨基酸的结构
包括以下几方面内容： ①多肽链的数目； ②每条多肽链中氨基 酸的种类、残基数目和 排列次序； ③链内或链间二硫键 的位置和数目。
蛋白质一级结构测定的意义
①是推测蛋白质高级结构的分子依据
②是理解蛋白质功能的分子基础
③是阐明遗传疾病发生机理的分子手段
④是研究生物进化的分子佐证
测定的基本战略和步骤
特殊氨基酸的测定
蛋白质中氨基酸组成的表示方法
蛋白质营养价值的评价
1.蛋白质中常见氨基酸的组成及其结构
组成蛋白质的常见20种氨基酸中除脯氨酸外，均为氨基酸，除甘氨酸外都是L-型。
不变部分
可变部分
2. 蛋白质中20种常见氨基酸的结构
－按R基团的极性分类
丙氨酸
Alanine
非极性R基团氨基酸
对样品纯度的要求 对蛋白质分子量的测定
蛋白质一级结构测序解析
蛋白质顺 序测定基 本方法路 线
纯蛋白质
二硫键拆开
末端氨基酸测定 专一性裂解
将肽段分离并测出顺序
将肽段顺序进行叠联以确定完整的顺序
测定一级结构的基本方法
基本步骤： (1) 测定末端氨基酸数目，确定蛋白质分子是由几条 肽链构成的； (2) 拆分蛋白质分子的多肽链，断开多肽链内二硫键 并分离出每条肽链。 (3)将肽链完全水解，测定每条多肽链的氨基酸组成 (4)鉴定多肽链N－末端、C－末端氨基酸残基 (5)至少用两种方法将多肽链水解成较小的片段； (6)分离并测定各肽段的氨基酸序列； (7)片段重叠法重建完整多肽链一级结构； (8)确定半胱氨酸残基间形成二硫键交联桥的位置。
胰岛素
-巯基乙醇
碘乙酸
尿素和盐酸胍与蛋白质的可能作用方式： a.与肽链竞争氢键 b.增加非极性侧链在 水中的溶解度
（NH）
脲或胍 脲或胍
（四）氨基酸组成的分析
氨基酸分析仪进行测 定，测定每条多肽链 的AA组成，并计算出 AA成分的分子比。
（五）裂解多肽链成较小的片段
酶解法：如胰蛋白酶
胰凝乳蛋白酶 化学法：如溴化氰法 羟胺法
二硫键位置的确定
+
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ第 二 向
a b
-
pH6.5 图中a、b两个斑点是 由一个二硫键断裂 产生的肽段
+
第一向
-
Brown和Hartlay对角线电泳图解
（九）蛋白质测序举例
• 胰岛素测序自学
胰岛素的分子量为5734道尔顿，由51个氨基酸组成。
含A、B两条链，（A链：21肽 ，B链：30肽）。 A链和B链之间由两个链间二硫键（A7-B7,A20B19)连接，A链本身第6位和第11位的2个Cys残基之 间形成一个链内二硫键。
测蛋白质一级结构的方法
测蛋白质一级结构的方法
测定蛋白质的一级结构通常使用以下方法：
1. 氨基酸分析：通过氨基酸分析确定蛋白质中各种氨基酸的种类和数量，从而推断出其一级结构。
2. 胰蛋白酶消化法：使用胰蛋白酶等蛋白酶将蛋白质水解为小片段，并通过HPLC、毛细管电泳等技术分离、测序和鉴定这些片段，从而推断蛋白质的一级结构。
3. 质谱法：利用质谱仪测定蛋白质水解片段的质量，结合数据库比对和分析，推断蛋白质的氨基酸序列，从而确定其一级结构。
4. 二硫键分析：通过还原剂将蛋白质中的二硫键还原为单硫键后，再进行分析、测定二硫键位置等信息，推断蛋白质的一级结构。
这些方法在实验室中常常结合使用，以确定蛋白质的完整一级结构信息。
第三章 蛋白质一级结构及测定
③Cleland试剂的还原作用
Cleland′s指出二硫赤苏糖醇(dithioerythriotol)及二 硫苏糖醇(dithiothriotol)在氧化还原能力上是比较强的试 剂，只要0.01摩尔就能使蛋白质的-S-S-还原，反应基本与 疏基乙醇相似，且在许多球蛋白反应中，可以不用变性剂。
还原蛋白不稳定，SH基极易氧化重新生成-S-S-键。稳定 SH基的方法可用烷基化试剂使SH基转变为稳定的硫醚衍生 物。
它能选择性 地切割由甲 硫氨酸的羧 基所形成的 肽键
R1 O + HO -CH-C-N-CH-C=NH-CH-C~ 2 Br O H2C O CH2 + CH2-S-C N ¼»ÁÇË ×ùòèá R H O H 2O +-CH-C-N-CH-C O O H2C-CH2
R
H
