薯蓣多糖的高碘酸氧化Smith降解及甲基化结果分析
山药多糖的结构鉴定
山药多糖的结构鉴定摘要：本实验对新鲜山药分离纯化得到的多糖进行结构表征。
通过对山药多糖的结构分析，为进一步利用山药开发医药、保健食品提供基础。
通过标准曲线分析得到山药多糖的糖醛酸含量为12.0%，乙酰基含量为18.5%。
傅立叶红外光谱结果分析表明多糖中含有糖醛酸，与化学法分析结果一致。
气相色谱-质谱联用分析结果显示山药多糖是由两种单糖组成的杂多糖，分别为葡萄糖和半乳糖，且摩尔比为1.52：1。
将样品甲基化后进行GC-MS分析得到3种类型的残基组成，分别为1,3-葡萄糖残基、-1-半乳糖残基、-1,6-半乳糖残基。
关键词：山药多糖；结构；仪器分析STRUCTURAL CHARACTERIZATION OF POL YSACCHARIDE FROM CHINESE YAMAbstract: The structure characterization of polysaccharide from Chinese Yam was analyzed in this study, which can support further development as healthcare food and pharmaceuticals in the future. The main contents and results are as follows: The chemical analysis results showed that the pure polysaccharide contained 12.0% uronic acid and 18.5% acetyl. Fourier infrared transformation analysis showed that the purified polysaccharide had the characteristic absorptive peaks, and that it contained uronic acid. Based on methylation and GC-MS analysis, the purified polysaccharide was composed of glucose and galactose with a molar ratio of 1.52:1, mainly including 1,3-linked-glc, 1-linked-gal and 1,6-linked-gal.Keywords: Yam polysaccharide; structure; instrumental analysis1．引言1.1 研究背景及意义山药是薯蓣属植物的地下块茎。
食物中多糖组分的结构表征与活性功能研究进展
食物中多糖组分的结构表征与活性功能研究进展聂少平黄丹菲殷军艺谢明勇*（南昌大学食品科学与技术国家重点实验室南昌330047）摘要多糖作为高等植物、动物细胞膜及微生物细胞壁组成部分的天然大分子物质，与诸多生理功能密切相关。
现代科学研究表明，多糖在生物体中参与了生物合成反应以及多种生命现象和生理过程。
多糖研究已成为继蛋白质、核酸研究之后探索生命奥秘的又一个重大前沿课题。
多糖的生物学研究非常复杂，其活性功能的分子基础和机理尚不清楚。
本文综述了多糖研究的历史，食物中多糖组分的结构表征方法与研究现状，食物中多糖的活性功能研究方法与现状，并对未来食物中多糖研究的热点和发展方向进行了探讨。
关键词食物；多糖；结构表征；活性功能文章编号1009-7848（2011）09-0046-12多糖（polysaccharides ）为高等植物、动物细胞膜及微生物细胞壁组成部分的天然大分子物质，是由醛基和酮基通过苷键连接的高分子聚合物，也是构成生命的四大基本物质之一[1]。
糖类的生命科学几乎与蛋白质的生命科学同时诞生。
然而由于其结构的复杂性和研究手段的局限性，多糖的研究始终滞后于蛋白质和核酸的研究。
早在100多年前，德国著名科学家E.Fischer 就开始糖类物质的研究；20世纪50-60年代对多糖的研究仅限于化学组成和一般结构测定；从70年代开始，糖化学和生物化学两个传统专业的结合使多糖的细胞和分子生物学研究成为可能，多糖的研究也得以复兴。
1988年牛津大学R.A.Dwek 教授首先提出了“糖生物学（Glycobiology ）”这一概念，标志着一个新的研究领域的诞生，即以生物大分子组成部分糖链或（寡、多）糖本身为对象，以糖化学、免疫学及分子生物学等学科为基础，研究多糖或糖链作为“生物信息分子”在多细胞高层次生命中的功能的科学[2]。
而将糖生物学推向生命科学前沿的重大事件发生于1990年，有3家实验室同时发现血管内皮细胞-白血球粘附分子I ，后来改称为E-选凝素。
