扫描电镜样品制备课件
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（5）脱水方法：
①酒精脱水：将固定好的样品用0.1mol/l磷酸缓冲溶液或蒸馏水清洗三
次，每次5~10min。将样品依次置于系列浓度30%、50%、70%、80%、 90%、95%、100%的酒精中脱水置换，时间一般为每级10~15min。
②叔丁醇脱水:将固定好的样品用0.1mol/l磷酸缓冲溶液或蒸馏水清洗
（2）粘贴样品的材料：
粘贴动植物组织块样品最好使用导电胶，常用的有银河粉、石墨 粉等导电胶，对于要镀金观察的样品，通常用双面胶粘样；果壳、 种子等较大的样品可采用普通胶水粘样，注意等胶水自然干燥后 装样。
（3）注意事项：
粘贴样品需注意观察面朝上，并尽可能在水平面的同一高度上， 操作时要注意防尘、防潮和防止易飞散样品的相互混杂。
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5、样品的导电处理
（1）金属镀膜法：真空蒸汽喷镀、
离子溅射喷镀：
原理：产生离子束的独立装置被称 为离子枪，它提供一定的束流强度、 一定能量的Ar离子流。离子束以一定 的入射角度轰击靶材并溅射出其表层 的原子，后者沉积到衬底表面即形成 薄膜。在靶材不导电的情况下，需要 在离子枪外或是在靶材的表面附近， 用直接对离子束提供电子的方法，中 和离子束所携带的电荷。
③固定液浸没样品。
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2、脱水
（1）目的：用脱水剂取代样品中的游离水，以便进行干燥处理。
（2）脱水剂：乙醇、丙酮、叔丁醇、乙腈、六甲基二硅烷胺、 正丁醇等。
（3）脱水原理：用一种低表面张力的有机溶剂代换组织细胞中 的游离水，使样品在干燥时表面张力减少。
（4）对脱水的要求：不能引起结构变形；脱水要彻底。
烘干干燥法（淀粉粒）
不同干燥法扫描电镜图像（蚜虫前胸背板）分别为临界点干燥法、自然干 燥法、微波干燥法、氮气干燥法叔丁醇干燥法、乙腈干燥法
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4、粘样
（1）目的：
①保证样品在样品台上不移动，不掉落，尤其是作倾斜、旋转观 察使不掉落。
②用导电胶粘样，能增加样品和样品台之间的导电性，使样品上 聚集的二次电子能通过导电胶传输到样品台上，而不发生电荷积 累。
以保护样品表面或断面的细微结构是一个十分重要的问题。在清 洗、固定、脱水、干燥、粘台等各个处理环节都不能触及或挤压 乃至损伤其观察面。
5.要求标记物要有形态
用扫描电镜进行细胞化学研 究时，要求标记物应具有一定 的形态，以便让扫描电镜可以 识别。
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二、样品制备程序图
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一、对样品处理的要求
附着物
1. 研究样品表面要处理干净
2.
扫描电镜主要是观察样品表
3. 面形貌和结构，而研究材料表面附
4. 有附着物，它们将掩盖表面微细结 蜜蜂触角 5. 构，最终会影响扫描电镜图像的质
6. 量和分析、解释并且影响图像美观。
蚜小蜂并胸腹节
2.研究样品必须彻底干燥
扫描电镜需在真空条件下正常工作，含水量高的样品会在
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（2）固定剂
①醛类：戊二醛、甲醛
②四氧化锇
（3）wenku.baidu.com定方法
戊二醛单固定（绞股蓝上下表皮）
①单固定：戊二醛单固定
、锇酸熏蒸固定
②戊二醛锇酸双固定
③戊二醛锇酸微波固定
④甲醛固定
1%锇酸熏蒸固定（真菌菌丝）
注意：①固定温度0~4℃，若样品较大可为5~10 ℃。
②固定时间不尽相同，一般戊二醛固定时间稍长些，锇 酸固定时间不宜过长。
•粗样清洗
清洗时针对研究目的和样品性质以及污染物的性质选用不同的 清洗液和清洗方法。
清洗液： 常用的有蒸馏水、生理盐水、各种缓冲液等。 特殊的有蛋白分解酶、氯仿、二甲苯、加酶缓冲液等。
•样品固定
（1）固定的目的及要求 采用化学或物理方法 ，快速而准确地（不失真）把研究样品的结 构（包括内部结构）或表面形貌依原样（如生活时的状态)保存下 来，这就是固定。
三次，每次5~10min。用系列浓度50%、70%、80%、90%、95%、 100%的叔丁醇中脱水，再一次100%置换，每级大约10~15min。
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3、干燥
（1）干燥要求：首先无变形干燥，以保证样品干燥后体积和结 构都不变形，其次是必须干燥彻底。 （2）干燥方法：临界点干燥法、自然干燥法、冷冻干燥法、叔 丁醇干燥法、六甲基二硅胺烷干燥法、乙腈干燥法、烘干干燥法、 氮气干燥法、微波干燥法。
真空的镜筒中造成影响。因此样品必须经过干燥处理，而且 要彻底干燥。在干燥处理的操作中要尽量减少样品表面形貌 的变形，但虽然干燥方法从原始的自然干燥、烘干干燥、冷 冻干燥、真空干燥到今天的临界点干燥不断进化。但仍存在 变形。临界点干燥被视为最理想的干燥方法，但仍存在约5% 的变形。
