(分析化学)亲水相互作用色谱结合串联质谱多重碎裂模式在完整糖肽研究中的应用

研究报告DOI :10.3724/SP.J.1096.2014.30310亲水相互作用色谱结合串联质谱多重碎裂模式在完整糖肽研究中的应用江静1,2　应万涛*2　钱小红*2

1(中国人民解放军总医院,军医进修学院,北京100039)2(蛋白质组学国家重点实验室,北京蛋白质组研究中心,解放军医学院,北京102206)摘　要　蛋白质的糖基化修饰在生理及病理过程中发挥着重要作用㊂由于技术条件的限制,传统的糖蛋白分析方法中,通常分别鉴定蛋白质和糖链两者的结构,而忽略了蛋白质与糖链的连接关系㊂本研究旨在以完整糖肽作为检测对象,对糖肽中肽段序列和糖链结构的同步解析㊂采用亲水相互作用色谱对完整糖肽进行分离纯化,联合生物质谱中碰撞诱导解离(CID)㊁高能诱导解离(HCD)㊁电子转移解离(ETD)等裂解模式,对完整糖肽的糖基化位点㊁糖链结构㊁肽段序列等进行全方面的解析㊂结果表明,亲水相互作用色谱中样品与填料比1∶50可有效富集糖肽,采用30%CID 能量,主要产生糖苷键断裂的碎片,为糖链的结构组成分析提供了线索;采用25%HCD 能量,在低分子量区域提供了糖链的特征离子信息,并产生明确的糖肽Y1特征离子;ETD 保留了完整的修饰基团而产生肽段骨架的断裂,可以提供有效的肽段序列信息㊂本研究结合亲水相互作用色谱与质谱仪中的多种碎裂方式,为完整糖肽的结构解析提供了一种快速㊁有效的研究方案㊂关键词　亲水作用色谱;串联质谱;完整糖肽;碰撞诱导解离;高能诱导解离;电子转移解离　2013⁃06⁃07收稿;2013⁃08⁃05接受本文系国家高技术研究发展计划(No.2012AA020203)㊁国际科技合作项目(No.2011DFB30370)㊁北京市科技新星计划(No.Z121107002512014)资助*E⁃mail:yingwtll@,qianxh1@ 1　引　言

蛋白质的糖基化修饰是生物体内普遍存在的一种重要翻译后修饰方式[1,2],但其研究面临很多挑战㊂糖基化修饰具有多样性㊂糖基化修饰没有任何模板[3],而是由200多种糖基转移酶调控,同一蛋白质的不同位点的修饰水平不一,同一位点所携带的糖链也存在多种结构,这给分析技术和软件工具带来了巨大挑战;目前完整糖肽的分析手段有限,主要以质谱分析为主,但由于糖肽修饰的微不均一性,及在质谱中离子化困难㊁碎裂情况复杂等特点,严重制约了完整糖肽的富集和质谱分析技术的发展㊂2012年,Doerr 等[4]总结了糖蛋白质结构解析的经典研究手段,并指出主要的研究方法是先将糖链从蛋白上释放,然后分别对两者进行解析,这导致了蛋白与糖链之间联系的缺失㊂聚糖结构解析[5],可以解析大量糖链结构,却忽视了糖链的来源;蛋白部分研究[6],可以得到明确的蛋白序列及大规模糖基化位点,却丢失了糖链信息㊂Nakano 等[7]研究发现,特异位点的糖基化修饰影响生物学功能,这表明位点特异性水平的糖基化修饰研究对进一步阐释糖蛋白质的生理功能及其在病理过程中的变化具有重要意义㊂因此,开发完整糖肽水平的研究方法,保留蛋白质与聚糖之间的连接,已成为当前的研究热点㊂

完整糖肽的复杂结构对分析方法的制约,需要从富集和鉴定两方面解决㊂首先是由不均一性导致的糖肽低化学计量水平,及其在质谱中离子化效率不高而受非糖肽信号抑制的问题㊂可以通过完整糖肽的富集与分离,去除非糖肽的干扰而提高糖肽的相对丰度㊂目前应用于富集糖蛋白/糖肽的方法主要有凝集素[8]㊁二氧化钛[9]㊁酰肼[10]和亲水相互作用色谱(Hydrophilic interaction liquid chromatography,HILIC)[11]等㊂其中,HILIC 是基于富含多羟基的糖链结构的强亲水特性,而使糖肽与非糖基化肽段得以分离㊂HILIC 对不同类型的糖肽没有偏性,且能保持糖链结构的完整性,适合作为完整糖肽结构研究中的富集技术㊂其次,完整糖肽包含肽段和糖链两部分,其结构和连接方式的差异导致两者在串联质谱第42卷

2014年2月 分析化学(FENXI HUAXUE )　研究报告Chinese Journal of Analytical Chemistry 第2期159~165