多糖化学结构鉴定方案总结
经过分级纯化的多糖在测定结构前须检查其纯度及测定分子量。
检查纯度最常用的判断方法：（1）用G C 、HPLC测定组成多糖的单糖的摩尔比是否恒定。
用不同的柱型测定结果更为可靠。
（2）电泳只出现一条带。
如可用聚丙烯酰胺凝胶电泳、乙酸纤维素薄膜电泳及玻璃纤维纸电泳。
对于中性多糖可采用高压电泳，以硼酸盐为缓冲液，可增大其迁移速度。
（3）凝胶柱层析图呈现对称的单峰。
若有“拖尾”现象，说明其均一性不够好。
阴离子交换层析纯化用DEAE一纤维素52(2.6x100cm)柱层析,0.lmol/LNaCl洗脱,流速6ml/h,按2ml一管分部收集,苯酚一硫酸法逐管检测,绘制收集体积与糖含量之间的关系曲线。
看是否有单一对称峰。
按照Ye等报道,采用DEAE一52一纤维素交换柱层析法(2.6x30cm)对鲍氏层孔菌菌丝体粗多糖进行初步分离。
DEAE一纤维素凝胶预处理:称取DEAE一52一纤维素凝胶干粉,加入约10倍体积质量比(ml/g)的0.5mol/LNa0H溶液浸泡30分钟,倒出上清液,用大量去离子水反复浸洗至pH值近中性;再用相同体积的0.5mol/LHCI溶液浸泡30分钟,倒出上清液,用大量去离子水反复浸洗至pH值近中性;最后用相同体积的0.5mol/lNaOH溶液再浸泡30分钟,用大量去离子水反复浸洗至pH值中性。
处理完毕后,进行湿法装柱,用去离子水0.5mol/LNaCl溶液,去离子水依次分别平衡(流速1.0ml/min)2一3个柱体积备用.糖样100mg溶于5ml的去离子水中,离心除去不溶物,上样于DEAE一52一纤维素阴离子层析柱(2.6x30cm,Cl-1型),分别采用去离子水0.1和0.3mol/LNaCI溶液进行分段梯度洗脱,流速1.0ml/min,自动收集器分部收集(10ml/管),每梯度20管。
用硫酸一苯酚法跟踪检测各管多糖含量(490nm处吸收值),以收集的管数为横坐标。
吸光值(490nm)为纵坐标绘制DEAE 一52一纤维素色谱柱洗脱曲线。
多糖成分分析综述
多糖成分分析摘要：对多糖的提取、分离纯化、含量分析以及组分结构分析的研究进展进行了综述，并对其应用前景进行了展望。
多糖的组分分析是多糖质量控制和提供多糖基本信息的重要环节。
关键词：多糖；提取；分离纯化；表征鉴定多糖(polysaccharides,PS)又称多聚糖，由10个以上的单糖分子通过苷键聚合而成，其分子量较大，一般由几百甚至几万个单糖分子组成，是除了蛋白质和核酸以外的一类重要的生物大分子。
虽然糖类的研究并不比蛋白质和核酸晚，但其研究层次与水平还远远落后于蛋白质和核酸。
多糖在自然界高等植物、动物、藻类及细菌类内均有存在，分布极广。
有些多糖无生物活性，如淀粉、树胶和粘液质等，通常被当做杂质除去。
而具有药效作用的多糖大多是活性多糖。
1969年，日本学者千原率先证实了香菇热水提出物的抗肿瘤活性，羽田、佐木进一步研究证实有效成分是香菇多糖。
自此，全世界掀起了从真菌中提取抗肿瘤活性成分的热潮[1]。
尤其近年来，随着生物学、化学等相关学科的飞速发展，多糖化合物也得到了日益深入的研究。
国际科学界视多糖的研究为生命科学的前沿领域，甚至提出21世纪是多糖的世纪。
鉴于多糖研究所具有的学术价值和广阔的应用前景，使得多糖研究成为人们关注的研究热点之一；又目前研究比较多的是植物多糖和微生物多糖，因此本文将就植物多糖和微生物多糖的成分分析研究进行概括、总结，并就存在的问题加以展望。
1 多糖的提取多糖的提取通常要根据多糖的存在形式及提取部位不同决定其提取方法。
一般从植物中提取多糖，先用石油醚、乙醚、丙酮等有机溶剂进行预处理，除去脂溶性杂质[1]。
然后根据不同的溶解度选择一种溶剂进行萃取，常用的为水、稀盐、稀酸、稀碱等溶剂。
传统的提取方法有水提醇沉法、稀碱浸提法、稀酸浸提法和酶法等，随着对多糖研究的不断深入，又出现超滤法、微波辅助浸提法以及超声波法等等。
1.1 溶剂提取法溶剂提取法是提取多糖的常用方法，利用多糖不溶于乙醇的性质在提取液中加入乙醇使多糖沉淀出来。
多糖结构分析
一：多糖中的单糖组分分析一般对多糖进行完全水解，水解条件：封管0.5~3M硫酸或1~6M盐酸，80℃~100℃水解2.5~8h 即可。
或控制水解条件，进行逐步水解，如封管0.025M硫酸，100℃水解15min，30min，45min 等，水解液用碳酸钡或氢氧化钡中和，滤液浓缩后可用纸层析、薄层层析、气相层析或高压液相层析等鉴定。
二：相邻单糖基连接方式分析将甲基化多糖水解得到甲基化的单糖，而此单糖上甲基化之羟基所在的碳原子就是连接键所在。
