DNA甲基化在动植物遗传育种中的研究进展_徐青

doi:10．3969／j．issn．1009－0002．2011．01．026综述DNA甲基化在动植物遗传育种中的研究进展
徐青1，余云舟2，赵萌1，2，孙东晓3
1．北京交通大学生命科学与生物工程研究院，北京100044；2．军事医学科学院生物工程研究所，北京100850；3．中国农业大学动物科技学院，北京100193
［摘要］DNA甲基化是真核生物表观遗传学重要的机制之一，对基因转录水平的表达具有重要的调控作用。

近年来，DNA甲基化在动植物遗传育种领域的研究引起了人们广泛的关注。

我们从DNA甲基化与基因的表达调控、动植物基因组的甲基化状态、甲基敏感扩增片段多态性方法、DNA甲基化与杂种优势，以及DNA甲基化与分子标记等方面，简要综述了国内外有关DNA甲基化在动植物遗传育种研究中的进展，着重于全基因组DNA甲基化模式在动植物遗传育种中的相关研究和应用。

［关键词］DNA甲基化；基因表达；杂种优势；分子标记；基因组
［中图分类号］Q75［文献标识码］A［文章编号］1009－0002(2011)01－0113－05
Progress of DNA Methylation in Genetics and Breeding of Plant and Animal
XU Qing1,YU Yun－Zhou2,ZHAO Meng1,2,SUN Dong－Xiao3
1．Institute of Life Science and Biotechnology,Beijing Jiaotong University,Beijing100044;2．Beijing Institute of Biotechnology,Beijing100071;3．College of Animal Science and Technology,China Agricultural University,Beijing 100094;China
［Abstract］As one of the important epigenetic mechanisms in eukaryotes,DNA methylation plays a crucial role in regulation of gene expression in mRNA level．In recent years,more attention was paid upon DNA methylation in plant and animal genetics and breeding．The progresses in this area were reviewed as following:mechanisms of DNA methylation on regulation of gene expression,DNA methylation patterns in genome of plant and animal, method of methylation sensitive amplification polymorphism,DNA methylation and heterosis,and DNA methylation and molecular marker,with the emphasis on the research and applications of DNA methylation patterns in whole genome in plant and animal genetics and breeding．
［Key words］DNA methylation;gene expression;heterosis;molecular marker;genome
DNA甲基化是真核细胞基因组主要的修饰方式之一，同时也是表观遗传学的主要机制之一。

近年来，有关表观遗传学的研究取得了突飞猛进的进展，而作为表观遗传学的重要组成部分，DNA甲基化研究已深入到生物、医学、农业及环境等各个领域。

我们从DNA甲基化与基因的表达调控、动植物基因组的甲基化状态、DNA甲基化与杂种优势，以及DNA甲基化与分子标记等方面，简要综述了近年来国内外DNA甲基化在动植物遗传育种研究中的新进展，着重于全基组DNA甲基化模式在动植物遗传育种的相关研究和应用。

1DNA甲基化与基因的表达调控
1．1DNA甲基化修饰
DNA甲基化是指在各类DNA甲基化转移酶的作用下，将S－腺苷甲硫氨酸（SAM）上的甲基基团共价结合到DNA分子的胞嘧啶碱基或腺嘌呤碱基上的生化过程，它是表观遗传学和表观基因组学的重要研究内容。

在哺乳动物中，DNA甲基化包括去甲
［收稿日期］2010－07－29
［基金项目］国家高技术研究发展计划重点项目（2007AA10Z157）；
转基因生物新品种培育重大专项(2009ZX08009－156B)；
中央高校基本科研业务费专项（209JBM107）；
北京市自然科学基金（6112018）
［作者简介］徐青（1975－），女，博士，讲师
［通信作者］孙东晓，（E－mail）sundx＠cau．edu．cn
基化、重新甲基化和维持甲基化三部分。

DNA去甲基化过程是在去甲基化酶的作用下，利用核苷酸切除和连接步骤而进行的核酸替代过程，并受RNA 分子的调节。

在胚胎早期受精卵中，来自亲本两套染色体的基因组发生了普遍的非特异的去甲基化过程，而特异性的去甲基化具有组织和阶段的特异性。

随后，在生长发育过程中又重新建立甲基化状态。

基因组重新甲基化的过程是通过DNA甲基转移酶Dnmt3a和Dnmt3b的协同作用完成的。

基因组重新甲基化后，Dnmt1是参与维持甲基化过程的重要蛋白分子。

研究证明，DNA甲基化在植物个体发育中同样具有重要的作用，但与哺乳动物相似，植物中的DNA甲基化的基本功能是维持基因组的稳定性，基本上在个体发育中及世代之间保持稳定[1]。