R1 O H2N-CH-C~ C¶ ë ¶ NÄ ¶ ËÄÎ ©Ë
R1 R2 Rh H2N-CHCO~NH-CHCO~NH-CHCOOH R1 R2 õë £Â õë £Â £±¼È³Ìõ뻺Σ ¨½×©éá£Â¯Ïï© Î Ë NH2NH2 Þ® o 100 C 5~10h Rh
H2N-CH-CONHNH2+H2N CH CONHNH2+....+H2N-CH COOH
OH－ pH9 —
苯异硫氰酸酯 ( PITC ) S
=
②与Edman试剂反应的 产物为：苯乙内酰硫脲氨 基酸（PTH-氨基酸） ③PTH-氨基酸可用乙 酸乙酯抽提，再用纸层析 或薄层层析鉴定
S C
－NH－C－NHCHCO－NHCHCO —
苯氨基硫甲酰多肽 （氨基酸）
S－C C N H － —
R H+ O
测定蛋白质一级结构的方法
测定蛋白质一级结构的方法哇塞，蛋白质的一级结构可是非常重要的呀！那要怎么去测定它呢？
测定蛋白质一级结构的方法主要有以下这些哦。
首先是通过氨基酸组成分析，要把蛋白质水解成氨基酸，然后进行定量和定性分析，这就像拼图前要先知道有哪些拼图块一样。
这里面要注意水解的条件要控制好呀，不然会影响结果的准确性呢。
还有呀，不同的分析方法也要选对，不然也会出问题哟！
在这个过程中，安全性那可是相当重要的呀！得小心使用那些化学试剂，别一不小心伤到自己啦。
稳定性也得保证呀，每一步操作都要稳稳当当的，可不能马虎。
那它都有哪些应用场景和优势呢？这可多啦！比如在生物制药领域，了解蛋白质的一级结构可以帮助开发更有效的药物呢，就像有了精确的地图才能找到宝藏一样。
而且这种方法准确性高呀，能够给我们提供非常可靠的信息呢。
我给你说个实际案例吧。
比如说研究某种疾病相关的蛋白质，通过测定它的一级结构，科学家们就能更好地理解这个蛋白质的功能和作用机制，说不定就能找到治疗这种疾病的新方法呢！你说厉害不厉害？
总之呀，测定蛋白质一级结构的方法真的是超级重要的呀，它就像一把钥匙，能打开蛋白质奥秘的大门，让我们更好地了解生命的奥秘呢！。
测定蛋白质一级结构的方法进展
测定蛋白质一级结构的方法进展蛋白质的一级结构，指的是蛋白质分子中氨基酸的序列，其测定包括蛋白质分子多肽链 的数目和多肽链中的氨基酸的精确序列两方面。
蛋白质的氨基酸序列测定对了解其结构与功 能以及生物进化、遗传变异的关系极有意义，对生命科学的发展更是起到了推进作用，而当 今蛋白质组的研究更需其支持。
测定蛋白质一级结构并作出肽谱的重要性在于：①可用于分 子克隆中寡核苷酸探针的制备；②为cDNA推导的氨基酸序列提供证据；③为重组DNA产生 的蛋白质作指纹分析;④蛋白质的完整结构鉴定;⑤确定翻译后修饰的位点;⑥决定簇的定位;⑦二硫键的确定。
蛋白质测序的基本思路是先将蛋白质用化学法或酶法水解成肽段， 再对肽段进行氨基酸 序列测定，其中化学法裂解的肽段一般较大，适于自动序列分析仪测定；酶法的优点是专一 性强，降解后肽段易纯化，产率较高，副反应少。
得到纯肽后需对肽段进行氨基酸测序，测 定方法主要是化学法，酶法也有一定意义。
化学法以Edman降解法最为经典，它对所有氨基 酸残基具有的普适性和近乎定量的高产率，使其成为近50年来N端顺序分析技术的基础。
近 年来,在蛋白质序列测定方面出现了一些新的技术手段,现对这些新技术作一些简单的介绍。
一、液相色谱（LC）HPLC是肽谱分析常用的工具,常用粒度为5-10μm的大孔烷基化硅胶吸附剂为色谱柱的 填料,通过增加有机溶剂的浓度进行梯度洗脱,其发展目标是加快分析速度和提高灵敏度.对 小肽的分离可选用小孔径C18载体，粒度5-10μm。
1、微柱高效液相色谱普通柱通常为4.6mmI.D.,而微柱液相色谱柱直径<2.1mm,它是由科学家Ishii首次提出 的，现在已成为Edman降解自动序列分析仪分离低微克量蛋白质和肽的基础。
它一般重现良 好，且用样量少，并能快速地进行蛋白质分析。
其流速通常为10-200μl/min,出峰时间短, 峰型尖窄,从而大大提高了检测灵敏度,可达1pmol;回收率高,因为微柱的载体少,非专一性 吸附少。
蛋白质一级结构测定讲课文档
第一页，共143页。
第四章 蛋白质一级结构测定