高碘酸氧化是定量反应，Smith降解是将高碘酸氧化产物进行还原，酸水解或部分水解，从高碘酸的消耗量和不同产物的生成，便可进行糖苷键位置的判断-产物中若有一分子比例的甲酸生成而消耗两分子比例的高碘酸根时，表明多糖的非还原末端或非末端部分有1-6苷键相连的单糖基存在；产物中若有赤藓醇生成，则提示有1-4结合苷键；若有甘油生成，有1-6、1-2结合的苷键或有还原性末端葡萄糖基等；若产物中能检出单糖，如葡萄糖、半乳糖、甘露糖等，则有1-3苷键存在。
结合¹³C-NMR确定连接位置。
三：端基碳苷键构型分析1：酶解实验：不被淀粉酶水解的多糖，无α-苷键，与纤维素酶有作用者，存在β-苷键。
2；IR：α-型差向异构体的C-H键在844±8cm‾¹处有一个吸收峰；β-型的C-H键在891±7cm‾处有一个吸收峰。
但是，海藻糖、阿洛糖和异阿洛糖的α-型和β-型同时存在的情况下，就不能以次来判断。
3：¹H-NMR：端基碳的δ值大于5.00ppm者，糖苷键为α-型，小于5.00ppm者，则为β-型。
4；¹³C-NMR：α-型连接的C₁化学位移在97-101ppm，β-型的在103~105ppm。
对甘露聚糖不能用化学位移判断α-型或β-型。
可用裂分常数决定，一般¹Jｃ-ｈ=170HZ，为α-型，160HZ 者为β-型。
植物多糖的结构及药理活性进展
安晓娟，冯琳，宋红平，李师翁* （ 兰州交通大学化学与生物工程学院，兰州 730070）
摘要：目的 对植物多糖的结构分析方法及部分药理活性的近年研究进展进行综述。方法 对近年来国内外相关研究文
献进行分析和归纳。结果与结论 植物多糖结构分析的主要方法包括气相色谱法（ GC） 、液相色谱法（ HPLC） 、红外光谱法
食品、保健品和药品。先进分析方法的应用必将使植物多糖的研究更加深入，许多新的植物多糖及其药理功能也将被发现
和应用。
关键词：植物多糖； 结构分析； 色谱法； 光谱法； 质谱法； 药理活性； 绞股蓝多糖； 黄芪多糖； 龙眼多糖； 灵芝多糖
中图分类号：Q935
文献标志码：A
文章编号：1001 － 2494（ 2012） 16 － 1271 － 05
活性多糖具有一定的相对分子质量范围。研究表明，多 糖相对分子质量太大，不利于其跨越细胞膜进入生物体内发 挥生物学活性，而相对分子质量过低也没有活性。多糖相对 分子质量的测定方法有超速离心沉降速度法、光散射法、端 基分析法、气相渗透法、膜渗透法及凝胶渗透色谱法，目前常 用的是高效凝胶渗透色谱法 （ HPGPC） ［8］，商品柱是 Lonpak 系，Macrosphere 系和 TSK 系柱，前两者用水作洗脱剂，后者 采用缓冲溶液如磷酸盐缓冲液作洗脱剂。高效凝胶渗透色 谱法的特点是设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分 子物质有显著的分离效果，常用于大分子多糖的分析。单糖 组成的测定方法主要有纸层析、薄层层析法（ TLC） 、气相色
基金项目： 国家自然科学基金资助项目（ 30960063） ； 教育部“春晖”计划资助项目（ Z2006-1-6213） 作者简介： 安晓娟，女，硕士研究生 研究方向： 中草药有效成分的提取、分离及纯化 * 通讯作者： 李师翁，博士，男，教授，博士生导师
气相色谱质谱法用于糖类物质结构分析的新方法研究
ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｅｘｃｅｐｔ ｆｏｒ ２，５·Ｍｅ２Ｇａｌ．Ｔｈｅｓｅ ＰＭＡＡｓ ｃａｎ ｂｅ ｕｓｅｄ ａｓ ＧＣ－ＭＳ ｓｔａｎｄａｒｄｓ ｆｏｒ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇａｌａｃｔｏｆｕｒａｎｏｉｃ ｕｎｉｔｓ ｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ，
气相色谱质谱法用于糖类物质结构分析的新方法研究
摘要
气相色谱一质谱法（ＧＣ—ＭＳ）在糖类结构分析中具有重要作用，利用气相色 谱一质谱技术可以得到有关单糖残基的类型、糖的序列、糖环形式和羟基的取代 情况等多种结构信息，本研究开发了两种分甲基化的呋喃半乳糖醇乙酸酯标准（ＰＭＡＡｓ）——半乳糖 在无水氯化氢的催化下，与一分子甲醇作用，生成甲基半乳糖苷混合物，该混合 物经硅醚化衍生后，用气相色谱（Ｇｃ）、气相色谱一质谱研究了氯化氢浓度、反应 时间、反应温度对甲基呋喃半乳糖苷产率的影响。当氯化氢的浓度为Ｏ．００４ｍｏｌ／Ｌ， 反应温度为７０℃，反应时间为４ ｈ时，甲基呋喃半乳糖苷得率为７９．９％。在 ＢａＯ／Ｂａ（ＯＨ）２＂８Ｈ２０的催化下，甲基呋哺半乳糖苷与碘甲烷反应生成部分甲基化 的糖苷混合物，该混合物用ＴＬＣ检测（ＣＨＣｌ２：ＭｅＯＨ １０：１），结果表明：随着 反应时间的延长，甲基化程度越来越高，当反应４ ｈ后，生成了由一甲基、二 甲基、三甲基及四甲基半乳糖苷组成的混合物。该产物经水解、还原、乙酰化后， 得到部分甲基化的糖醇乙酸酯衍生物。经ＧＣ—ＭＳ分析后，根据保留时间与质谱 碎片可以确定我们合成了除２，５一Ｍｅ２Ｇａｌ外其它的部分甲基化的呋喃半乳糖醇乙 酸酯衍生物标准。该标准可用于ＧＣ．ＭＳ分析含呋喃半乳糖结构的糖复合物结构 分析的标准。