1．2DNA甲基化调控基因表达的机制
DNA甲基化主要在转录水平对基因的表达进行调控。

DNA甲基化对基因的表达调控作用与启动子附近的CpG岛浓度和启动子的强弱有关，分布较少的CpG岛的甲基化可以关闭弱启动子所控制的基因，但不能关闭强启动子所控制的基因，而如果高密度的CpG岛被甲基化，则强启动子也不能使基因表达。

DNA甲基化调节基因的表达有几种可能的机制：由于胞嘧啶甲基化改变了DNA分子的空间结构，直接干扰了特异转录因子与各自启动子的识别位置的结合。

几种转录因子如Ap－2、cMyc／Myn、cREB和E2F，能识别含CpG残基的序列，当CpG 二核苷酸的C被甲基化后，结合作用被抑制。

相反，其他一些转录因子与甲基化和非甲基化DNA结合位点都能结合，DNA甲基化对这些转录因子基本不起抑制作用；序列特异的甲基化DNA结合蛋白与甲基化的启动子序列特异性结合从而抑制转录因子与靶序列的结合；甲基化CpG结合蛋白（MeCP1和MeCP2）与甲基化的二核苷酸CpG结合，类似转录抑制蛋白的作用[2]；甲基化通过影响染色质结构抑制基因表达。

通常认为DNA甲基化和组蛋白去乙酰化能够使染色质处于紧密压缩状态，从而抑制基因的表达，反之，DNA去甲基化和组蛋白乙酰化使染色质紧密压缩的构象发生改变，从而促进基因的表达。

2动植物基因组的甲基化状态
2．1脊椎动物基因组
脊椎动物DNA的甲基化有以下特点：脊椎动物基因组内甲基化多数发生在与鸟嘌呤（G）相连的胞嘧啶上（C），形成5mCpG，基因组中有3％的C是甲基化的，而CpG中70％的C是甲基化的，理论上脊椎动物基因组内GC的含量约占42％，相邻的二核苷酸CpG的含量应为20％，而实际的CpG含量只占该预测值的1／5，这是由于甲基化的C容易脱氨基形成胸腺嘧啶（U），导致CpG越来越少；大多数CpG岛处于非甲基化状态[3]。

在基因组上，长约200 bp的序列如果GC含量大于50％，CpG／GC的值大于60％，被称为CpG岛，这种特殊的序列常位于基因的启动子区，有时还包括基因5′端的外显子和内含子。

脊椎动物中持家基因的启动子都含有CpG 岛，且多数处于非甲基化状态，而组织特异性基因则缺乏CpG岛；基因启动子区的CpG异常甲基化会导致基因转录的抑制，而且基因转录的活性与CpG甲基化的程度有关，高密度甲基化的CpG会完全抑制启动子的转录。

哺乳动物DNA甲基化的修饰对胚胎发育、X染色体失活[4]和基因印记[5]等起了重要的调节作用，同时甲基化的异常可导致肿瘤等疾病的发生[6]。

2．2植物基因组
植物中DNA甲基化的碱基有6甲基腺嘌呤（6mA）和5甲基胞嘧啶（5mC）两种，主要为5mC。

与脊椎动物不同，植物DNA甲基化的水平较高，5mC 的含量占到基因组中C碱基的30％。

可能的原因包括：尽管植物和动物中CG序列的甲基化比例都为70％～80％，但CG双核苷酸在植物中所占的比率（3％～4％）远高于动物（0．5％～1％）；动物的甲基化位点只有CG双核苷酸位点，而植物的甲基化位点除CG外还有CNG。

不同植物的DNA甲基化水平是不同的，如拟南芥的DNA甲基化水平仅为4．6％，而烟草则高达32．6％[7]。

同一物种的不同时期及不同组织中甲基化水平的差异也较大，这也与脊椎动物相同。

对拟南芥的研究表明，成熟叶片的DNA甲基化水平高于幼苗，而种子高于成熟的叶片[8]。

对烟草、豌豆、小麦和玉米的研究表明，基因组中5mC的比例与GC含量呈线性正相关，而非甲基化的C的比例几乎保持一致[9]。

虽然高等植物的甲基化水平高于动物基因组，但没有达到100％。

与脊椎动物相似，未甲基化的CpG和很多基因的表达有关，也许正是这种不完全的甲基化使这些位点成为细胞内调节的潜在因子。

3DNA甲基化在动植物遗传育种中的应用
3．1甲基化敏感扩增多态性
在从全基因组水平上进行动植物遗传育种DNA甲基化的研究中，甲基化敏感扩增多态性（methylation sensitive amplification polymorphism，MSAP）是最为常用的一种方法。