061 分析化学第42卷

中的碎裂行为有较大的区别,仅采用经典的碰撞诱导解离(Collision⁃induced dissociation,CID)碎裂不能有效得到糖肽的全面信息,Wiesner等[12]指出,电子转移解离(Electron transfer dissociation,ETD)碎裂模式在蛋白质翻译后修饰研究中,可以补充CID的不足而发挥重要作用,高能诱导解离(High energy colli⁃sional dissociation,HCD)可以提供更为丰富的低分子段碎片离子信息㊂多种碎裂方式联合的方法在蛋白质组学中也已经得到有效应用[13],多种碎裂方式联合应用的方式可以为完整糖肽研究提供借鉴㊂本研究以完整糖肽作为检测对象,制作了HILIC富集装置,并联合CID,HCD,ETD等多种串联质谱碎裂方式,在解析糖链结构的同时,获取肽段序列以及糖基化位点信息,从而实现糖蛋白结构的全面解析㊂2　实验部分

2.1　仪器、试剂与材料

基质辅助激光解吸附电离飞行时间串联质谱仪(UltrafleXtremeMALDI⁃TOF/TOF⁃MS,德国Bruker Daltonics公司);电喷雾电离⁃线性离子阱⁃静电场轨道阱质谱仪(ESI⁃LTQ⁃Orbitrap⁃XL,美国Thermo Fisher公司);离心机㊁冷冻干燥离心机(美国Thermo Fisher公司);HILIC小柱(自制,亲水相互作用填料为博纳艾杰尔科技产品)㊂

牛胎球蛋白(Fetuin)㊁核糖核酸酶B(RNase B)㊁2,5⁃二羟基苯甲酸(DHB)㊁乙腈(美国Sigma公司);肽⁃N⁃糖苷酶F(PNGase F,NEB公司);胰酶Trypsin(测序级,美国Promega公司);二硫苏糖醇(DTT,美国GE公司),碘乙酰胺(IAA,比利时Acros公司),三氟乙酸(TFA)㊁甲酸(美国Fluka公司);其它试剂均为国产分析纯,实验用水为Milli⁃Q制备的超纯水㊂

2.2　实验方法

2.2.1　糖蛋白酶解　取适量牛胎球蛋白或核糖核酸酶B蛋白,溶解于50mmol/L NH4HCO3㊂加入适量DTT,使终浓度为10mmol/L,56℃水浴1h㊂加入IAA,使其终浓度为40mmol/L,暗处反应30min㊂加入终浓度为10mmol/L DTT封闭过量的IAA㊂按质量比1∶50加入胰酶进行酶切,37℃反应过夜㊂反应溶液置于95℃水浴10min,灭活胰酶,终止酶解反应㊂

2.2.2　HILIC小柱富集完整糖肽　本实验使用由移液枪头自制的HILIC小柱富集纯化蛋白酶切混合物中的糖肽㊂首先,用80%乙腈,1%FA,冲洗活化小柱,然后,浓缩的酶切混合物,溶于50μL80%乙腈,1%FA溶液,上样于HILIC小柱㊂再用100μL80%乙腈,1%FA溶液进行脱盐,重复3次㊂最后用5%乙腈,1%FA溶液100μL洗脱,收集糖肽㊂洗脱溶液用冷冻干燥离心机旋干,-20℃保存待用㊂2.2.3　MALDI⁃TOF/TOF⁃MS分析条件　肽段或富集后的糖肽与DHB(2,5⁃二羟基苯甲酸)基质1∶1混合点靶㊂采用正离子反射模式,离子源电压20kV,脉冲离子提取电压18.8kV,离子提取延时时间110ns,激光频率2000Hz,激光能量50%,每张谱图共采集1500个激光点,校准相对误差≤5ppm㊂分析质谱图谱的软件为FlexAnalysis

3.4㊂

2.2.4　ESI⁃LTQ⁃Orbitrap⁃XL分析条件　HILIC小柱富集纯化得到的完整糖肽样品,溶解于50%乙腈⁃0.1%甲酸溶液中,用纳升级电喷雾离子源直接进样,采用LTQ⁃Orbitrap⁃XL质谱仪,正离子模式下扫描㊂采用碰撞诱导解离(CID);高能诱导解离(HCD);电子转移解离(ETD)等不同的碎裂方式进行碎裂,然后由Orbitrap进行检测㊂

3　结果与讨论

3.1　亲水相互作用色谱富集完整糖肽

3.1.1　HILIC富集糖肽方法考察　本研究采用牛胎球蛋白优化HILIC小柱富集步骤㊂牛胎球蛋白由Trypsin酶切后,经PNGase F处理去除糖肽上的糖链,未经富集的Fetuin蛋白酶切产物如图1a所示㊂PNGase F去除糖链后,消除了糖链不均一性对质谱的影响,但由于样品体系的复杂性和肽段性质的差异,去糖后的糖肽在蛋白的总酶切肽段中的相对信号依然较弱㊂非糖基化肽段形成的分子离子峰147

4.84对其它肽段产生了明显抑制(图1a)㊂例如,去糖后N99位的肽段[M+H]+m/z3672.7519,及N156位的肽段[M+H]+m/z1741.8247,在谱图中仅为依稀可见的两个小峰,而N176位的肽段[M+H]+