08多糖的提取、分离纯化和结构分析
结构分析
一、前言
多糖和蛋白质、基因是生命科学的三大领域，是自 然界含量丰富的物质，也是与人类生活紧密相关的一类 生物高分子。大量研究表明，多糖具有其独特的生物活 性，是许多天然产物的主要活性成分，具有抗菌、抗病 毒、抗肿瘤、抗辐射、抗衰老等功效。多糖的提取、分 离和纯化是研究多糖结构和活性的基础，只有得到相对
多糖的结构分析
3、糖链中糖残基间的连接位置分析
（1）甲基化分析方法：确定糖链中糖基间的连接位置常用 方法。该法首先将多糖链全甲基化，使所有的游离羟基变为
甲氧基。目前最常用的甲基化方法是改良Hakomori法。
Hakomori法先将样品溶于无水二甲基亚砜中，然后与 甲基亚磺酰甲基钠SMSM反应，使得多糖上游离羟基离子化 ，多糖成为阴离子后，易于CH3I反应，该法通常需重复数次 。以α-(1-4)葡聚糖为例说明甲基化过程。
包括离子交换色谱柱和凝胶柱色谱。
特点：分离效率高、设备简单、操作方便、条件温和 、不易造成物质变性等优点。 应用：物质分离纯化、分析鉴定最重要的方法之一； 分离/有机化合物及生物大分子不可缺少的手段。
多糖的结构分析
多糖的结构：
多糖的结构是其生物活性的基础，多糖的结构分析 在多糖的研究中具有非常重要的地位，是糖化学的核心 所在。 与蛋白质、核酸大分子相比，糖链的结构也包括一
端基法、HPLC、黏度法、凝胶色谱法和超滤法等，其中目
前公认较好的方法是高效凝胶渗透色谱（HPGPC）。 高效凝胶渗透色谱又称高效尺寸排阻色谱（ HPSEC） 、高效凝胶色谱，是一种高分子领域的高效分离分析技术， 是研究高分子的分子量及合成高分子分子量分布及与分子线 团尺寸相关的结构、反应、物性的最有效的手段之一。常用 的商品柱有Bondagel和TSK柱系。
糖链的序列测定!!!—Smith降解法
糖链的序列测定—Smith降解法摘要：Smith降解是将高碘酸氧化产物用硼氢化合物(如硼氢化钾或硼氢化钠)还原成稳定的多羟基化合物。
然后进行适度的酸水解，用纸层析鉴定水解产物，由水解产物可以推断多糖各组分的连接方式及次序。
以葡聚糖为例，其反应式如下图：以1→2位键合的糖基经高碘酸氧化，平均每个糖基仅消耗一分子高碘酸，并且无甲酸释放；Smith降解后产生甘油。
以1→4位键合的糖基经高碘酸氧化，平均每个糖基仅消耗一分子高碘酸，并且无甲酸释放；Smith降解后产生赤藓醇。
以1→3位键和的糖基不被高碘酸氧化；Smith降解后仍为原来糖。
以1→6位键和的糖基或非还原末端基（1→6）经高碘酸氧化，消耗二分子高碘酸，同时释放一分子甲酸；Smith降解后产生甘油。
Smith降解是将高碘酸氧化产物用硼氢化合物(如硼氢化钾或硼氢化钠)还原成稳定的多羟基化合物。
然后进行适度的酸水解，用纸层析鉴定水解产物，由水解产物可以推断多糖各组分的连接方式及次序。
以葡聚糖为例，其反应式如下图：以1→2位键合的糖基经高碘酸氧化，平均每个糖基仅消耗一分子高碘酸，并且无甲酸释放；Smith降解后产生甘油。
OO... OHCCH2OHO...OO...O...CH2OHHOH2CKBH4CH2OHCHOHCH2OHH+2CH2OH以1→4位键合的糖基经高碘酸氧化，平均每个糖基仅消耗一分子高碘酸，并且无甲酸释放；Smith降解后产生赤藓醇。
O O...OH CH 2OHO...4H +OHCHO OHC O CH 2OHO...O...HOH2CHO H 2C OCH 2OHO...O...赤鲜醇＋乙二醇IO 4-以1→3位键和的糖基不被高碘酸氧化；Smith 降解后仍为原来糖。
4H +O OHOHCH 2OHOHOH以1→6位键和的糖基或非还原末端基（1→6）经高碘酸氧化，消耗二分子高碘酸，同时释放一分子甲酸； Smith 降解后产生甘油。
(完整版)高碘酸氧化和Smith降解
高碘酸氧化和Smith降解原理：高碘酸氧化和Smith降解高碘酸可选择性断裂糖分子中的邻二羟基或邻三羟基处,生成相应的多糖醛,甲醛或甲酸.反应定量进行,每开裂1个C—C键消耗1分子高碘酸.通过测定高碘酸的消耗量及甲酸的释放量,可以判断糖苷键的位置,直链多糖的聚合度,分支多糖的分支数等.Smith降解是将高碘酸氧化产物还原后酸水解,再鉴定水解产物,从而推断糖苷键的位置与分支点等.以葡萄糖为例,以1—2或1 —4位键合的糖基经高碘酸氧化,平均每个糖基消耗1分子高碘酸,且无甲酸释放;1—3位键合的糖基不被高碘酸氧化;1—6位键合的糖基或非还原末端糖基经高碘酸氧化,消耗2分子高碘酸同时释放1分子甲酸.准备物品：容量瓶（25ml * 2，50ml * 2；茶色为好）、锡纸、碱式滴定管、定量滤纸；高碘酸钠、乙二醇、溴甲酚(红)紫指示剂、0.005N NaOH(由0.1N NaOH稀释20倍制得，使用前用邻苯二甲酸氢钾标定)、NaBH4或KBH4、50% HAc、1M H2SO4、BaCO3、乙醇。