与其他DNA甲基化检测方法相比，以酶切和PCR为基础的MSAP不但敏感性强，而且只需要常规的仪器，操作比较简单，适用于没有任何信息的全基因组水平的甲基化分析[10]。

MSAP是在扩增片段长度多态性（AFLP）[11]基础上经过改进而用于甲基化研究的方法，其原理是用甲基敏感性内切酶HpaⅡ与MspⅠ代替AFLP的高频内切酶MseⅠ处理基因组，并设计相应的接头和引物，对酶切后的基因组进行扩增。

由于HpaⅡ和MspⅠ识别相同的序列（5′－CCGG－3′），但对甲基化的敏感程度不同，因此CCGG的甲基化状态将导致Eco RⅠ／HpaⅡ和Eco RⅠ／MspⅠ的酶切、扩增产物产生多态性。

通过比较电泳谱带的差异，可以推测出CCGG的甲基化状态。

目前，MSAP方法已广泛应用于各种诱导条件下植物的表型变异与甲基化的关系[12－13]、组培植物、克隆动物异常与甲基化的关系[14－15]，以及杂种表现与甲基化的关系[16]等研究中。

然而，以往的MSAP方法多采用同位素标记引物，实验程序繁复，安全性差[17]。

本实验室在MSAP方法基础上用荧光标记引物，电泳时加入内标，通过自动化的DNA测序仪收集荧光标记的电泳图像，以分析软件处理结果，并且优化反应条件，建立了一种更为快速、安全、准确、自动地检测基因组甲基化的方法F－MSAP[18]。

3．2DNA甲基化与杂种优势
杂种优势是杂合子将两个不同的基因群组合在一起形成的不同于亲本的新的遗传体系。

新的遗传体系不仅仅是所得遗传物质的简单组合，而是经历了复杂的调整过程，产生了一种不同于亲本的遗传与表观遗传信息。

在新的体系中，亲本的基因型彼此协调，相互促进，有效地控制基因的表达。

杂合子在新的遗传体系中产生了不同于亲本品种的性状表现，这种性状表现可能与亲本基因在杂合状态下表达调控方式的改变有关[19]，也有研究认为杂种的性状表现是不同的基因差异表达的结果[20－21]。

鉴于DNA甲基化对基因表达调控的重要作用，人们开始从DNA甲基化与基因表达转录水平的调控去探讨杂种优势产生的遗传机制。

近年来，DNA甲基化状态在杂种与亲本的变化和杂种表现的关系受到了越来越多学者的关注。

植物DNA甲基化的研究，特别是对DNA甲基化与基因的抑制表达的分析，认为自交能导致甲基化程度的逐渐积累，而杂交能使甲基化程度得以解除或重新编排。

Tsaftaris等[22]通过对玉米杂交种及其亲本DNA甲基化比例的研究，发现基因组表达活性与DNA甲基化存在显著负相关，由此认为杂交种DNA甲基化程度降低可能与杂种优势形成有关。

而Xiong等[20]对水稻杂交种及其双亲的DNA甲基化研究的结果表明杂交种与其双亲的DNA甲基化水平没有差异，认为杂种优势的产生与特异位点的甲基化状态有关。

仪治本等[23]通过MSAP方法分析了3个高粱杂交种及其相应亲本基因组CCGG位点胞嘧啶的甲基化水平和杂交种与相应亲本的甲基化差异模式。

结果表明，杂交种比相应的亲本在形成杂合体时某些位点发生了去甲基化。

杂交种F1代DNA甲基化模式经历了较大的改变与调整，杂种优势的产生与杂种基因组DNA甲基化模式的改变和重新调整有关。

而Zhang等[24]认为高粱杂交种与亲本基因组DNA甲基化水平与模式的差异，可能是在杂交个体中随机产生的，与亲本的杂合性没有关系。

Zhao 等[25]发现，与没有杂种优势表现的棉花杂交种相比，高杂种优势表现的棉花杂交种基因组拥有数量较多的去甲基化位点，杂种优势的表现与特异位点的甲基化状态有关。

洪舟[26]等发现，杉木不同品种正反交组合总的甲基化百分率相对于亲本的自交系而言呈减少的趋势。

检测位点外侧胞嘧啶半甲基化和内侧胞嘧啶甲基化位点变化与杉木树高、胸径和材积性状的杂种优势成显著负相关。

蒋曹德等[27]对2个不同品种的猪杂交种及亲本进行甲基化差异研究，结果表明基因启动子区域CpG岛甲基化在亲子代出现差异，不同甲基化位点对杂种生产性状的作用方向不同，说明杂种优势的表现既与某些基因的表达有关，也与某些基因的表达抑制有关。