第一节 蛋白质序列测定的基本策略和步骤
第二节 蛋白质和肽的氨基酸组成分析
第三节 末端氨基酸的测定
第四节 肽链的专一性水解和肽段的分离纯化
第五节 肽段的序列测定
第六节 由已知序列肽段建立蛋白质一级结构
第七节 蛋白质一级结构研究进展
第二页，共143页。
Gln的总量，或者用不水解酰胺的方法水解肽键后直 接测定。
第三十八页，共143页。
盐酸水解时，Met易被氧化转变为甲硫 氨酸砜，损失约20％ 左右，可以用这一数 值进行校正，也可用保护剂（在盐酸中加入 0.l～1.0％巯基乙酸）来减少水解中 Met 的损失; Tyr 的破坏率约为 10％，如水解 时加入 0.l～1.0％ 巯基乙酸和 0.05～0.l ％苯酚，能使Tyr和 Ser回收率明显提高， 这时 Met也能免遭破坏。
分子筛效应
电荷效应
第十三页，共143页。
（3）双向电泳（two-dimensional gel electrophoresis）
双向电泳 = IEF + SDS-PAGE 第一向：根据电荷差异用 IEF 分离
第二向：根据分子量差异用 SDS- PAGE 分离
第十四页，共143页。
IEF
SDS-PAGE
第十五页，共143页。
每一个点代表一条多肽链，每一条多肽链有自己的等电点 和分子量。多肽链可以用染色法或放射自显影进行检测
第十六页，共143页。
（4）其它方法
• 离子交换层析（根据物质所带电荷进行分离）
• 亲和层析（利用蛋白质与与其他分子的结合特异性）
• Ｎ－末端氨基酸测定 • 纯化至恒定比活 • 肽（酶）谱分析 • Western 印迹法（由蛋白质的SDS-PAGE、电转及杂交几部
蛋白质一级结构的测定方法
蛋白质一级结构的测定1.测定蛋白质分子中多肽链的数目：N-末端和C-末端残基的摩尔数和蛋白质的相对分子质量2.拆分蛋白质分子的多肽链非共价相互作用缔合的寡聚蛋白：用变性剂尿素盐酸胍共价二硫桥：氧化剂或还原剂3.断开多肽链内的二硫桥过甲酸氧化法常用试剂过甲酸巯基化合物还原法：过量的巯基乙醇处理，ph8-9室温，系统中放尿素和盐酸胍，烷基化试剂保护常用试剂β巯基乙醇，巯基乙酸4.分析每一多肽链的氨基酸组成：完全水解酸水解：常用hcl,水解后除去碱水解：用于测定色氨酸含量。
很多氨基酸遭到破坏，色氨酸定量回收。
5.鉴定多肽链的N-末端和C-末端N-末端分析：①二硝基氟苯DNFB②丹磺酰氯DNS：强烈荧光，灵敏度高③苯异硫氰酸酯PITC:多肽或蛋白质的末端氨基和氨基酸的α氨基一样与PITC反应生成PTC-多肽，在酸性有机溶剂中加热，N-末端的PTC-氨基酸发生环化④氨肽酶：肽链外切酶/外肽酶，从多肽链的N-末端逐个向里切。
常用亮氨酸氨肽酶（水解以Leu为N-末端的肽链速度为最大）C-末端分析：①肼解法：蛋白质多肽与无水肼加热发生肼解。
反应中除C-末端氨基酸以游离形式存在外，其他氨基酸都转变为相应的氨基酸酰肼化物。
肼解中，Gln,Asn,Cys被破坏不易测出，C末端的Arg转变成鸟氨酸②还原法：硼氢化锂还原成α-氨基醇③羧肽酶法：肽链外切酶，专一地从肽链C末端逐个降解。
羧肽酶A能释放除Pro,Arg和Lys之外的所有C-末端残基的肽键，B只能释放精氨酸和赖氨酸，AB的混合物能释放除Pro 外任一C末端残基的肽键。
Y可以作用于任何一个C末端残基6.裂解多肽链成较小的片段：用几种不同的断裂方法将每条多肽样品降解成几套①酶裂解法：肽链内切酶。
胰蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，胃蛋白酶胰蛋白酶只断裂赖氨酸或精氨酸残基的羧基参与形成的肽键胰凝乳蛋白酶能断裂赖氨酸、酪氨酸、甘氨酸残基的羧基参与形成的肽键②化学裂解法：测定相对分子质量大的蛋白质序列。
蛋白质分子基础5-蛋白质一级结构测定
C末端分析
a)肼解法 b)还原法：硼氢化锂还原剂 c)羧肽酶法
还原法
肽链C末端AA ↓硼氢化锂 α－氨基醇 ↓水解 C末端氨基酸+ α－氨基醇 ↓ 色谱法鉴定
羧肽酶法
羧肽酶法：
最有效，最常用的测C端殘基方法 性质：肽链外切酶，专一地从肽链的C端逐个降 解，释放出游离AA。
巯基含量测定
DTNB法(5.5’-二硫代双(-2-硝基苯甲酸)