实验步骤：（1）准确配置30mM NaIO4 50ml （320.8mg NaIO4，定容至50ml），用锡纸包好避光，取0.1ml稀释至25ml，223nm处测定吸光值大于0.6方可使用。
（注：此溶液必须现用现配。
）（2）准确称取糖样50mg（记录下准确质量），用少量水溶解于50ml容量瓶中，然后加入30 mM NaIO425ml，蒸馏水定容，使NaIO4终浓度为15mM。
用锡纸包好避光，放置在低温暗处反应，间隔时间(0、6、12、24、36、48、60……小时)取样0.1ml，用蒸馏水稀释250倍，以蒸馏水作空白对照，在223nm波长处测光密度值，直到光密度值恒定为止。
（3）同时将剩余的30mM NaIO4稀释为15mM，与反应样品同样放置作为对照，待反应结束时取出0.1ml，稀释250倍后，用蒸馏水按不同比例稀释，每浓度三个重复，测定223nm处的（4）通过查标准曲线，计算出高碘酸的消耗量。
多糖结构方面
多糖的提取、分离纯化真菌多糖是从真菌细胞壁和组织体的菌丝之中分离出的由十个以上的单糖以糖苷键连接而成的高分子多聚物。
真菌多糖能通过对淋巴细胞、巨噬细胞、网状内皮系统而调节机体的免疫功能，在治疗肿瘤、心血管、肝炎、糖尿病，甚至爱滋病等方面显示出特殊的效果，有些已在临床上广泛应用[1]。
真菌多糖作为药物毒性极小，其在治疗代谢紊乱、感染及癌症等疾病方面的应用正不断增加，它在医疗上是一种很好的佐料。
真菌多糖其研究日益受到人们重视。
1 真菌多糖的提取、分离纯化与纯度检测1.1 真菌多糖的提取和分离提取真菌多糖的原料，应先用丙酮、乙醚或乙醇进行预处理，以除去原料中的脂类物质,然后用热水、稀酸或稀碱反复提取，提取液中和至中性后，用甲醇或乙醇沉淀，沉淀物经离心、干燥后，制得粗多糖。
1.1.1 粗多糖中蛋白的去除常用的脱蛋白的方法主要有3种：Sevag法是用氯仿、正丁醇或正戊醇按5:1混合后,加到样品水溶液中振摇，离心除去凝胶状蛋白质，反复多次直至蛋白质除尽为止。
三氟三氯乙烷法[2]是多糖溶液和三氟三氯乙烷1:1混合,在低温下搅拌10min左右,离心得上层溶液, 上层溶液继续用上述方法处理几次,即得无蛋白的多糖溶液。
三氯乙酸法是在多糖水溶液中滴加3%的三氯乙酸，直至溶液不再浑浊为止，于5～10℃放置过夜，离心除去沉淀即得无蛋白的的多糖溶液，但是此法会引起多糖的降解，不宜采用。
另外还有硫酸铵法和蛋白酶法。
1.1.2脱色多糖中所含的色素一般有两种，即游离色素和结合色素。
游离色素大多呈阴离子状态，可以通过离子交换法除去，常用DEAE纤维素或DEAE-Sepharose TM Fast Flow来吸附色素。
若多糖与色素结合，则色素易被离子交换柱吸附，不易被水洗脱，这类色素可采用氧化脱色：以浓氨水（或NaOH溶液）调至ph8.0左右，于50℃以下滴加H2O2至浅黄色，保温2h；根据真菌多糖与色素的结合情况选择合适的脱色方法[3]。
多糖类药物的分析
（2）、部分酸水解、碱水解 选择温和的条件水解多糖，使糖链中某 种类型的键特异性地打断。
（3）、乙酰解 多糖经过乙酰解反应（醋酐、冰醋酸） 可生成乙酰化单糖和寡糖
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（4）、甲醇解
多糖链在80－100℃条件下与无水甲醇反 应能将糖链变成组成单糖的甲基糖苷。 甲基糖苷能转化为三甲基硅醚衍生物或乙 酰基衍生物，进行气相色谱分析。
粘度法：用已知结构相似的多糖决定K值 （ η ＝ K M2），然后测出待测多糖的特 性粘数η ，计算待测多糖的分子量。
超离心法：根据测得的沉降系数计算多糖 的平均分子量。
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高效液相色谱法测定分子量及分布
色谱条件： 凝胶柱（分子量大小），示差折光检测器。 标准曲线： 标准曲线：LogMW = a+b tR MW为重均分子量，tR为保留时间 待测多糖分子量（GPC专用软件）： 重均分子量 Mw=∑(RIiMi)/∑ RIi Mi为供试品在保留时间ti 时的分子量，RIi在第i部分中 被洗脱物质的量（重量）。
6
O- （N-）糖苷键型糖蛋白
O-糖苷键 N-糖苷键
7
磷酸乙醇胺残基
磷脂酰肌醇-聚糖的糖 蛋白
8
蛋白聚糖
软骨蛋白聚 糖:聚集体的分