而我们实验室的研究表明，在2个不同品种的鸡的杂交子代中，来自双亲的甲基化模式进行了丰富的调整，在保持大多数稳定传递的同时，又进行了复杂的甲基化与去甲基化变化，在环境的参与下最终形成一个适应生存并综合表现双亲性状的状态[28]。

所以，杂合子的杂种表现和杂合子甲基化状态的改变必然存在内在的联系，但甲基化状态的改变如何影响杂种表现，还需要更多的探讨与研究。

在其他品种组合及其他动植物中是否也存在这种联系，还有待于具体实验的验证。

总的来说，从DNA的甲基化差异入手分析杂种优势的产生，可以通过寻找杂种中对杂种优势有效应的甲基化位点，结合相应的序列分析和遗传分析，找到控制杂种优势的遗传因子。

遗传分析主要
徐青等：DNA甲基化在动植物遗传育种中的研究进展115
生物技术通讯
LETTERS IN BIOTECHNOLOGY Vol．22No．1Jan．,2011
是通过甲基化片段的染色体定位，比较它们在染色体上与控制性状表现或杂种优势的遗传位点的位置关系。

通过甲基化差异片段的序列分析，有可能发现一些基因表达的调控因子，进而分离相应的基因。

动植物基因组具有较高的GC含量，而参与基因表达调控的甲基化序列通常具有GC岛，所以研究动植物基因组的甲基化状况，比较容易发现亲代与子代间甲基化的变化规律，从而为杂种优势的分子机理研究提供新的思路。

目前关于甲基化、基因表达与杂种优势表型的相关研究还很少，还无法确定发生表达改变的基因与杂交子代表型变化的直接关系。

3．3DNA甲基化与分子标记
分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段，它可以直接反映基因组DNA间的差异。

分子标记广泛存在于基因组DNA的各个区域，通过比较随机分布在整个基因组的分子标记的多态性，能够全面评估研究对象的多样性，并揭示其遗传本质。

利用遗传多样性的结果可以对种质进行聚类分析，进而了解其系统发育与亲缘关系。

而以分子标记为基础的比较基因组研究则有利于探明近缘物种间的遗传同源性及物种起源等生命科学领域中的重要问题。

DNA分子标记具有标记数量大（对某一动植物个体而言，其数目可达108～1010个），大多数呈中性突变且多态性丰富、遗传稳定等特点。

研究表明，动植物基因组上DNA甲基化位点的特征非常符合DNA分子标记的要求，而且半保留复制机制使个体中DNA甲基化模式的遗传相对其他分子标记更为稳定。

Messegure 等[29]分析了番茄不同品种间及后代中甲基化的多态性，结果表明亲本的甲基化多态性是以孟德尔方式高度遗传给后代的。

洪柳等[30]应用MSAP技术对24个脐橙品种胞嘧啶甲基化模式和程度进行评估，结果显示DNA甲基化在脐橙中发生频繁，品种之间的甲基化模式存在较大差异，而且某一个位点的甲基化多态可以区分几个不同的品种，这说明使用MSAP检测脐橙品种的多态性是非常有效的。

Noyer 等[31]通过SSR、AFLP及MSAP三种方法对30个香蕉品种进行多样性分析，其中SSR和AFLP标记在30个品种间没有多态性，而MSAP方法分析结果表明，30个品种在16个甲基化位点具有丰富的多态性，根据这16个标记可以将30个香蕉品种聚为三大类。

虽然DNA甲基化作为分子标记在遗传育种中的研究刚刚起步，甚至在动物遗传育种中还没有发现相关的文献，但DNA甲基化具有自身所独有的特点，相信在不久的将来，DNA甲基化分子标记会在群体遗传关系分析、分子育种、基因定位、种质鉴定及分子标记辅助选择等方面发挥重要的作用。

4结语
作为表观遗传学重要的机制，DNA甲基化不仅对基因的表达具有调控作用，而且这种调控作用可以随着细胞分裂在世代间稳定遗传。

因此，DNA甲基化是一种高于基因组序列水平的基因表达调控机制，是将基因型和表型联系起来的一条纽带。

在已有的研究基础上，运用更为准确灵敏的技术方法，结合相关的基因组数据，从全基因组水平上深入探讨DNA甲基化与动植物杂种优势的关系，筛选动植物DNA甲基化分子标记，以及鉴定动植物重要经济性状相关的功能基因，对于动植物基因组甲基化研究的数据积累、动植物重要经济性状的功能基因的发掘、畜禽及作物杂种优势的机制研究及杂种优势高效利用的新途径等，都具有重要的意义。

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