第五章动物卵母细胞与胚胎冷冻保存技术
卵母细胞的冷冻技术
一、冷冻技术概述
2.细胞损伤假说
冷冻损伤是卵母细胞冷冻保存的主要障碍，有报 道认为冷冻常会使细胞膜，透明带发生变化，细胞骨 架被破坏，染色体出现异常等。
一、冷冻技术概述
1.2冷冻保护剂分为渗透性和非渗透性两种
①渗透性冷冻保护剂主要有丙二醇（PROH）、二
甲基亚砜（DMSO)、甘油和乙二醇(EG)等。 渗透性冷冻保护剂主要通过细胞膜，降低溶液的冰 点，增加溶液的粘性，稀释溶液中的溶质浓度。
一、冷冻技术概述
②非渗透性冷冻保护剂主要有蔗糖、葡萄糖和脂蛋白等。
研究发现包裹卵母细胞的卵丘细胞层数越多，解冻 后卵母细胞存活率越高。Jack等比较冷冻GV期卵母细 胞前后变化，发现致密的COC与裸卵相比具有较高的成 熟率。可能是卵丘细胞参与了卵母细胞的成熟，如果去 除卵丘细胞，成熟率则会大幅度降低。
三、实验
⑴冷冻方法与保护剂对牛卵母细胞解冻后细胞 发育的影响
1.卵母细胞的采集与成熟培养
一、冷冻技术概述
随着生物学、医学和低温制冷技术的发展，低温冷冻 技术已逐渐形成的一门边缘学科低温生物学，该领域主 要应用是在保存各种细胞、组织、胚胎、器官甚至是活 体的冷冻保存。 在超低温条件下动物种质细胞之所以能长期保存，是 因为种质细胞内一切新陈代谢过程中的化学变化被超低 温所抑制，当温度降到一定限度时，细胞内所有的化学 变化也就处于一种“暂停”状态而使细胞得以长期保存； 低温保存的细胞以一定的方式复苏后，又具有存活的能 力。
《胚胎工程实验技术》 讲义
《胚胎工程实验技术》讲义一、胚胎工程的概念与发展胚胎工程是指对动物早期胚胎或配子所进行的多种显微操作和处理技术。
它是在胚胎学基础上发展起来的一门新兴学科，主要包括体外受精、胚胎移植、胚胎分割、胚胎冷冻保存、胚胎性别鉴定等技术。
胚胎工程的发展可以追溯到上世纪初。
随着显微镜技术的不断进步，人们对生殖细胞和胚胎的结构与功能有了更深入的了解。
20 世纪 50 年代，科学家成功实现了家兔的胚胎移植，标志着胚胎工程技术开始走向实用化。
此后，各种胚胎工程技术不断涌现和完善，为畜牧业、医学等领域带来了巨大的变革。
二、体外受精技术（一）基本原理体外受精是指将哺乳动物的精子和卵子在体外人工控制的环境中完成受精过程的技术。
其基本原理是模拟体内受精的环境，使精子和卵子在适宜的条件下结合形成受精卵。
（二）操作步骤1、卵母细胞的采集卵母细胞的采集方法主要有两种：一种是从卵巢中直接采集未成熟的卵母细胞，然后在体外培养成熟；另一种是通过超数排卵技术，使雌性动物排出更多的卵子，再从输卵管中采集成熟的卵母细胞。
2、精子的采集与获能精子的采集通常通过人工采精的方法获得。
采集后的精子需要在体外进行获能处理，使其具备受精能力。
获能的方法有化学诱导法和培养法等。
3、受精将成熟的卵母细胞和获能的精子在体外共同培养，使精子穿过卵母细胞的透明带和卵膜，完成受精过程。
（三）应用体外受精技术在畜牧业和人类辅助生殖领域都有广泛的应用。
在畜牧业中，可以快速扩繁优良家畜品种；在人类辅助生殖领域，为不孕不育夫妇带来了生育的希望。
三、胚胎移植技术（一）基本原理胚胎移植是指将雌性动物体内的早期胚胎，或者通过体外受精及其他方式得到的胚胎，移植到同种的、生理状态相同的其他雌性动物体内，使之继续发育为新个体的技术。
（二）操作步骤1、供体和受体的选择供体应选择具有优良遗传性状和生产性能的个体，受体则要求具有良好的繁殖性能和健康状况。
2、同期发情处理对供体和受体进行同期发情处理，使它们的生殖生理状态同步化，为胚胎移植创造适宜的条件。
第六章动物人工繁殖
3、异种体细胞克隆阶段
异种体细胞克隆就是将一种动物得体细胞核移植到另一种动物得去核(遗传物质)卵母细胞 中。 由于濒危物种得个体数量少,很难提供用于克隆得卵母细胞和代孕受体,这就促使科学家提 出了异种克隆得设想。 异种克隆研究面临着许多问题,如体细胞核能否在异种卵胞质中去分化并支持早期胚泡发育？ 异种核质能否相容？异种重构胚能否着床并进行全程发育等问题。 1999年,中科院动物所实验室将成年大熊猫体细胞作为供核体细胞移植到去核(遗传生物)日 本大耳白兔卵母细胞中成功地构建异种重构胚,体外培养获得孵化囊胚。 2001年将重构胚移植寄母子宫,获得了着床得重大进展。 2002年,不仅异种重构胚能够在异种寄母子宫中着床,而且还能发育,这就是异种克隆大熊猫 研究中攻克得最后一个难题中得最新进展。
试管婴儿得三个阶段:
第一代试管婴儿:最早成功得常规技术。 第二代试管婴儿:采用显微受精技术将单个精子注射进卵细胞内使其受精。适用 于男性原因得不孕,如少精、弱精等。1996年,我国第二代试管婴儿(ICSI)在中山 医科大学获得成功。 第三代试管婴儿:对体外受精得胚胎取出细胞进行遗传学诊断后再行胚胎移植。 我国第三代试管婴儿(PGD)在中山医科大学获得成功。 2000年3月,我国首例超快速冷冻胚胎移植得试管婴儿在湖南医科大学人类生殖 工程研究室诞生,标志着我国在该领域得研究已进入世界先进行列。 进一步,美国、日本、台湾正研制多胞胎和“人造子宫”以完成怀孕全过程。
胚胎工程---体外受精(IVF)(第一步骤)
精子获能就是精子获得穿透卵子透明带能力得阶段。
精子获能分为体内获能与体外获能 体内获能:精子在附睾内已经获得了受精能力,但由附睾分泌得一种物质附于精
子表面,抑制了她得受精能力,这种物质被称为去能因子。去能因子就是顶体 酶得抑制剂。 体外获能:精子通过用子宫液、卵泡液、子宫内膜提取液或血清等在体外培养获 能得过程。 2 、卵子回收及成熟培养 3 、卵子和精子得体外受精(in vitro fertilization IVF) 受精成功得标志至少就是看受精卵就是否可以发育至囊胚期阶段 4 、受精卵得体外发育及体外培养
卵母细胞和胚胎玻璃化冷冻方法
卵母细胞和胚胎玻璃化解冻方法用途：本品用于卵母细胞和胚胎的玻璃化解冻配套。
安全解冻配套：1.1瓶4ml解冻液（TS）2.1瓶1.5ml稀释液(DS)3.1瓶1.5ml 冲洗液(WS)4.1个25mm 的培养皿(用于解冻液)5.1个6孔生殖板使用说明准备：*用载体和生殖板将解冻液放到37℃的培养箱里加温—将所有解冻液倒入生殖板里。
*用微细管吸取DS,WS1和WS2各300ul，放进培养皿。
注意：用巴斯德管吸取一个大小合适的卵母细胞（直径：140um）或者胚胎(直径：140-180um)解冻：1.迅速地将载体顶放进解冻液中，浸泡1分钟。
（图一）2.用巴斯德管吸取卵母细胞（胚胎），轻轻地将其放入DS底部，浸泡3分钟。
（图二）3.用巴斯德管吸起卵母细胞（胚胎），轻轻地将其放入WS1 底部，浸泡5分钟。
（图三）4.用巴斯德管吸起卵母细胞（胚胎），轻轻地将其放入WS2 顶部，当卵母细胞（胚胎）自动沉到底部的时候，重新再重复这一步骤。
（图四）5.将卵母细胞（胚胎）转移到装有合适培养液的培养皿中。
放进37℃的培养箱中完成恢复。
注意：卵母细胞要放置2小时，胚胎则要3小时。
质量控制测试：每一批安全解冻配套都得到以下测试：*溶液：UPS不孕不育无菌测试（SAL 10-3）LAL拉尔内毒素测试小老鼠胚胎试验（一个细胞）保存方法：*保存于4-8℃*在标签所示有效日期前，本品性质稳定。
成分：*血清替代补充*基本培养基M-199 内含的HEPES*蔗糖参考文件（此部分请看原件）.玻璃化第一部分：所需材料*玻璃化配套No.0 基础液（BS）：1.5ml x1 (只用于卵母细胞玻璃化冷冻)No.1 稀释液（ES）: 1.5ml x1No.2 玻璃化溶液（VS）: 1.5ml x2*冷冻管x4, 建议每个冷冻管最多储存3个卵母细胞或者3个胚胎*复制板x2: 6孔*冷却架(蓝盒液氮，型号：VT-CLB)*巴斯德管（型号：MT-150）*显微镜（关掉加热板）*秒表或计算器（带计算功能）*液氮（消毒过滤功能，聚四氟乙烯滤膜过滤）*镊子*显微针x2: 2-20ul, 100-1000 ul*罐子*储存罐注意：使用的巴斯德管大小要与卵母细胞或胚胎大小合适。
畜牧学-考博-动物胚胎生物工程复习题及答案
博士生入学考试动物胚胎生物工程复习提纲要求了解动物胚胎工程的研究内容、发展动态及其在畜牧生产和生物医学中的作用和地位，掌握卵子发生、精子获能、受精、激活、早期胚胎发生和分化的理论、并对动物胚胎移植、胚胎分割、胚胎冷冻保存、体外受精、性别控制、嵌合体、干细胞、核移植和转基因技术的研究历史、现状和动态有一全面的了解。
1、动物胚胎工程技术的研究现状及其与人类健康的关系。
2、初级卵母细胞的来源及其在生长过程中所经历的主要变化。
3、卵母细胞成熟分裂的调控机理。
4、卵母细胞成熟分裂过程中核质的主要变化。
5、精子的获能及其机理。
6、受精过程中精卵识别的机理及其所发生的主要变化。
7、胚胎早期发生过程中的基因表达及其形态和细胞生物学变化。
8、胚胎发生过程中的细胞分化及其发育潜能的变化。
9、胚胎移植的意义和研究历史。