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3.非导体样品的导电处理
线
线
线
路
路
路
切片
冰醋酸浸泡
取样
线
清洗
路 线路5
前固定
冷冻 清洗
线 路
导电处理
漂白
水浴
熏蒸固定
线 后固定
路
割断 清洗
脱水
乙醇离心清洗
干燥 粘样
线 路
线 路
线 路
包埋
晾干或烘干
切片
粘台
脱蜡
镀膜
扫描PP电T学镜习观交流察
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1.取样、清洗、固定 •取样
因研究目的不同，对取样很难做一般的叙述和统一的要求，但 应注意：注意研究目的对样品具有针对性，避免盲目取样；注意 研究目的的典型性，即所取样品应该要有研究的具体对象。
（2）导电染色法
离子溅射喷镀仪
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参考文献：
1.郭素枝.扫描电镜技术及其应用.厦门大学出版 社,2006（2）：74~96
2.付洪兰.实用电子显微镜技术.高等教育社出版， 2004（7）：176~187
扫描显微镜（SEM）样品的制备
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一、对样品处理的要求
1.研究样品表面要处理干净 2.研究样品必须彻底干燥 3.非导体样品的导电处理 4.保护样品研究面 5.要求标记物要有形态
二、样品制备关键步骤
1. 取样、清洗、固定 2. 脱水 3. 干燥 4. 粘样 5. 样品导电处理
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由于电子束在样品表面作光栅状扫描，如果样品导电性能不
好，会在样品上聚集电荷放电，有时会损伤样品，直至烧毁。一 般生物样品不导电，因此必须对样品做导电处理，即喷镀一层金 属膜，一般膜厚为10~20nm。并根据样品表面凹凸粗糙状况及 样品性质而变化。有的样品需先喷碳再喷金。
4.保护样品研究面
扫描电镜的主要功能是做表面形貌观察或断面结构观察，所
①酒精脱水：将固定好的样品用0.1mol/l磷酸缓冲溶液或蒸馏水清洗三
次，每次5~10min。将样品依次置于系列浓度30%、50%、70%、80%、 90%、95%、100%的酒精中脱水置换，时间一般为每级10~15min。
②叔丁醇脱水:将固定好的样品用0.1mol/l磷酸缓冲溶液或蒸馏水清洗
（2）粘贴样品的材料：
粘贴动植物组织块样品最好使用导电胶，常用的有银河粉、石墨 粉等导电胶，对于要镀金观察的样品，通常用双面胶粘样；果壳、 种子等较大的样品可采用普通胶水粘样，注意等胶水自然干燥后 装样。
（3）注意事项：
粘贴样品需注意观察面朝上，并尽可能在水平面的同一高度上， 操作时要注意防尘、防潮和防止易飞散样品的相互混杂。
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5、样品的导电处理
（1）金属镀膜法：真空蒸汽喷镀、
离子溅射喷镀：
原理：产生离子束的独立装置被称 为离子枪，它提供一定的束流强度、 一定能量的Ar离子流。离子束以一定 的入射角度轰击靶材并溅射出其表层 的原子，后者沉积到衬底表面即形成 薄膜。在靶材不导电的情况下，需要 在离子枪外或是在靶材的表面附近， 用直接对离子束提供电子的方法，中 和离子束所携带的电荷。
③固定液浸没样品。
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2、脱水
（1）目的：用脱水剂取代样品中的游离水，以便进行干燥处理。
（2）脱水剂：乙醇、丙酮、叔丁醇、乙腈、六甲基二硅烷胺、 正丁醇等。
（3）脱水原理：用一种低表面张力的有机溶剂代换组织细胞中 的游离水，使样品在干燥时表面张力减少。
（4）对脱水的要求：不能引起结构变形；脱水要彻底。
烘干干燥法（淀粉粒）
不同干燥法扫描电镜图像（蚜虫前胸背板）分别为临界点干燥法、自然干 燥法、微波干燥法、氮气干燥法叔丁醇干燥法、乙腈干燥法
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4、粘样
（1）目的：
①保证样品在样品台上不移动，不掉落，尤其是作倾斜、旋转观 察使不掉落。
②用导电胶粘样，能增加样品和样品台之间的导电性，使样品上 聚集的二次电子能通过导电胶传输到样品台上，而不发生电荷积 累。
以保护样品表面或断面的细微结构是一个十分重要的问题。在清 洗、固定、脱水、干燥、粘台等各个处理环节都不能触及或挤压 乃至损伤其观察面。
5.要求标记物要有形态
用扫描电镜进行细胞化学研 究时，要求标记物应具有一定 的形态，以便让扫描电镜可以 识别。
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二、样品制备程序图
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一、对样品处理的要求
附着物
1. 研究样品表面要处理干净
2.