Protein-Ｓ- +R-S-S-R(DTNB) Protein-S-S-R+RSProtein-SH Protein-S-S-Protein+RS-(CNT) R
-
-COOH -NO2
反应产物(CNT)在412nm处可产生光吸收， 根据光吸收值可以相应地计算出巯基的含 量。
优点:Trp在水解中不受破坏。
蛋白质的水解
磺酸水解
4mol/L 甲基氨酸 ( 含 0.2%β- 吲哚乙胺 ) 色氨酸可 回收90%以上,Ser与Thr的回收接近定量值。 用二硫苏糖醇还原胱氨酸，再用过量的连四硫酸 钠氧化，得到S-磺基半胱氨酸再测定。 缺点: 水解环境需中性，条件苛刻。 水解液中含较多碳水化合物时，色氨酸容易被破 坏。 优点:中性水解液可以直接上机，色氨酸稳定。
蛋白质化学
蛋白质一级结构的测定
序列测定的基本方法学
将肽段用不同方法专一性地切断,将得到的 肽段分离纯化之后,分别测出各自的序列。 再将不同方法得到的序列进行比对，就可以 得到肽链的一级结构。
序列测定一般步骤
纯度要求:纯度在97%以上。
双向电泳；凝胶电泳；N-末端测定；纯化至恒定酶活； 肽谱分析。
蛋白质一年级结构的测定方法
蛋白质一年级结构的测定方法集团企业公司编码：（LL3698-KKI1269-TM2483-LUI12689-ITT289-蛋白质一级结构的测定1.测定蛋白质分子中多肽链的数目：N-末端和C-末端残基的摩尔数和蛋白质的相对分子质量2.拆分蛋白质分子的多肽链非共价相互作用缔合的寡聚蛋白：用变性剂尿素盐酸胍共价二硫桥：氧化剂或还原剂3.断开多肽链内的二硫桥过甲酸氧化法常用试剂过甲酸巯基化合物还原法：过量的巯基乙醇处理，ph8-9室温，系统中放尿素和盐酸胍，烷基化试剂保护常用试剂β巯基乙醇，巯基乙酸4.分析每一多肽链的氨基酸组成：完全水解酸水解：常用hcl,水解后除去碱水解：用于测定色氨酸含量。
很多氨基酸遭到破坏，色氨酸定量回收。
5.鉴定多肽链的N-末端和C-末端N-末端分析：①二硝基氟苯DNFB②丹磺酰氯DNS：强烈荧光，灵敏度高③苯异硫氰酸酯PITC:多肽或蛋白质的末端氨基和氨基酸的α氨基一样与PITC反应生成PTC-多肽，在酸性有机溶剂中加热，N-末端的PTC-氨基酸发生环化④氨肽酶：肽链外切酶/外肽酶，从多肽链的N-末端逐个向里切。
常用亮氨酸氨肽酶（水解以Leu为N-末端的肽链速度为最大）C-末端分析：①肼解法：蛋白质多肽与无水肼加热发生肼解。
反应中除C-末端氨基酸以游离形式存在外，其他氨基酸都转变为相应的氨基酸酰肼化物。
肼解中，Gln,Asn,Cys被破坏不易测出，C末端的Arg转变成鸟氨酸②还原法：硼氢化锂还原成α-氨基醇③羧肽酶法：肽链外切酶，专一地从肽链C末端逐个降解。
羧肽酶A能释放除Pro,Arg和Lys之外的所有C-末端残基的肽键，B只能释放精氨酸和赖氨酸，AB的混合物能释放除Pro外任一C末端残基的肽键。
Y可以作用于任何一个C末端残基6.裂解多肽链成较小的片段：用几种不同的断裂方法将每条多肽样品降解成几套①酶裂解法：肽链内切酶。
胰蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，胃蛋白酶胰蛋白酶只断裂赖氨酸或精氨酸残基的羧基参与形成的肽键胰凝乳蛋白酶能断裂赖氨酸、酪氨酸、甘氨酸残基的羧基参与形成的肽键②化学裂解法：测定相对分子质量大的蛋白质序列。
蛋白质一级结构测定的步骤
蛋白质一级结构测定的步骤
蛋白质一级结构测定是指通过分子生物学手段，对蛋白质分子的原子结构进行详细分析并揭示其各个部分之间的相互作用及其在蛋白质结构中的位置和结构的研究。
它是确定蛋白质的结构的基本步骤，也是蛋白质结构分析的重要环节。
蛋白质一级结构测定的步骤包括：
第一步：样品准备。
首先要准备一定量的蛋白样品，蛋白样品的质量越好，结果越准确。
常用的样品准备方法有：水解、沉淀、纯化和提取。
第二步：结构图谱分析。
在样品准备好之后，就可以进行结构图谱分析，以检测蛋白质的一级结构。
主要的结构图谱分析方法有：X射线衍射、磁共振波谱、紫外光谱和电泳。
第三步：原子模型构建。