10、胚胎移植的生理学基础。
11、胚胎移植的原则和基本程序。
12、胚胎分割的原理、意义和研究现状。
13、卵母细胞和胚胎冷冻保存研究的历史和现状。
14、卵母细胞和胚胎冷冻保存的方法及其原理。
15、体外受精技术研究的历史和现状。
16、影响卵母细胞体外成熟的主要因素。
17、如何检查卵母细胞体外成熟的情况。
18、如何判定卵母细胞的细胞质成熟情况？19、卵母细胞第一次成熟分裂为何都在双线期？20、精子体外获能的方法及其原理。
21、影响体外受精的主要因素。
22、体外受精质量与胚胎发育有何关系？如何提高体外受精质量？23、胚胎体外培养系统的研究历史及现状。
24、体外受精技术的应用前景和展望。
25、动物性别控制研究的历史和现状。
(过时)26、动物嵌合体技术研究的历史和现状。
27、嵌合体的制作方法和应用前景。
核移植技术28、核移植技术的原理和意义。
29、核移植研究的历史和现状。
30、卵母细胞激活的机理和方法。
31、核移植的主要影响因素。
32、受体卵母细胞的去核和融合的方法。
33、供体细胞核周期的调控方法。
34、核移植技术的应用前景。
整理全部：动物胚胎工程
1.绪论动物胚胎工程就是以胚胎为研究对象，为了加速繁育经济动物，培育动物的优良品种，或挽救濒危动物使用的一系列工程技术方法，一般来说包括胚胎移植、试管动物（体外受精）、胚胎冷冻、胚胎分割、胚胎干细胞、核移植（克隆）技术等。
动物胚胎工程又称胚胎生物工程或胚胎生物技术，主要是对动物的卵子、精子和胚胎在体外条件下进行各种操作，以加速繁育经济动物，培育优良品种，或挽救濒危动物而使用的一系列工程技术方法。
生物工程包括基因工程、细胞工程、酶工程和发酵工程。
胚胎工程是细胞工程中的分支。
繁殖技术：同期发情、超数排卵、人工授精胚胎移植、体外受精、胚胎冷冻、胚胎分割、性别控制、动物克隆、发情鉴定、妊娠诊断、生殖免疫、助产技术、生殖疾病控制技术繁殖管理：从群体角度研究提高动物繁殖效率的理论与技术措施繁殖障碍及其防治：从畜牧学的角度分析动物繁殖障碍的发病率和病因，探讨防治繁殖障碍的方法与技术措施。
动物胚胎工程的研究内容：胚胎移植，胚胎分割，胚胎冷冻，体外受精，胚胎干细胞技术，转基因技术，动物克隆，性别控制，嵌合体技术胚胎移植：是指将一头良种母畜配种后的早期胚胎取出，移植到另外一头或数头同种的、生理状况相同或相似的母畜生殖道的适当部位，使之继续发育成新个体的过程。
胚胎分割技术：通过对胚胎进行显微操作，将一枚胚胎用显微手术等方法分割成二分、四分甚至八分胚，经体内或体外培养,然后移植入受体中，以得到同卵双生或同卵多生后代的技术。
其理论依据是早期胚胎的每一个卵裂球都具有独立发育成个体的全能性胚胎冷冻：胚胎的冷冻保存，是将胚胎贮存在－196℃，超低温下长期保存的方法。
胚胎的冷冻方法大体分为常规冷冻方法（慢速冷冻法）和玻璃化冷冻法两种。
胚胎干细胞技术：胚胎干细胞（embryonic stem cells，ES细胞）主要来自囊胚的内细胞团、早期胚胎的种细胞或胎儿的原始生殖细胞。
转基因技术：转基因动物就是用实验室方法将人们需要的目的基因导入动物的受精卵，使外源基因与动物本身的基因整合在一起，并随细胞的分裂而增殖，在动物体内得到表达，并能稳定地遗传给后代。
动物繁殖调控技术+
相关延伸技术（胚胎冷冻、性别鉴定、胚
胎分割、胚胎嵌合、细胞核移植和基因导入 等）
一、人工受精技术
（Artificial Insemination,AI）
1、历史研究 1780年，意大利Spallanzani首次用犬进行人工受精，获得 成功; 1899年，俄国伊万诺夫进行马和牛的AI工作，将犬的假 阴道改进成了马、牛、羊用假阴道，并研究精液处理方 法，使AI技术进入实际应用阶段; 1951年，英国人Polge等将甘油用于-79℃超低温冷冻保存 牛精液并输精，同年产下世界第一头冷冻精液牛犊; 1952年，Polge又发表了用经液氮在-192℃保存9个月鸡精 液的受精卵孵化出了雏鸡的报告
二、MOET技术
3、受体同期发情处理
同期发情是利用某些外源激素人为控制并调 整一群母畜发情周期的过程,使之在预定的时 间内集中发情,以便有计划地合理组织胚胎移 植所进行的同期化处理方法,也称同步发情。 当前常用的激素药物有PMSG、GnRH、LHRH、 FSH、LH、hCG、PGF2α 、P4及类似物等。在牛上 常 用 二 次 PGF2α , 一 般 注 射 后 36-48h, 有 45% ～ 60%母牛均表现发情。
