第五章分子发光—荧光、磷光和化学发光法

2.化学发光效率
发射光子的分子数 cl ce em 参加反应的分子数
激发态分子数 化学效率： ce 参加反应分子数
发光效率：
em
产生光子数 激发态分子数
时刻t 的化学发光强度(单位时间发射的光量子数)：
dc I cl t cl dt
dc/dt 分析物参加反应的速率；
目 录
5-1 荧光和磷光光谱法
5-1-1 5-1-2 5-1-3 5-1-4 基本原理 荧光分析仪器 荧光分析方法的特点与应用 磷光分析法
5-2 化学发光与生物发光分析法
5-1-1 基本原理
5-1-1-1 5-1-1-2 5-1-1-3 5-1-1-4 荧光和磷光的产生 光谱曲线 荧光的影响因素 荧光强度的定量关系
5-1-1-4 荧光强度的定量关系
根据Parker方程，荧光强度F与荧光物质的浓度c 之间的关系是：
F 2.3kI 0 Fcl[1 (2.3cl) / 2! (2.3cl) 2 / 3! ]
k 与仪器有关的常数
I0 激发光的强度 F 荧光量子产率 荧光物质在激发波长处的摩尔吸光系数 l 光程长度。
当cl项很小时，括号内第二项及以后的高次项均 可忽略不计，Parker方程可简化为： F 2.3kI 0 Fcl F = Kc
5-1-2 荧光分析仪器
5-1-2-1 荧光分析仪器框图
光源
消除溶液中可能共存的其它 光线的干扰,以获得所需要 的荧光.
显示
激发光单色器
信号处理
I0
样品池 F 发射光单色器 (荧光单色器) 检测器
4.化学发光反应的类型
（1）气相化学发光反应 a. 一氧化氮与O3的发光反应(可测定空气中NO2的含量） NO + O3 → NO2* NO2* → NO2 + h
2．荧光与有机化合物的结构
（1）跃迁类型：* → 的荧光效率高，系间跨越过程的速 率常数小，有利于荧光的产生； * → 跃迁是产生荧光的主 要类型. （2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移 易于实现* → 跃迁的芳香族化合物容易发出荧光,而脂肪族 和脂环族化合物 ( 除少数高度共轭体系化合物以外 ) 极少能发 生荧光.
目 录
5-1 荧光和磷光光谱法
5-2 化学发光与生物发光分析法
参考文献： •陈国珍，黄贤智，郑本梓，许金钩，王尊本，荧光分析 法，科学出版社，北京，1990 •Joseph R. Lakowicz, Principle of Fluorescence Spectroscopy, Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York, 1999 •netLibrary电子图书
5-1-4 磷光分析法
分子的外层电子在辐射能的照射下，吸收能量跃迁至 激发态，再以无辐射驰豫转入第一激发三重态的最低振动 能级，然后跃回基态的各个振动能级，并产生辐射。这种 发光现象称为磷光。
1．如何获得较强的磷光
• • • • • 增加试样的刚性 固体磷光法 分子缔合物的形成 重原子效应 敏化磷光
3. 化学发光强度与化学发光分析的依据
在化学发光分析中，被分析物相对于发光试剂少得多， 对于一级动力学反应： dc/dt =Kc； K 为反应速率常数。 定性依据：
（1）在一定条件下，峰值光 强度与被测物浓度成线性； （2）在一定条件下，曲线下面积为发光总强度(S)，其与被 测物浓度成线性： t t dc A I cl t dt cl dt cl c 0 0 dt
0.6 30 0.4 20
10
0.2
0 350
400
450
500
550
600
650
700
750
0.0 800
Wavelength (nm)
Fluorescence spectra (-) of TPP and absorption spectra (---) of ETH5294 in plasticized PVC membrane: a. Excitation spectrum of TPP; b. Emission spectrum of TPP; c. Unprotonated ETH5294; d. Protonated ETH5294.
辐射跃迁：
系间窜跃
荧光：S1最低 振动能级—S0
磷光：S——T
非辐射跃迁： (热的形式) 振动弛豫 内转移 外转移
系间窜跃
非辐射能量传递过程 振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级至
低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10 -12 s。
内转换：相同多重态电子能级中,等能级间的无辐射能级交换。 通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激
目 录
5-1 荧光和磷光光谱法 5-2 化学与生物发光分析法
5-2-1 基本原理 5-2-2 化学与生物发光分析的应用
5-2-1 基本原理
1. 化学发光反应（chemiluminescence）
在化学反应过程中，某些化合物吸收了反应时产生的化学 能而被激发，从激发态返回基态时，发射出一定波长的光。 A +B → C * + D C * → C + h （1）能够发光的化合物大多为有机化合物，芳香族化合物； （2）化学反应必须能够提供足够的能量，以引起电子激发。化 学发光反应多为氧化还原反应，激发能与反应能相当 E=150～400 kJ/mol；位于可见光区； （3）发光持续时间较长，反应持续进行； 化学发光反应如果存在于生物体 (萤火虫、海洋发光生物 )中 ，称生物发光（bioluminescence ）。
（4）取代基效应： 芳环上有给电子基团，使荧光增强。
—OH、 —CN、 —NR2、 —OR、 —NH2
芳环上有吸电子基团，使荧光减弱甚至猝灭。
—C—O、—NO2、—NO、—COOH、卤素离子
苯酚、苯、硝基苯、苯甲酸中，产生荧光最强的是__________。
3．溶剂效应 同一种荧光物质溶于不同溶剂，其荧光光谱的位置和 强度可能有明显不同。 一般情况下，随着溶剂的极性的增加，荧光物质的 π→π* 跃迁几率增加，荧光强度将增强，荧光波长也发生 红移。 4 ．温度的影响 一般说来，大多数荧光物质的溶液随着温度的降低， 荧光效率和荧光强度将增加，相反，温度升高荧光效率将 下降。 如荧光素的乙醇溶液在0℃以下每降低10 ℃，荧光效率 增加3%，冷至-80℃时，荧光效率为100%。
（3）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互 作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构， 荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。