在结构图谱分析完成之后，就可以根据图谱分析的结果，构建蛋白质的原子模型，即把蛋白质中不同原子的位置及其之间的相互作用关系等信息还原到原子模型中。
第四步：模型精度评估。
当构建完原子模型之后，就可以对模型进行精度评估，也就是把原子模型与实际情况进行比较，看模型是否能够准确反映实际情况。
第五步：结构可视化。
在模型精度评估完成之后，就可以使用可视化软件将蛋白质的原子模型可视化，使得人们可以直观地观察蛋白质的原子结构。
第六步：结构分析和总结。
在蛋白质的原子模型可视化完成之后，就可以对蛋白质的原子结构进行分析，比如对模型中的原子以及原子之间的相互作用关系、结构偏移等进行分析，并对这一分析结果进行总结归纳，从而揭示蛋白质的一级结构。
以上就是蛋白质一级结构测定的六个步骤，在蛋白质结构分析中，蛋白质一级结构测定是最基础也是最重要的一步，只有把这一步做对了，才能够确保蛋白质的结构分析的准确性和可靠性。
蛋白质一级结构的测定方法
当年Sanger分析胰岛素用了整整十年的时间，今天
运用自动化仪器，分析一个分子量在10万左右的蛋
白质只需要几天，可见新技术的应用和发展对科学
发展起的促进作用，蛋白质一级结构测定方法的综
述及专著文献较多。
整理课件
7
三 测定前的准备工作
测序前的准备工作：
蛋白质的纯度鉴定 要求：纯度97%以上，均一。
紫色在 570nm比 色 茚三酮与 Pro生成 黄色产物， 在440nm 比色
整理课件
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层析
基于不同物质在流动相和固定相之间的分 配系数不同而将混合组分分离的技术。当 流动相(液体或气体)流经固定相(多孔的固 体或覆盖在固体支持物上的液体)时，各组 分沿固定相移动的速度不同而分离。能用 于微量样品的分析和大量样品的纯化制备。
测定蛋白质的分子量
鉴定方法：
估算氨基酸残基数，确定肽
⑴ 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 链数
(PAGE)要求一条带，双向电泳。 方法： SDS-PAGE，凝胶
⑵ DNS—Cl（二甲氨基萘磺 过滤法，沉降系数法
酰氯）法测N端氨基酸。
(3) 亲和层析
(4) western 印迹法等
整理课件
8
及测定的一般步骤
酸水解破坏了色氨酸、使谷酰胺和天冬酰胺转
变为相应的谷氨酸和天冬氨酸。为了分离效果好，
在洗脱过程中，使用不同pH和离子强度的洗脱液。
经氨基酸自动分析仪洗脱下来的氨基酸，按顺序
进行染色，由记录仪自动描绘出各种氨基酸的光
吸收图谱。
整理课件
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3）氨基酸组成分析 ②离子交换层析法
整理课件
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离子交换色谱利用被分离组分与固定相之间发生 离子交换的能力差异来实现分离。离子交换色谱 的固定相一般为离子交换树脂，树脂分子结构中 存在许多可以电离的活性中心，待分离组分中的 离子会与这些活性中心发生离子交换，形成离子 交换平衡，从而在流动相与固定相之间形成分配。 固定相的固有离子与待分离组分中的离子之间相 互争夺固定相中的离子交换中心，并随着流动相 的运动而运动，最终实现分离。
蛋白质一级结构的测定
其他裂解肽的方法：
A：部分酶分解法：0.1N HCl在110度或6N HCl 在37度水解，但特异性不强，因此对大片段和 肽均不适用； B：羟胺法：反应机理是通过羟胺作用，先形成 一个琥珀酰亚胺环状物然后导致肽键的裂解。 羟胺专一性的裂解Asn-Gly的肽链，产率可达 70%以上。但酸性条件下切割Asn-Pro； C： 稀酸切割Asp-Pro肽键：蛋白质中Asp-Pro键 对酸不稳定； D：Cleavage at Trp resides by oiodosobenzoine acid (亚碘酰基苯甲酸）产率： 70%-100%
多肽的专一性降解（specific cleavage of