扫描电镜主要是观察样品表
3. 面形貌和结构，而研究材料表面附
4. 有附着物，它们将掩盖表面微细结 蜜蜂触角 5. 构，最终会影响扫描电镜图像的质
6. 量和分析、解释并且影响图像美观。
蚜小蜂并胸腹节
2.研究样品必须彻底干燥
扫描电镜需在真空条件下正常工作，含水量高的样品会在
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（2）固定剂
①醛类：戊二醛、甲醛
②四氧化锇
（3）wenku.baidu.com定方法
戊二醛单固定（绞股蓝上下表皮）
①单固定：戊二醛单固定
、锇酸熏蒸固定
②戊二醛锇酸双固定
③戊二醛锇酸微波固定
④甲醛固定
1%锇酸熏蒸固定（真菌菌丝）
注意：①固定温度0~4℃，若样品较大可为5~10 ℃。
②固定时间不尽相同，一般戊二醛固定时间稍长些，锇 酸固定时间不宜过长。
•粗样清洗
清洗时针对研究目的和样品性质以及污染物的性质选用不同的 清洗液和清洗方法。
清洗液： 常用的有蒸馏水、生理盐水、各种缓冲液等。 特殊的有蛋白分解酶、氯仿、二甲苯、加酶缓冲液等。
•样品固定
（1）固定的目的及要求 采用化学或物理方法 ，快速而准确地（不失真）把研究样品的结 构（包括内部结构）或表面形貌依原样（如生活时的状态)保存下 来，这就是固定。
三次，每次5~10min。用系列浓度50%、70%、80%、90%、95%、 100%的叔丁醇中脱水，再一次100%置换，每级大约10~15min。
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3、干燥
（1）干燥要求：首先无变形干燥，以保证样品干燥后体积和结 构都不变形，其次是必须干燥彻底。 （2）干燥方法：临界点干燥法、自然干燥法、冷冻干燥法、叔 丁醇干燥法、六甲基二硅胺烷干燥法、乙腈干燥法、烘干干燥法、 氮气干燥法、微波干燥法。
真空的镜筒中造成影响。因此样品必须经过干燥处理，而且 要彻底干燥。在干燥处理的操作中要尽量减少样品表面形貌 的变形，但虽然干燥方法从原始的自然干燥、烘干干燥、冷 冻干燥、真空干燥到今天的临界点干燥不断进化。但仍存在 变形。临界点干燥被视为最理想的干燥方法，但仍存在约5% 的变形。
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3.非导体样品的导电处理
线
线
线
路
路
路
切片
冰醋酸浸泡
取样
线
清洗
路 线路5
前固定
冷冻 清洗
线 路
导电处理
漂白
水浴
熏蒸固定
线 后固定
路
割断 清洗
脱水
乙醇离心清洗
干燥 粘样
线 路
线 路
线 路
包埋
晾干或烘干
切片
粘台
脱蜡
镀膜
扫描PP电T学镜习观交流察
5
1.取样、清洗、固定 •取样
因研究目的不同，对取样很难做一般的叙述和统一的要求，但 应注意：注意研究目的对样品具有针对性，避免盲目取样；注意 研究目的的典型性，即所取样品应该要有研究的具体对象。
（2）导电染色法
离子溅射喷镀仪
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参考文献：
1.郭素枝.扫描电镜技术及其应用.厦门大学出版 社,2006（2）：74~96
2.付洪兰.实用电子显微镜技术.高等教育社出版， 2004（7）：176~187
扫描显微镜（SEM）样品的制备
PPT学习交流
1
一、对样品处理的要求
1.研究样品表面要处理干净 2.研究样品必须彻底干燥 3.非导体样品的导电处理 4.保护样品研究面 5.要求标记物要有形态
二、样品制备关键步骤
1. 取样、清洗、固定 2. 脱水 3. 干燥 4. 粘样 5. 样品导电处理
PPT学习交流
由于电子束在样品表面作光栅状扫描，如果样品导电性能不
好，会在样品上聚集电荷放电，有时会损伤样品，直至烧毁。一 般生物样品不导电，因此必须对样品做导电处理，即喷镀一层金 属膜，一般膜厚为10~20nm。并根据样品表面凹凸粗糙状况及 样品性质而变化。有的样品需先喷碳再喷金。
4.保护样品研究面
扫描电镜的主要功能是做表面形貌观察或断面结构观察，所