金属螯合物的荧光：不少有机化合物虽然具有共轭双键，但由于不是刚 性结构，分子处于非同一平面，因而不发生荧光。若这些化合物和金属 离子形成螯合物，随着分子的刚性增强，平面结构增大，常会发出荧光。
由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长
长； ‘2 > 2 > 1 ； 磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级→基态，
T1 → S0跃迁；
电子由S0进入T1的可能过程：（ S0 → T1禁阻跃迁） S0 →激发→振动弛豫→内转移→系间跨越→振动弛豫→ T1 发光速度很慢： 10-4～100 s 。 光照停止后，可持续一段时间。
分析化学（仪器分析部分）
第五章 分子发光
—荧光、磷光和化学发光法
你知道下面的发光原理吗？
• 磷火（鬼火） • 荧光棒 • 萤火虫
分子发光
molecular luminescence
• 分子荧光 • 分子磷光 • 化学发光 • 生物发光
光致发光：分子吸收了光能而被激发 至较高能态，在返回基态时，发射出 与吸收光波长相等或不等的辐射，这 种现象称为光致发光。 化学发光：化学反应中，产物分子吸 收了反应过程中释放的化学能而被激 发，在返回基态时发出光辐射。
相对灵敏度：0.05-0.005ppb（0.05M H2SO4)
• 选择性高
• 重现性好
• 取样量少
• 仪器不复杂
2．应用
定性分析：依据不同结构的物质所发射的荧光波长不同； 定量分析：同种物质的稀溶液，其产生的荧光强度与浓度 呈线性关系。 • 检测：金属离子、有机物、生物分子 • 生物分子相互作用研究 • 疾病诊断
5-1-1-1 荧光和磷光的产生
1．单重态和三重态
基态单重态S0
激发态单重态S
激发态三重态T
10-8s
10-4 - 1s
基态单重态(singlet state)：自旋电子成对,只有一种自旋方向(相反)↑↓, 电子自旋总和是零，光谱项的多重性是1，以S0表示; 当基态电子激发到某高能级时, 将有两种激发态： 即受激电子自旋相反与自旋平行: ↑↓h、↑↑h。自旋平行多重性为 M=2x1+1=3，称为激受三重态（triplet state）用T表示， 自旋相反多重性为1，称为激受单重态，用S表示；
2．单色器：滤光片、光栅 激发单色器和发射单色器
3．检测器 PMT Photomultiplier CCD Charge Coupled Device CID Charge Injected Device 4．信号处理
5-1-3 荧光分析方法的特点及应用
1．特点
• 灵敏度高：比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级； 检测下限：0.1～0.1ug/cm-3
5．荧光熄灭（猝灭） 荧光物质分子与溶 剂或其它溶质分子相 互作用，引起荧光强 度降低、消失或荧光 强度与浓度不呈现线 性关系的现象。 • • • • • 分子碰撞 能量转移 O2的作用 内滤效应 自熄灭、自吸收
60
a d b
1.0
50
c
0.8
Fluorescence Intensity
40
Absorbance
激发单重态S与激发三重态T的不同点：
⑴ S是抗磁分子，T是顺磁分子；
⑵ tS = 10-8s, tT = 10-4～1s； ⑶ 基态单重态到激发单重态的激发为允许跃迁，基态单重 态到激发三重态的激发为禁阻跃迁； ⑷ 激发三重态的能量较激发单重态的能量低 。
2．分子内的光物理过程
内转移
荧光的寿命比磷光的寿命短，但是量子产率较高。
迁也然。
5-1-1-3 荧光的影响因素
1. 分子产生荧光必须具备的条件 （1）具有合适的结构； （2）具有一定的荧光量子产率。 量子产率: 荧光物质发射光子数与吸收激发光子数之 比（当非辐射跃迁A返回基态的概率很小时，F接近于1， 在通常情况下，F总是小于1的）
F
发出荧光的量子数 吸收激发光的量子数
发单重态的最低振动能级。
外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移 能量的非辐射跃迁； 外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。 系间窜跃：不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。
改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋—轨道耦合进行。
辐射能量传递过程 荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态， 多为 S1→ S0跃迁，发射波长为 ‘2的荧光； 10-7～10 -9 s 。
b. 发射光谱的形状与激发波长无关
电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量 ( 如能级 图 。 c. 镜像规则
2
, 1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最
‘ 2
低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光(如
)
通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一
样）成镜像对称关系。
镜像规则的解释 基态上的各振动能级分布 与第一激发态上的各振动能级 分布类似； 基态上的 零振动能级与 第一激发态的 二振动能级之 间的跃迁几率 最大，相反跃
It
4-2-1 紫外-可见分光光度计的基本组成
光源Βιβλιοθήκη 单色器样品室检测器
显示
可见光区：钨灯作 为光源，其辐射波长范 围在320～2500 nm。 紫外区：氢、氘灯。 发射185～400 nm的连 续光谱。
5-1-2-2 荧光分光光度计部件
1．光源：氙灯 激发光源应具有稳定性好、强度大、适用波长范 围宽等特点。其中稳定性：影响测定的重现性和精密 度；强度：影响测定的灵敏度。
5-1-1-2 光谱曲线
激发光谱 发射光谱 磷光光谱（phosphorescence）
特征：
（1）Stokes位移
（2）激发波长一般不影响发射光 谱的形状 （3）吸收光谱与发射光谱的镜像 关系
激发光谱与发射光谱的关系 a. Stokes位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比 激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。