动物繁殖调控技术
人为地调控动物的 生殖活动，提高动物生 产的效益和质量，使之 适合于人们经济发展与 维持生态平衡的需要， 要求人们加速发展经济 动物、观赏动物及保护 濒危动物，这些促进了畜牧兽医工作者对动物生 殖进行有效了调控，充分发挥动物的生殖潜力， 提高繁殖效率，使之进一步满足人民生活在社会 发展的需求。
二、MOET技术
2.2人工授精
两次授精,以增加获得受精卵母细胞的机会。 动物一般在停药后24-48h内有95%的母畜均表现 发情。一般上、下午各输1次, 因母畜为超排处 理.有多个卵子排出，而需加大输精量.用原精的 0. 2 ml(含4亿精子)/次。如第二次授精时供体 牛仍处于发情状态,则须在8～12h后再进行第三 次授精。
畜禽细胞与胚胎冷冻保种技术规范NYT1900-2010
畜禽细胞与胚胎冷冻保种技术规范 NY T 1900-2010ICS 65.020.30B 43 NY中华人民共和国农业行业标准NY/ T 1900-2010畜禽细胞与胚胎冷冻保种技术规范Procedures for cell and embryo cryopreservation of domestic animals 2010-07-08 发布 2010-09-01 实施中华人民共和国农业部发布NY/T 1900-2010前古目本标准遵照 GB/T 1. 1-2009 给出的规则起草。
本标准由中华人民共和国农业部畜牧业司提出。
本标准由全国畜牧业标准化技术委员会(SAC/TC 274)归口。
本标准起草单位:全国畜牧总站。
本标准主要起草人:xiJ丑生、王志刚、赵俊金、史建民、孟飞、于福清、孙飞舟、邱小田。
INY/T 1900-2010畜禽细胞与胚胎冷冻保种技术规范1 范围本标准规定了用于保种的家畜精液、家畜卵母细胞、家畜胚胎和畜禽成纤维细胞冷冻保存技术要求。
本标准适用于家畜精液、家畜卵母细胞、家畜胚胎和畜禽成纤维细胞等遗传物质冷冻保存和检验人库。
2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。
凡是注日期的引用文件，仅注目期的版本适用于本文件。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB 4143 .牛冷冻精液GB 20557 山羊冷冻精液NY/T 1234 牛冷冻精液生产技术规程NY/T 1674 牛羊胚胎质量检测技术规程3 术语及定义下列术语和定义适用于本文件。
3. 1超低温保存 cryopreservation在液氮中冷冻保存遗传物质的技术。
3. 2卵母细胞 oocyte来源于有腔卵泡具有繁殖能力的细胞。
3. 3成纤维细胞 fibroblast以畜禽组织或胎儿为材料，体外培养、分离出的梭形或不规则形细胞。
胞质近中央处有椭圆形胞核，胞体→般铺展很开，细胞之间排列疏松，有较大细胞间隙。
卵母细胞的冷冻技术概要
三、实验
⑴冷冻方法与保护剂对牛卵母细胞解冻后细胞 发育的影响
1.卵母细胞的采集与成熟培养
非渗透性冷冻保护剂不能透过细胞膜，但可以增加细胞外溶 质浓度，在细胞膜内外形成渗透梯度，吸引细胞内水分外流， 使细胞脱水。 各种冷冻保护剂都各有千秋，需要按一定比例混合使用， 以加强效果。冷冻保护剂的浓度很重要，它决定了细胞脱水 的速率。
一、冷冻技术概述
2.细胞损伤假说
冷冻损伤是卵母细胞冷冻保存的主要障碍，有报 道认为冷冻常会使细胞膜，透明带发生变化，细胞骨 架被破坏，染色体出现异常等。
现在关于冷冻损伤有两个假说： ①胞内冰的形成，这是过快冷却所产生的，冰晶 会刺破细胞器，破坏细胞膜，造成冷冻损伤，因而冷 却速率越快，此损伤越大；
一、冷冻技术概述
②“溶质损伤”，也叫“溶液损伤”，这 是由过慢冷却所产生的，它使细胞在高浓度的 溶液中存在的时间过长而发生细胞失水，造成 了不可逆的的损伤，因而冷却速率越慢，此损 伤越大。
二、卵母细胞的冷冻保存研究
1.2冷冻保存方法
由于慢速冷冻冷冻与超快速冷冻方法都需要昂贵的 程序化冷冻仪，推广应用并不广泛。现在常用快速冷 冻方法即玻璃化法冷冻。朱士恩等应用OPS法玻璃化 冷冻牛的卵母细胞，得到了很高的囊胚率，成功提高 了冷冻效率。
Open pulled straw（OPS）： 用酒精灯将0．25mi塑料 细管加热拉成OPS管。保证OPS管壁内径0．8～1．0mm，管 壁厚度约0．08mm即可。冷却后用刀片将其切开，细端长度 保持在2cm左右。