大于20的多肽一般需要预先进行降解，尽管目 前的测序可以一次测定60-70氨基酸残基，但 由于氨基酸组成、纯度、产率等因素的影响这 种几率比较少。多肽的降解不外于化学法和酶 法俩种。 1 化学法（大片段）
A:Cyanogen bromide (CNBr) 它选择性的切断Met残 基的羧基侧肽链，将Met转化为高丝氨酸（Homoser) 和高丝氨酸内酯(Homoserine lactone)。 在氨基酸组成分析时高丝氨酸和高丝氨酸内酯相距甚 远。高丝氨酸在丝氨酸之后，而高丝氨酸内酯在组氨 酸之后。计算时可将高丝氨酸和高丝氨酸内酯相加， 计算甲硫氨酸的量。 the protein）
• 蛋白质高级结构研究需要一级结构的知识; 蛋白质的一级结构决定蛋白质的高级结构 如:牛胰核糖核酸酶的复性实验 基因工程中包涵体的问题 • 蛋白质一级结构与分子进化的关系; 细胞色素C是广泛存在于需氧生物线粒体呼吸链中 的起传替作用的一种蛋白质通过它可以绘出生物进 化树,一般在进化树位置相距越远,则氨基酸的顺序 差别越大. • 一级结构与遗传病(分子病); 镰刀状细胞贫血症中的血红蛋白(HbS),他仅是β -链 上第六号的Glu变为Val ，从而导致生物功能上的巨 大差异
蛋白质一级结构测序-1
Edman
H
O
O
氨
N C S HN CHC NHCHC
基
R1
R2
酸 顺 序
H
N C S: O
O
HN CH C NH CH C
H
N C S NH2
NH C O CH
O CH C R2
分
R1
R2
R1
析
N CS
O
NH 3+
ICH2CNH2 -OOC CHCH2 SCH2CNH2
NH3+
O
保 护 作用：这些反应可用于巯基的保护。
SS
S
S
S
S
胰岛素
SH
HSHO-CH2-CH2-SH
SH
SH
SH
SH
ICH2COOH SCH2C00HSCH2C00H
SCH2C00H SCH2C00H SCH2C00H SCH2C00H
蛋白质测定的详细步骤
A.测定蛋白质分子中多肽链的数目。
蛋 通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋
白 质
白质分子量之间的关系，即可确定多肽
一 链的数目。
级
结
构
的
测
定
B.多肽链的拆分。
由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须 蛋 先进行拆分。
白 质 一 级 结 构 的 测 定
B.多肽链的拆分。
蛋 几条多肽链借助非共价键连接在一起，
•
换)。 将所得的肽段利用Brown及Hartlay的
位 对角线电泳技术进行分离。
置 的 确
• 然后同其它方法分析的肽段进行比较， 确定二硫键的位置。
蛋白质一级结构测定详解
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本法的优点： （1）除去N末端氨基酸后剩下的肽链 部分仍是完整的，可以依照前法重复 测定新生的N末端氨基酸。
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天然蛋白质分子量的测定，对于蛋
白质一级结构的测定是十分重要的信息。 根据蛋白质的分子量和蛋白质分子中氨 基酸的平均分子量，可以大致估计蛋白 质分子中氨基酸组成的数目。
在蛋白质序列测定中，对分子量测 定的要求不高，误差小于10%即可以。
分子量的测定立法主要有：
SDS-凝胶电游泳法、超速离心法、
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丹磺酰氯（DNS-Cl）法双向层析指纹图
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异硫氰酸苯酯法：目前应用最广泛的 一种氨基末端的测定方法多肽或蛋白 质与PITC在pH≈9，40 ℃作用时形成 苯氨基硫甲酰多肽或蛋白质（简称 PTC多肽或蛋白质）后者与酸在有机 溶剂中反应后，代表N末端的PTC氨基 酸环化，生成苯乙内酰硫脲的衍生物 而从肽链上掉下来，此产物可用气液 色谱法进行鉴定。
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氨