子量非常大（大 约为2×108）， 其中含有透明质 酸、硫酸角质素、 硫酸软骨素、连 接蛋白、核心蛋 白和大量的寡糖 链。
9
多糖组成-单糖
吡喃 呋喃
六员环糖类似于吡喃，所以又称之为吡喃糖，而五员环糖
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蒽酮法测定糖含量（总糖）
原理：多糖在浓硫酸中 水解后，进一步脱水生 产糠醛类衍生物，与蒽 酮作用形成蓝色化合物， 620nm进行比色测定。
(8)--苷键的裂解
一 填空题1 β-苷键葡萄糖双糖乙酰解的难易程度是（ ）.答案：（1→2）＞（1→3）＞（1→4）＞＞（1→6）2 乙酰解通常是在（）中进行的，以较高的选择性裂解（）。
答案： 1:10:10硫酸-醋酸-醋酸酐；1-6糖苷键3 在微生物培养液中加入苷，利用微生物产生的次级代谢产物将苷裂解为苷元的裂解方式也称为（）。
答案：酶催化水解反应4 在天然糖苷中，存在呋喃型和吡喃型糖苷两种类型，而酸水解后生成的是游离糖，为此常用（）的方法来确定糖在苷中氧环的大小。
答案：HCl\MeoH甲醇水解5 糖苷的乙酰解反应中，当（）时，C2 C3会发生差向异构化，应引起注意。
答案： C2 C3有顺邻二羟基的呋喃型糖6 在多糖进行全水解时，最易被破坏的单糖是（）。
答案： 果糖7 易进行碱催化水解的糖苷的类型包括？答案： 酚苷、酰苷、与羰基共轭的烯醇苷可被碱水解。
8 糖醛酸苷的苷键裂解常用的特殊方法有：答案：光解法；四醋酸铅分解法；醋酐吡啶分解法；微生物培养法9 碳酐用Smith裂解获得的是（ ）苷元。
答案：连有醛基的二 简单题1 Smith降解法推断连接位点的根据是什么？最小样品量是多少？答案：它们是通过计算高碘酸的消耗量及产物的种类来推断连接位点;1mg2 简述常见的糖分析方法，及可获得的信息？答案：水解-还原-乙酸化-GC，糖残基组成及其相对比例；高碘酸氧化及Smith降解, 甲基化分析及甲基化还原裂解分析；乙酰解，糖苷键连接位点，糖分枝情况及降解的寡糖；专一性酶分析，糖昔键连接位点，构型及序列。
3 乙酰解和酶催化水解共同点是什么答案：反应条件温和，在糖苷的裂解中，乙酰解反应和酶催化水解通常室温放置数天即可，反应较为温和；4 思考题：在形成苷键的原子中，N的碱性最强，最易质子化，为何朱砂莲苷（tuberosinone-N-β-D-glucoside）不能被10%HCl水解？答案：朱砂莲苷虽然是N苷，但其N原子存在酰胺结构中，受到强烈的p-π共轭效应和诱导效应的影响，此时的N已没有碱性，很难被水解。
山药多糖rdps-i的结构分析及抗肿瘤活性
山药多糖Ρ∆ΠΣ2Ι的结构分析及抗肿瘤活性赵国华 3 李志孝 陈宗道西南农业大学食品科学学院 重庆 兰州大学应用有机化学国家重点实验室 甘肃兰州摘要 目的研究山药多糖的化学结构和抗肿瘤活性∀方法用水提取山药块茎粗多糖 经≥ √ 反复脱蛋白 次 透析后经⁄∞ ∞2 ∏ 及≥ ¬ 2 柱色谱纯化得山药多糖 ⁄°≥2 ∀经完全酸水解!部分酸水解 用°≤ ≤ 高碘酸氧化 ≥ 降解 甲基化分析 及 ≤ 等研究山药多糖的化学结构∀并用小鼠移植性实体瘤研究了 ⁄°≥2 的体内抗肿瘤作用∀结果 ⁄°≥2 的分子量为 比旋光度为≈Α⁄1 β 1 特性粘度为≈Γ 1 ≅ # ∀ ⁄°≥2 是由葡萄糖!甘露糖和半乳糖以 Β 1 Β 1 的摩尔比组成 以Α2∆2 ψ 2 为主链 在 2Ο位有Α2∆2 ψ 2 2Β2∆2 2 支链的杂多糖∀ ⁄°≥2 对移植性黑色素 和 肺癌有很强的抑制作用∀结论 ⁄°≥2 是由葡萄糖!甘露糖和半乳糖构成的杂多糖 有很强的体内抗肿瘤活性∀关键词 山药 多糖 结构 抗肿瘤中图分类号 文献标识码 文章编号 ΣτρυχτυραλαναλψσισανδαντιτυµοραχτιϖιτψοφΡ∆ΠΣ2ΙπολψσαχχηαριδεφροµΧηινεσεψαµ∏ 2 ∏ 2¬ ≤ ∞ 2(1.ΦοοδΧολλεγε,Σουτη2ΩεστΑγριχυλτυραλΥνιϖερσιτψ,Χηονγθινγ400716,Χηινα;2.ΝατιοναλΛαβορατορψοφΑππλιεδΟργανιχΧηεµιστρψ,ΛανζηουΥνιϖερσιτψ,Λανζηου730000,Χηινα)Αβστραχτ Αιµ× ∏ ∏ ∏ ∏ √ ≤ Μετηοδσ× ∏ ≤ ¬ ¬ ⁄°≥2 ∏ ∏ ≥ √ ⁄∞ ∞2 ∏ ≥ ¬ 2 ∏ ∏ ∏ °≤ ≤ ¬ ≥ ≤ × ∏ √ ινϖιϖο ∏ ¬ Ρεσυλτσ ⁄°≥2 ∏ Β 1 Β 1 Α2∆2 2 Α2∆2 ψ 2 2Β2∆2 2 ∏ ≈Α ⁄ 1 β 1 ≈Γ 1 ≅ # ⁄°≥2 ∏ ∏ ινϖιϖο Χονχλυσιον ⁄°≥2 ∏ √Κεψωορδσ ≤ ∏ ∏ ∏山药是传统药食同源食物 为薯蓣科薯蓣属植物 ∆ιοσχορεαοπποσιτα× ∏ 的块茎 有益肾气!