胚胎及卵母细胞的冷冻保存技术
在使用冷冻保护剂时，需要严格控制浓度和暴露时间，以避免对细胞造 成毒性和其他不良影响。
冷冻和融化过程
冷冻过程是在极低温度下将胚胎或卵母 细胞快速冷却到玻璃态的过程。在这个 过程中，细胞内的水分子被固定在玻璃 态中，形成一种类似玻璃的结构，从而
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温度变化引起的渗透压变化
在冷冻和复苏过程中，温度的快速变 化可能引起细胞内外的渗透压变化， 导致细胞损伤。
前景展望
新型冷冻保护剂的开发
随着科学技术的发展，新型的、对细胞毒性更小的冷冻保 护剂正在被不断开发出来，这将有助于提高细胞的存活率 和功能。
3D打印技术的结合
3D打印技术可以用于制造具有复杂结构的生物材料，这 些生物材料可以用于模拟细胞生长的三维环境，提高细胞 的存活率和功能。
• 步骤：玻璃化冷冻法包括预处理、玻璃化、解玻璃化和复苏等步骤。预处理阶 段与慢速冷冻法相似；玻璃化阶段会快速将细胞降至-196°C；解玻璃化阶段会 快速升温至适宜温度；复苏阶段同样进行恢复培养。
• 优点：玻璃化冷冻法降温速度快，避免了冰晶形成对细胞的损伤，因此能够提 高胚胎及卵母细胞的存活率。
• 缺点：玻璃化冷冻法操作难度较大，需要使用特殊的设备和试剂，成本较高， 且仍存在一定的细胞损伤和突变风险。
卵母细胞冷冻保存
总结词
卵母细胞冷冻保存技术是一种新兴的生 殖技术，通过低温保存卵母细胞，延长 其存活时间，为女性生育力的保存提供 了可能。
VS
详细描述
随着辅助生殖技术的发展，越来越多的女 性选择通过卵母细胞冷冻保存技术来保存 自己的生育力。这种技术通过将卵母细胞 置于低温下，使其进入休眠状态，以便在 未来需要时进行复苏和受精。这种技术为 女性提供了更多的生育选择和机会，尤其 适用于那些需要进行化疗等治疗的女性患 者。
山羊卵母细胞冷冻保存技术研究
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中图 分 类号 ：￥ ２ ．５ ８７３ 文 献标 志 码 ：Ａ 文章 编 号 ：１ ０ — ３ ９ ２ １ ）９ ０ ０ — ６ ０ ５ ９ ６ （ ０ ２０ — ０ ０ ０
Ｓｔｄ ｎ ｃｙ ｐ ｅ ｅ ｖ ｔ ｎ ｔ ｃ ｎ ｏ ｙ ｏ ｏ ｔｏ ｃ ｔ ｓｘ ａｎ ｇ Ｈ Ａ Ｇ ｕ ｙ ｏ ｒｏ ｒ ｓ ｒａ ｉ ｅ ｈ ｏｌｇ ｆｇ ａ ｏ ｙ ｅ ／ｕＤ ｎｉ ， Ｕ Ｎ ｏ ｎ
收 稿 日期 ：２ １－ ２ ２ ０ １ １－ ０
基金项 目： 农业部公益性行业 （ 奶山羊 ） 科研专项 （０ １３ ３ ） ２ １０ ０ ８ 作者简介 ：许丹 宁（９ ８ ） １７ 一 ，女 ，副教授 ，博士 ，研究 方向为动物 营养及生殖生理。Ｅ ｍ ｉ ｘ ａｎｎ ＠１６ ｃｒ — ａｌ ｄｎ ｉｇ ２ ．ｏ ： ｎ 通讯作者 ：田允波 ，教授 ，博士生导师 ， 研究方 向为动物生殖生理及繁殖生物技术 。Ｅ ｍ ｉ ｔ ｎ ｏ ２ ．ｏ — ａ ： ｕ ｂ＠１６ ｃｒ ］ｙ ｎ
第五章 动物细胞冷冻与保存
• （2）玻璃化冷冻方法 • ① 一步玻璃化冷冻：乙二醇+高分子聚蔗糖+渗透压 较高的蔗糖配成7.5mol/l浓度的EFS40，20℃条件下 镜胚胎直接装入含有玻璃化溶液的塑料细管中，平 衡2min后入液氮。 • ② 采用乙二醇或甘油以及乙二醇和DMSO为主体抗 冻保护剂配成EFS、GFS、EDT玻璃化溶液，在室 温20~25℃条件下，先将胚胎在10％乙二醇溶液中预 处理5min，然后移入上述玻璃化溶液的细管中，平 衡30s后将细管封口，入液氮。 • 解冻：空气中停10~15s，然后在20~25℃水浴解冻。
（三）复温速率
•
一般来说，复温速率越快越好，采用快速升 温的方法使细胞吸收水分，结构不受影响而复苏。 当复温速率在100℃/min以上时，对细胞的损伤 最小；当复温速率在0～10℃/min时，复温到50℃左右时，若不快速通过此温区，可引起冰的 再结晶，使细胞内原有的小冰晶重新结晶为大冰 晶，更加重了溶质损伤（盐害）。 • 方法：将冷冻细胞从液氮中取出，立即投入 到37 ℃水浴锅中融化即可。