基
酸
组
成
测
定
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氨
基
酸
自
动
分
析
仪
原
理
图 2020年10月2日星期五
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多肽链的末端分析
（氨基）端的测定 （1）2，4-二硝基氟苯法（DNP）
（2）丹磺酰氯（DNS-Cl）法（DNS）
（3）异硫氰酸苯酯（PITC）-Edman降解法
能研究生命过程中的许多复杂问题。
概述测定蛋白质一级结构的基本步骤
概述测定蛋白质一级结构的基本步骤蛋白质可是个神奇的东西呀！就像我们生活中的一个小秘密，要想揭开它的神秘面纱，了解它的一级结构，那可得一步步来。
首先呢，得把蛋白质从它所在的环境中分离出来，这就好比从一堆杂物中找出我们想要的宝贝。
然后，对它进行纯化，把那些杂质都去掉，让它变得纯净纯净的，就像把宝石打磨得亮晶晶的。
接下来，就是关键的一步啦，测定它的分子量。
这就好像要知道一个人的体重一样，得有个准数呀！可以用一些专门的方法，比如凝胶过滤或者质谱法啥的。
然后呢，把蛋白质切成小小的片段。
这就像是把一个大蛋糕切成小块，这样我们才能更好地研究它呀。
这一步可以用一些酶或者化学试剂来帮忙。
再之后呀，对这些小片段进行分析。
哎呀，就像我们仔细观察每一块小蛋糕，看看它们都有啥特点。
可以用各种方法，比如氨基酸分析呀，或者测序啥的。
最后呢，把这些小片段的信息整合起来，就像拼图一样，把它们拼成一个完整的画面。
这样，我们不就知道蛋白质的一级结构啦！
你想想看呀，这就好比我们要了解一个人的故事，得从他的点点滴滴开始拼凑，最后才能知道他完整的经历。
测定蛋白质一级结构不也是这样嘛！这可是个精细的活儿呢，需要我们耐心又细心地去做。
要是不这么一步步来，那可就像没头苍蝇一样乱撞啦，怎么能揭开蛋白质的神秘面纱呢？所以呀，这每一步都很重要，都不能马虎呢！我们得认真对待，才能真正了解蛋白质的奥秘呀！你说是不是这个理儿呢？
总之呀，测定蛋白质一级结构虽然有点复杂，但只要我们按照这些基本步骤来，一步一个脚印，就一定能成功的啦！让我们一起加油，去探索蛋白质的神奇世界吧！。
蛋白质一级结构的测定
05
蛋白质一级结构测定的应用 与展望
在生物科学研究中的应用
蛋白质功能研究
通过测定蛋白质一级结构，可以 深入了解蛋白质的功能和作用机 制，为生物科学领域的基础研究 提供重要信息。
生物进化研究
蛋白质一级结构的比较分析有助 于揭示生物进化的规律和机制， 为生物进化研究提供有力支持。
生物标志物发现
蛋白质一级结构的测定可以为生 物标志物的发现和鉴定提供依据， 有助于疾病预警、诊断和治疗。
详细描述
序列分析法是测定蛋白质一级结构最直接的方法，包 括Edman降解法、化学裂解法、质谱法等。Edman 降解法是通过将蛋白质一级结构中的每个氨基酸残基 依次进行化学修饰和测序，从而确定氨基酸的排列顺 序。化学裂解法则是利用化学试剂将蛋白质分解成较 小的肽段，再测定每个肽段中氨基酸的组成和排列顺 序。质谱法则通过分析蛋白质的离子化特性来确定氨 基酸序列。
质谱技术的优势与局限性
优势
质谱技术具有高灵敏度、高分辨率和高 准确性等优点，能够快速准确地测定蛋 白质一级结构，且样品需求量少，适用 于大规模蛋白质组学研究。
VS
局限性
质谱技术对于样品纯度和分子量范围有一 定的要求，对于复杂样品和低丰度蛋白质 的测定仍存在挑战。同时，质谱仪器成本 较高，操作和维护较为复杂。
肽质量指纹图谱
通过将蛋白质酶解成肽段，利用质谱技术分析肽段的质量， 可以获得肽质量指纹图谱，用于蛋白质的鉴定和一级结构 的测定。
串联质谱
串联质谱技术通过将肽段离子进一步裂解，产生更小的片 段离子，从而更精确地测定肽段序列和氨基酸组成，进一 步确定蛋白质一级结构。
磷酸化位点测定
质谱技术还可以用于磷酸化位点的测定，通过分析磷酸化 肽段的离子，可以确定磷酸化位点和磷酸化类型。
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肽段氨基酸序列的测定