健脾胃!止泻痢和化痰涎之功效∀其水煎剂有延缓衰老!收稿日期 2 2基金项目 国家自然科学基金重点资助项目3通讯作者× ƒ ¬∞2 ∏ ∏ ∏ 防治糖尿病!抗突变及降血糖等作用 对其皂苷及尿囊素等成分的研究已有报道≈ ∀其总多糖有明显的抗氧化!增强免疫调节作用≈ 但对其多糖组分的纯化!化学结构和抗肿瘤活性尚未见报道∀为促进对山药多糖的进一步开发和应用 本文对其主要多糖 ⁄°≥2 的分离纯化!化学结构及抗肿瘤活性进行了研究∀##药学学报 ° ∏ ≥材料和方法仪器 ≥÷型红外光谱仪 ≥ ∏ ≤2 型气相色谱仪 ∂2 石英毛细管柱 1 ≅ ∏ 2 型超导核磁共振仪 ° Π 型色质联用分析仪 ° 型旋光仪 • 型高压液相色谱仪 ≥2 柱 ≥ ¬ ≥∞2 型示差检测仪∀试剂⁄∞ ∞2 ∏ ⁄∞2 为• 产品 ≥ ¬ 2 及⁄ ¬ 系列标准品为° 产品 三氟醋酸 标准单糖和糖醇为∞ 产品 硼氢化钠为 产品∀1山药多糖的化学结构提取与纯化山药 干重 粉碎 经乙醚脱脂后用水浸提 离心除去淀粉 上清液真空浓缩后 用≥ √ 法脱蛋白 次 置透析袋中对自来水透析 透析内液真空浓缩至一定体积 加乙醇沉淀 离心收集白色沉淀 溶剂干燥得山药粗多糖 1 ∀取山药粗多糖 用⁄∞ ∞2纤维素柱纯化 水洗脱 分部收集 主峰多糖乙醇沉淀 干燥得 ⁄°≥ 1 ∀取 1 ⁄°≥再经≥ ¬ 2 凝胶色谱柱纯化 蒸馏水洗脱 主峰多糖乙醇沉淀 冷冻干燥后得 ⁄°≥2 多糖 1 ∀纯度及分子量测定用高压液相色谱法 分析柱为 ≥2 柱 洗脱剂为双蒸馏水 流速为 1 # 常温测定∀样品 ⁄°≥2 及⁄ ¬ 系列标准品分别经 ° ≤分离 根据洗脱峰的形状判断样品的纯度 以⁄ ¬ 系列标准品的分子量对数与对应的洗脱体积作标准曲线 再根据 ⁄°≥2 的洗脱体积求得其分子量∀糖组成测定≈ ∗ ⁄°≥2 加 # 三氟醋酸 ׃ 封管后在 ε水解 冷却后减压蒸干除去׃ ∀用纸色谱法 °≤ 检测水解产物 展开剂为乙酸乙酯2吡啶2醋酸2水 Β Β Β 用苯胺2邻苯二甲酸试剂显色∀剩余水解物减压干燥过夜后加入盐酸羟胺 及无水吡啶 溶解后在 ε反应 冷至室温 加入无水醋酸酐 在 ε下继续反应 冷至室温 加入 摇匀 用氯仿萃取乙酰化产物进行气相色谱 ≤ 分析∀部分酸水解取 ⁄°≥2 用 1 # 的׃ 封管 置烘箱中在 ε水解 减压蒸干 再加甲醇 蒸干 重复 次 将׃ 去除干净∀水解物加水溶解后于透析袋中处理 袋外部分浓缩后干燥得 ⁄°≥2 2 组分 袋内部分浓缩后再经≥ ¬ 2 柱纯化后得 ⁄°≥2 2 组分 对 ⁄°≥2 2 和 ⁄°≥2 2 进行糖组成分析和甲基化分析∀甲基化反应取经°干燥的 ⁄°≥2 溶于无水二甲亚砜 中 在氩气保护下注入甲基亚磺酰负离子 1 室温反应 ∀置于冰浴至内容物冻结 滴加碘甲烷 ∀封口后在室温下反应 ∀用氩气将碘甲烷驱净∀加水 用氯仿萃取甲基化产物 次 每次 合并氯仿层用水洗 次 加无水硫酸钠过夜∀过滤除去无水硫酸钠 减压蒸去氯仿 真空干燥得暗黄色的甲基化产物 经红外光谱确认样品甲基化完全后 相继用甲酸和 # ׃ 水解并乙酰化 产物加氯仿 1 溶解 即可进行 ≤及 ≤2 ≥分析≈ ∀高碘酸氧化及Σµιτη降解取 ⁄°≥2 加 1 # 高碘酸钠 ε暗处进行氧化反应 分光光度法 间断检测反应过程 待反应完全后 按文献≈ 处理反应液 经完全酸水解! 还原!乙酰化后进行 ≤分析∀ΙΡ,1ΗΝΜΡ及13ΧΝΜΡ光谱分析取 ⁄°≥2 与 压片后在 ≥÷红外光谱仪常规测定∀另取 ⁄°≥2 溶于⁄1 中 测定 及 ≤ ∀2山药多糖的抗肿瘤活性≈取小鼠体内传代的 黑色素瘤细胞或 肺癌细胞瘤块 称重 分别用 ° 培养液稀释按质量浓度制成 Β 和 Β 的细胞悬液 1 Π只 接种于试验≤ Π 小鼠右前肢腋部皮下∀接种后 开始每天给予低剂量组 ⁄ !中等剂量组 ⁄ 和高剂量组 ⁄ 分别为 和 # 的多糖受试物 次 对照组 ≤ 给予等量的生理盐水 连续 周 结束后 颈椎脱臼处死小鼠 先称体重 再小心剥出肿瘤组织并称重 按下式计算体内肿瘤抑制率∀结果与讨论1Ρ∆ΠΣ2Ι的化学结构山药块茎粉碎后经热水浸提!乙醇沉淀!脱蛋白得 ⁄°≥粗多糖∀经⁄∞ ∞2纤维素离子交换色谱及≥ ¬ 2 柱色谱进一步分离纯化 得白色无定形粉末状多糖 ⁄°≥2 ∀ ⁄°≥2 溶解后经 ° ≤色谱得到其洗脱曲线是一对称的单一峰 图 证明 ⁄°≥2 已是均一多糖∀元素分析此多糖不含氮 比##药学学报 ° ∏ ≥旋光度为≈Α ⁄ 1β 1 特性粘度为≈Γ 1 ≅#° ≤测得其分子量为∀ƒ ∏ ° ≤ ⁄°≥2⁄°≥2 经完全酸水解产物用°≤法检测发现有葡萄糖!甘露糖和半乳糖的斑点 表明 ⁄°≥2 是一种杂聚糖图 是标准单糖的糖腈乙酸酯衍生物的 ≤图 按出峰的先后依次为鼠李糖!