• 渗透性：降低冰点,延缓结冰;提高质膜通透性,使水分 快速渗出,减少冰晶形成. • 非渗透性：在一定温度下，可使溶液结冰的部分缩 小，从而降低细胞内和外溶质的浓度。 • DMSO是目前最常用的冷冻保护剂，常温下对细胞 毒性作用较大，而4 ℃下其毒副作用大为减弱，因此冻存 时细胞在4 ℃ 下DMSO(5%-10%)中平衡40-60分钟。 DMSO无须灭菌处理，也不适合高压灭菌或滤膜过滤。
• 玻璃化冷冻 • 指高浓度的冷冻保护剂在快速降温过程中， 形成一种极其粘稠的、介于液体和晶体之间的 “玻璃态”，而无任何形式的冰晶形成，从而 避免了因结冰而导致的各种损伤。 玻璃化冷冻多在胚胎冷冻中使用。 • 不同种属及同一种属不同类型的细胞对冷 冻的敏感性不同，所以所需冷冻速率也不同。 绝大多数细胞的冷冻致死温度在-5～-60℃， 一般在-20～-40℃为致死敏感区域。
小鼠卵母细胞冷冻保存技术研究进展
细胞能体外成熟 ， 但体外受精后仅 ９ ～１． ％发 状 态 ， ７３ 细胞将 不会 受到 损伤 。
． 育 到两 细胞 。１９ ９４年 ， 低 温冷 冻 保 存 小 鼠 Ｇ 期 １ ２ 解 冻对 细胞 的作 用 超 Ｖ
卵母 细胞 的研 究 取 得 了突 破 ， 获得 了后 代 。本 文 并
０ 剩 ０ 鼠卵母 细胞 ， 体外 受精 胚胎 移植 后产 仔率 达４ ． 。 温 度之 前失 去 ９ 的水分 ， 下 １ 的边界水 的结 ５８
与成熟 卵母 细胞 相 比， 成 熟 卵母 细 胞 的冷冻 更 为 冰 机率 可忽 略不 计 。冷 冻 过 程 中 ， 未 细胞 内形 成冰 晶 其关 键 是 冰 晶 的 大小 。 只要 不形 成 困难 。１ ９ 年 ， ｃｒｅｅ 等用不 同方法冷冻保存 是 不 可避免 的 ， ９０ Ｓ ｈｏｄ ｒ 而是维持在微 晶 小 鼠生发泡 期 （ ＧＶ） 的卵母 细胞 ， 冻后 大部分 卵母 对细胞造成物理性损害 的大冰晶， 解
解 冻速度 取 决 于冷 却 时 细 胞 内水 分 的含 量Ｌ 。 ６ ］
０ － ０℃之 间终 止 ， 细胞 将 从小 鼠卵母细 胞 的保 存 原 理 、 冻 保 护 剂 的作 用 如 果细 胞慢 速冷却 至 一３ ～－４ 冷 解 避免小 冰 机 理 、 冻方 法 的原 理及 卵母 细 胞 冷 冻保 存 方 法 等 内形 成一 定量 的冰 晶 ， 冻速度 必须 较快 ， 冷
起来 的另一项很有潜力 的繁殖技术Ｌ ， １ 能够为体外 内向细胞外渗透 ， ］ 并继续在细胞外结冰 ； 如果细胞被 受精 、 核移植 、 转基因动物研制等胚胎工程技术提供 冷却过慢 ， 大量水分由细胞 内流向细胞外 ， 降低了细
更方 便和 更多 的材料 来 源 。小 鼠是 现 阶段最 主要 的 胞 膜 内外 的化学 势能 ， 造成 细胞 内进行性 脱水 ， 因此 实验 动物 ， 对其 卵母 细胞 冷冻 保存 的研 究 开 始 于 ２ 细胞 内不 可能形 成 冰 晶。相 反 ， 果 细胞 被 冷却 得 ０ 如 世纪 ５ ０年代 ［ 。１７ 年 ， ｉｉｇ ａ 。首 次报 道 过 快 ， ９ ７ Ｗｈｔ ｎ ｈｍ［ ｔ ］ 细胞 内的水 分不 能及 时流 出 ， 达不 到细胞 内外
第五章 动物卵母细胞与胚胎冷冻保存技术
一、卵母细胞和胚胎在低温冷冻保存过程中的 受损机制
卵母细胞的冷冻保存技术来源于胚胎冷冻保存 ，由于细胞自身所具有的一系列特殊性质，因 而冷冻保存的难度较大。 在冷冻保存及复温过程中易受到一系列的损伤 ，主要包括在以下几个方面：
（二）胚胎冷冻保存的发展概况 胚胎的冷冻保存开始于1972年， 由Whittingham 首次在小鼠上取得成功。
此后，国外在牛（Wilmut等，1973）、绵羊
（Willadsen等，1974）、山羊（Bilton等，1976） 和马（Ramamato等，1982）等动物的冷冻胚胎移 植方面相继取得成功。
储存于液氮内的细胞，需要解冻到常温后才 能应用。若升温的速度不够快，储存的细胞 从液氮温度回升到成核温度时，细胞会从周 围吸热，热力学发生变化后出现再结晶现象 ，即发生所谓的“去玻璃化”现象。 去玻璃化过程有两种类型： 一种是原来降温过程中形成的微小冰核在升 温的过程中形成冰晶； 另一种是没有微小冰核的标本中在复苏的过 程中形成冰核并结晶生长。
5、冷冻保护剂化学毒性损伤 当卵母细胞或胚胎移入冷冻保护剂液平衡时 ，随着时间的延长和浓度的升高，生存率下 降。造成这个结果的原因是冷冻保护剂中渗 透性冷冻保护剂的化学毒性作用。 冷冻过程中渗透性冷冻保护剂渗入细胞，影 响和改变细胞内超微结构和大分子物质的结 构和功能，间接引起高级结构的破坏。毒性 表现在引起细胞膜变脆或破裂、透明带硬化 、微管及微丝聚合或解聚、染色体和DNA损 伤等。