Edman降解法：一次可连续测定60~70个氨 基酸；程序复杂，工作量大； 酶降解法：
质谱法：
Edman 降解法测定N-末端氨基酸
Edman reagent
③
①
②
层析色谱鉴定 重复①②③ห้องสมุดไป่ตู้与DNS法联合
PTC-多肽
少一个N-末端 氨基酸的肽链
肽片断在多肽链中排列次序的确定 (见p179)
氨基酸组成分析 酸水解： 碱水解： 甲基磺酸水解： • 优点：
– 不破坏色氨酸， – 经碱中和后可直接上机自动分析
• 缺点：不能有碳水化合物存在 中和点不易掌握 确定氨基酸组成 计算出各种氨基酸分子比 多肽链分子量
末端氨基酸分析
• N末端氨基酸分析
丹黄酰氯法(DNS)： 优点：可直接层析或电泳分离，荧光检测定性 定量；灵敏度高(较二硝基氟苯 法高100倍)
二硝基氟苯 (DNFB or FDNB)法 ； 氨肽酶法；
将肽链裂解成小片断
要求：断裂点较少，专一性较强、产率高 酶裂解法：常用的酶： 胰蛋白酶：仅断裂Lys、Arg羧基形成的肽键 （但） 糜蛋白酶：位点：Tyr、Phe、Trp羧基肽键 胃蛋白酶：位点：两种疏水性氨基酸形成的 肽键 嗜热菌蛋白酶：专一性较差 金黄色葡萄球菌蛋白酶（Glu蛋白酶）： 梭状芽孢杆菌蛋白酶（Arg蛋白酶）：
可从“Altas of Protein Sequence and
蛋白质中多肽链数目的确定 • 测得相对分子质量Mr
很多方法可用于确定蛋白质的相对分子量，如：渗透 压、扩散系数、沉降系数凝胶过滤、凝胶电泳等，
• 测定末端氨基酸数x X ÷ (m /Mr ) = n (蛋白质分子中肽链 数目)（m为样品质量）
蛋白质中多肽链的拆分
• 变性：8mol/L尿素或6mol/LHCI，或高 浓度盐溶液 • 如有二硫键交联：巯基乙醇，或过氧乙 酸处理 • 凝胶过滤或电泳分离不同肽链
蛋白质的氨基酸组成 蛋白质的配基 蛋白质的端基分析
• 测定蛋白质分子中多肽链的数目
测定一级结构的基本步骤
• 拆分蛋白质分子中的多肽链
• 测定多肽链的氨基酸组成 • 分析多肽链的N末端和C末端 • 断裂多肽链内的二硫键 • 多肽链断裂成肽段 • 测定各个多肽段的氨基酸顺序 • 确定肽段在多肽链中的次序 • 确定原多肽链中二硫键的位置
测定的基本策略
用两种裂解肽链的方法,分别得到裂解肽
段；
分离提纯肽段,测出各个肽段的氨基酸 序列；
对两套肽段序列比较,找出重叠肽,确定 各肽段位置,拼凑整个肽链的氨基酸排序。
测定一级结构的准备工作
对样品纯度的要求
>97%
对蛋白质分子量的测定 误差10%
测定分子中多肽链的数目与种类
蛋白质一级结构的测定
魏涛
一级结构 ( Primary Structure )
蛋白质的一级结构指：蛋白质多肽链中氨基酸 的排列顺序，包括二硫键的位置。组成一个蛋 白质分子的多肽链的数目和多肽链中氨基酸的 精确序列是蛋白质一级结构的两个重要方面。 其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋 白质生物功能的基础。
包括以下几方面内容： ①多肽链的数目； ②每条多肽链中氨基酸的种类、残 基数目和排列次序； ③链内或链间二硫键的位置和数目。
蛋白质一级结构测定的策略
• 从蛋白质开始的蛋白质序列分析 • 从DNA开始推蛋白质氨基酸序列 • 质谱法测定蛋白质的一级结构
从蛋白质开始的蛋白质序列分析
测定的基本战略 测定一级结构的准备工作 测定一级结构的基本步骤
多肽链中二硫键位置的确定
• 多肽链氨基酸系列的直接测定：最初于1954 年由英国剑桥大学的Sanger实验室建立；现 主要由编码蛋白质的基因的核苷酸顺序推导. • 蛋白质序列数据库
– 美国生物医学基金会的PIR (Protein Information Resource or Protein Identification Resource); – 美国政府的Gen Bank (Gene Sequence Data Bank) – 欧洲的EMBL (European Molecular Biology Laboratory Data Bank)（欧洲分子生物学实验室 数据库）