岩藻糖!阿拉伯糖!木糖!甘露糖!葡萄糖!半乳糖和内标肌醇∀图 是 ⁄°≥2 完全水解物的糖腈乙酸酯衍生物的 ≤图 表明 ⁄°≥2 是由葡萄糖!甘露糖和半乳糖组成 摩尔比为 Β 1 Β 1∀ƒ ∏ ≤ ∏ ⁄°≥2 甲基化产物水解!还原!乙酰化后进行 ≤2 ≥分析 数据与文献≈ 对照结果见表 ∀Ταβλε1 ΤηερεσυλτσοφµετηψλατεδαναλψσισοφΡ∆ΠΣ2Ιανδιτσηψδρολψσατεσ∏×3≥Π2 2∂ 2 ψ2 22 ψ 2 2ψ 2 2 ψ 2 2ψ 2 2 ψ2 2ψ 2 2 ψ×3√2Ο2 2 2 2 由表 可知 ⁄°≥2 主要是以 2连接的葡萄糖残基为主∀ ⁄°≥2 部分酸水解后获得两个组分 ⁄°≥2 2 为透析袋外的部分 糖组成分析发现只有甘露糖和半乳糖 甲基化分析为 2 2 和 2 2 及 2 2 Β Β ∀ ⁄°≥2 2 为透析袋内部分纯化得到的多糖 糖组成分析发现只含葡萄糖甲基化分析其连接方式为 ψ 连接的葡聚糖分子量约为 ∀由此可以初步认为 ⁄°≥2 的主链是 ψ 连接的葡聚糖 侧链由甘露糖和半乳糖构成 其连接方式为 ψ 连接∀在 2位连有低聚甘露半乳糖分支∀ ⁄°≥2 经高碘酸氧化 每摩尔己糖残基消耗 1 理论值为 1生成甲酸 1 理论值为 1 ≈ ∀≥ 降解产物经 ≤分析发现主要为葡萄糖和甘油 葡萄糖是 2葡萄糖残基和2葡萄糖残基的降解产物 而甘油是 2半乳糖残基和 2甘露糖残基的降解产物∀这与甲基化分析的结果相吻合∀图 是 ⁄°≥2 的 ≤ 图谱 经与文献≈ ∗ 比较 将其碳信号归属于表 ∀Ταβλε2 Ασσιγνµεντοφ13ΧΝΜΡχηεµιχαλσηιφτσοφΡ∆ΠΣ2Ι≥∏ ∏ ≤≤ ≤ ≤ ≤ ≤ ≤ Α ψ Α ψ Α ψ Β ψ2图 中≤ 的 个强吸收峰都在∆ ∆ 11 1 以下在 ⁄°≥2 的图 中有 个强吸收峰也都处在∆ 1 ∆ 1 11 以上表明 ⁄°≥2 的糖苷键类型主要是Α2型 但同时也发现在 ⁄°≥2 的 ≤ 谱中有 个较弱的≤ 信号处在∆ ∆ 1 以上 在 中也有 个 信号处在∆ 1 ∆ 1 以下 表明 ⁄°≥2 的糖苷键中也存在少量的Β2构型 Α2型≤ 信号在∆ 以下 信号在∆ 1 以上 Β2型≤ 信号在∆ 以上 信号在∆ 1 以下 ≈ ∀在 ⁄°≥2 的红外光谱 图 中 1 1 和 1的吸收峰表示 ⁄°≥2 中的糖环构型为吡喃型 呋喃型糖环在此区间上只有两个强吸收峰 而 1的吸收峰是∆2吡喃葡糖的非对称环伸缩振动的特征吸收峰∀ 1是甘露糖的特征吸收峰≈∀##赵国华等 山药多糖 ⁄°≥2 的结构分析及抗肿瘤活性ƒ ∏≤ ∏ ⁄°≥2ƒ ∏∏ ⁄°≥2ƒ ∏ ∏ ⁄°≥22 Ρ∆ΠΣ2Ι的抗肿瘤活性由表 可见 #⁄°≥2 对 肺癌有显著地抑制作用 而对 黑色素瘤没有明显作用 等于或高于 # 的 ⁄°≥2 对 黑色素瘤和 肺癌都有显著的抑制效果且中等剂量 #作用最佳∀Ταβλε3 ΙνηιβιτορψεφφεχτοφΡ∆ΠΣ2Ιονχανχερχελλινµιχεινϖιϖο≤ ∏ ×∏ Π Π≤ ?⁄ ? ⁄ ? 333 ⁄? 33∏ ≤ ? ≤⁄ ? 33 ⁄ ? 333 ⁄? 333ν ξ?σ33Π 1 ϖσ ≤ 333Π 1 ϖσ ≤Ρεφερενχεσ≈ ∏ ƒ ⁄ ÷ εταλ √≈ ΧηινΤραδιτΗερβ∆ρυγσ 中草药 24≈ • ≠ ÷ εταλ × ∏ ∏∏ ≤ ≈ ΑχταΝυτρΣιν 营养学报 24≈ ÷ ∏ƒ ≤ ≠ ≤ ∏ ∏ ∏Ποδοπηψλλυµοµοδι• √ σπραθυε≈ ΑχταΧηεµΣιν 化学学报 54≈ ° √ ⁄ ∞ °⁄ εταλ∏ 2 2 ∏ ≈ ΧαρβοηψδρΡεσ 5≈ ÷ ∏ ≤ ≤ ≠ εταλ × ∏ ∏¬ √ √ Ασπαραγυσχοχηινχηινενσισ≈ ΑχταΠηαρµΣιν 药学学报 35≈ ≥√ ≥≈ ΧαρβοηψδρΡεσ 5≈ ƒ ≈##药学学报 ° ∏ ≥ΦορειγνΜεδΣχι Πηαρµ 国外医学2药学分册 4≈ • ΜετηοδσινΧαρβοηψδρατεΧηεµιστρψ ςολ ΓενεραλΠολψσαχχηαριδε ≈ ≠ °≈ ∏ ≤ ∏ ∞ ∏ ∏ √ ≈ ΙντϑΧανχερ 8≈ ƒ ∏ ∏ ¬≈ ΧηεµΙνδ Λονδον 7≈ ° ∏ ∏ ∏ ≈ Πηψτοχηεµιστρψ32≈ • ΒιοχηεµιχαλΡεσεαρχηΜετηοδοφΓλψχοχονυγαλεσ 复合多糖生化研究技术 ≈ ∏ √ °≈ ° ≤ 2 ∏ ≈ ΑδϖΧαρβοηψδρΧηεµΒιοχηεµ 38##赵国华等 山药多糖 ⁄°≥2 的结构分析及抗肿瘤活性。