6、低温损伤 卵母细胞和胚胎对温度的降低极为敏感，在温度 高于冰点，细胞内外均无冰晶形成的情况下，仍 会造成细胞的损伤。 不同哺乳动物的细胞在低温保存过程中都会受到 一定的低温影响，特别是脂质含量较多的猪卵母 细胞和牛卵母细胞。 这种由于温度低于正常温度所造成的细胞损伤被 称为低温损伤。这种损伤很大程度上取决于温度 的变化。造成这种损伤的机理可能是的低温引起 膜脂肪相的变化，从而影响细胞的新陈代谢。 低温损伤与细胞质内脂肪颗粒的含量有关，如猪 和牛卵母细胞及早期胚胎此现象由为突出，其他 哺乳动物脂肪含量较少，受低温损伤影响不大。
家畜繁殖学教学大纲(新)
《家畜繁殖学》教学大纲课程名称:家畜繁殖学课程类型:选修课学时：48学时（其中理论教学32学时；实验教学16学时）适用对象:动物科学先修课程：家畜解剖学、组织胚胎学、家畜生理学、动物生化.一、课程性质、目的与任务以及对先开课程要求本课程是畜牧专业本科生必修的一门专业基础课程。
是理论密切联系实际的学科,是实践性很强的一门课程。
本课程的目的要求是使学生能够掌握和运用家畜的生殖生理普遍规律去指导家畜的繁殖实践;使学生掌握现代繁殖技术及其基本的操作技能训练；培养学生综合运用多学科知识、为提高畜群繁殖力和改进畜群品质而工作的能力。
为达到上述目的要求，教师要认真备课，不断更新和修改教案.学生上课认真听讲，并做笔记，课下要及时复习。
二、教学重点及难点本课程的重点是生殖激素部分和公母畜的生殖生理部分。
讲述繁殖技术时，应着眼于繁殖技术的基础理论。
（一）生殖激素要求学生明确下丘脑——垂体——性腺轴对生殖机能调节的概念.明确自上而下的调节控制和自下而上的反馈作用，掌握主要生殖激素的互相关系.重点掌握两种神经激素（GnRH和催产素)、四种促性腺激素（FSH、LH、PMSG和HCG）、三种性腺类固醇激素(雄激素、雌激素和孕激素）、F和E型前列腺素（PGF2和PGE）的产生部位、化学结构和化学性质、生物学作用、互相关系、应用范围以及相应合成类似物的化学结构和功用。
（二)雄性动物的生殖生理要求学生了解公畜性成熟的生理特性和影响因素、了解公畜性行为链,如何利用这些知识提高公畜的利用效果。
了解精子发生过程和特点,精子产生的速度,正确掌握采精频率.了解附睾的功能，认识精子的显微和显微结构。
重点掌握精液中特有化学成分及其功用，精液的理化特性和精子的生理特性，为人工授精技术奠定理论基础。
（三）雌性动物的发情要求了解母畜的初情期、性成熟的生理特征及其影响因素.了解卵子发生的特点及其同卵泡发育的关系，掌握生长全过程中各级卵泡的形态和生理特征。
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2、细胞外冰晶损伤
慢速冷冻时，冰晶首先在细胞外形成。细胞外 液冰晶形成后，使得溶液中离子浓度的升高， 对细胞产生了离子影响，此损伤又称盐损伤。
随着更多冰晶的产生，使溶液逐渐浓缩，溶液 的浓缩对细胞的影响越来越大，此现象被称为 溶液效应又称为化学损伤。
冷却的速度越慢，则浓度越高，对卵母细胞的 作用时间也越长，对卵母细胞膜蛋白复合体造 成的伤害也越大。这主要是由于细胞内外的电 解质浓度增高，导致细胞膜蛋白复合体的破坏 和核膜的降解。
单细胞，胚胎为多细胞，受精卵随第二极体 的排出，新陈代谢逐步加强）母细胞和胚胎在低温冷冻保存过程中的 受损机制
卵母细胞的冷冻保存技术来源于胚胎冷冻保存， 由于细胞自身所具有的一系列特殊性质，因而 冷冻保存的难度较大。
在冷冻保存及复温过程中易受到一系列的损伤， 主要包括在以下几个方面：
快速冷冻时，由于降温速率快，结晶时的冰晶 核较多，从而形成数目多且体积小的冰晶，对 细胞造成的损害较小。
如果解冻时采取快速复温，则细胞仍能存活 ，但若在解冻过程中，在温度较高的区域（ 如-40℃或更高）经历较长时间或进行慢速复 温，则会产生重结晶现象，即细胞内小冰晶 重结晶成大冰晶，从而机械性的破坏细胞的 超微结构而造成细胞的致命损伤。
目前，欧、美、日、加等国有上百家胚胎移植公 司从事牛羊胚胎移植业务。
在国内，牛的冷冻胚胎生产与移植已开始逐步商 业化。
第二节 胚胎与卵母细胞的冷冻保存原理
胚胎与精子细胞结构差异： 胚胎数量极少 胚胎体积比精子大很多(精子为9um,卵子直径为
120um),细胞质多,外包特殊膜—透明带。 胚胎结构结构和新陈代谢过程更为复杂（精子为
1998年，Vajita等首次采用OPS法冷冻牛卵母 细胞取得了成功，体外受精后囊胚发育率达 11％～25％。
2002年Amir等结合微滴法和超低温液氮的方 法，取得了20%的囊胚率并获得一头健康小 牛。
迄今为止，卵母细胞的冷冻保存以小鼠、牛 为主要研究对象，其冷冻方法趋于成熟，冷 冻后的卵母细胞形态正常率、受精率、发育 率及移植后的产仔率等方面均取得了一定进 展。
第一节 卵母细胞与胚胎冷冻保存的意义与发 展概况
一、卵母细胞冷冻保存的意义
(1)哺乳动物卵母细胞的有效冷冻保存是保护 品种资源和拯救濒危动物不可缺少的技术保障 之一。
(2)是加快家畜品种改良和胚胎移植技术产 业化的重要组成部分，可代替活畜进口，不受 时间和空间的限制。
(3)可用于卵母细胞的低温生物学特性和体外 受精机理研究。
牛卵母细胞冷冻的研究主要集中在玻璃化方 法的应用和寻求减少冷冻液体积和加快降温 速率的方法上，在低温生物学机理和探讨冷 冻损伤的机理方面做的还不够，因此，卵母 细胞的冷冻保存条件及低温生物学特性等方 面还有待进一步研究。
二、胚胎冷冻保存的意义与发展概况
（一）胚胎冷冻保存的意义
为建立优良的动物胚胎库和基因库提供了条件；
储存于液氮内的细胞，需要解冻到常温后才 能应用。若升温的速度不够快，储存的细胞 从液氮温度回升到成核温度时，细胞会从周 围吸热，热力学发生变化后出现再结晶现象 ，即发生所谓的“去玻璃化”现象。
1、细胞内冰晶损伤
胚胎与精子相比，含水量较高，而在冷冻过程 中，有90 ％的水分形成游离水，而游离水易形 成冰晶，从而破坏蛋白质的硫氢键，发生不可 逆变化，导致细胞死亡。
在胚胎及卵母细胞冷冻过程中，当温度降低到 冰点以下，在细胞外液内液都有冰晶产生，使 细胞受到致命性的损伤（物理损伤），这个因 素也是胚胎及卵母细胞冷冻保存的关键。
章动物卵母细胞与胚胎的冷 冻保存技术
目录
第一节 卵母细胞与胚胎冷冻保存的意义与 发展概况
第二节 胚胎与卵母细胞的冷冻保存原理 第三节 胚胎与卵母细胞的冷冻保存方法
卵母细胞与胚胎的冷冻保存：是采取
特殊的保护措施和降温程序，是卵母细 胞或胚胎在-196℃条件下停止代谢，使 细胞处于新陈代谢和分裂速度停止，即 使其发育基本处于暂时停顿状态，而升 温后又不失去代谢恢复能力的一种长期 保存胚胎和卵母细胞的技术。
3、破裂损伤
采用常规法冷冻的卵母细胞或胚胎解冻 后可见到透明带破裂，这主要是由于物 质的膨胀率和收缩率不同，这种现象被 称作破裂损伤。
由此可见，破裂损伤往往发生在液相和 固相急速转化的过程中。
因此，慢速冷冻时缓慢通过冷冻液变相 温度区域非常重要。慢速解冻法通常是 以4～25℃/min的速率使胚胎由冷冻保存 温度逐渐升至室温。
胚胎的冷冻保存开始于1972年， 由Whittingham 首次在小鼠上取得成功。
此后，国外在牛（Wilmut等，1973）、绵羊 （Willadsen等，1974）、山羊（Bilton等，1976） 和马（Ramamato等，1982）等动物的冷冻胚胎移 植方面相继取得成功。
在国内，绵羊、兔、牛、山羊等动物冻胚移植也 均获得成功。
可使因疾病、天灾或战争等其他原因丢失的各 种动物品种、品系和稀有突变体得以保持；
可以控制品种内的遗传稳定性和维持某些近郊 系动物的遗传一致性，节约大量时间和资金；
家畜胚胎库的建立可实现简便廉价的远距离运 输胚胎，以代替运输活畜，节约运输和检疫成 本；
减少因活畜运输而传播疾病的机会，促进了国
（二）胚胎冷冻保存的发展概况
(4)通过冷冻保存卵母细胞，不但可以建立雌性 动物的基因库，还可以充分利用丰富廉价的卵 母细胞资源，使体外受精、转基因及克隆等技 术的研究应用不受时间和地域的约束。
(5)在医学方面，人卵母细胞的冷冻保存可以克 服胚胎冷冻保存所引起的伦理道德以及法律上 的问题，为那些接受化疗、放疗或由于其它病 理原因而过早摘除卵巢或输卵管堵塞病人提供 怀孕的机会。
二、卵母细胞冷冻保存的发展概况
卵母细胞的冷冻保存开始于1976年。
1977年，Whittingham首次成功地冷冻保存了 小鼠的成熟卵母细胞，受精后获得了后代。
随后，Al-Hasan等对兔卵母细胞冷冻保存后 受精，移植后也得到了后代。
家畜的卵母细胞冷冻保存主要集中在牛上， Lim等首次成功冷冻保存了牛的卵母细胞，且 第一头超低温冷冻保存的卵母细胞产生的牛犊 出生于1992年。