紫外可见分光光度计

第三节、紫外—可见分光光度计 仪器的类型：按光学系统分为单波长和双波长 1. 单波长分光光度计 单光束 双光束（空间分隔） 双光束（时间分隔） 特点：双光束方法因光束几乎同时通过样品池和参比池， 因此可消除光源不稳产生的误差。 2. 双波长百度文库光度计 特点：可测多组份试样、混浊试样、而且可作成导数 光谱、不需参比液、克服了电源不稳而产生的误差，灵 敏度高。
3．双波长分光光度计
用两种不同的波长的单色光λ 1、λ 2交替照射试液， 并被光电倍增管交替接收，测得的是扣除了背景干扰的 吸光度之差的ΔA0。
双波长测定法不用参比溶液，只用样品溶液即可完 全扣除背景(包括溶液的浑浊、吸收池的误差)，大大提 高了测定的准确度。
第四节、紫外—可见吸收光谱法的定量分析
紫外吸光度 A
1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 0.5 y = 0.2917x + 0.0106 2 R = 0.9985
1 1.5 2 2.5 3 藁本内酯浓度 (/100μ L/mL)
• 图.银杏内酯标准曲线(UV)
3.5
3、重现性实验
从标样备用液中分别抽取100μL用石油醚定容至1~7 号10 mL容量瓶中，测定。结果见表3。由表可见，该法重 现性较好，测量精密度较高。 表.重现性实验
第二章、紫外-可见分光光度法
本章主要内容
1、紫外-可见吸收光谱 2、紫外-可见光度计仪器组成 3、吸收光谱的测量-- Lambert-Beer 定律 4、分析条件选择 5、UV-Vis分光光度法的应用
第一节、紫外-可见吸收光谱 UV-Vis方法是分子光谱方法，它利用分子对外来辐射 的选择性吸收特性。 UV-Vis涉及分子外层电子的能级跃迁；光谱区在160 ~780nm。紫外—可见分子吸收光谱测定所用的仪器是紫 外—可见分光光度计，其测定波长范围为200 — 1000nm。 UV-Vis主要用于分子的定量分析，但紫外光谱(UV) 为四大波谱之一，是鉴定许多化合物，尤其是有机化合 物的重要定性工具之一。
1
2 3 平均值
0.157
0.154 0.159 0.1567
0.294
0.298 0.303 0.2983
0.464
0.460 0.467 0.4637
0.577
0.577 0.578 0.5773
0.746
0.740 0.735 0.7403
0.881
0.904 0.890 0.8917
2.银杏内酯标准曲线的制定
2 反应条件选择 显色剂的选择原则： 使配合物吸收系数 最大、配合物稳 定、与配合物吸收波长相差大等。 显色剂用量： 溶液酸度： 配位数与显色剂用量有关 配位数和水解等与 pH 有关。
显色时间、温度、放置时间等。
3 参比液选择 用适当的参比溶液在一定的入射光波长下调节A=0，可 以消除由比色皿、显色剂、溶剂和试剂对待测组分的干扰。 当显色剂、试剂在测定波长下均无吸收时，用纯溶剂(或 H20)作参比溶液，称溶剂空白； 若显色剂和其他试剂无吸收，而共存的其他离子有吸 收，则用不加显色剂的试液为参比溶液，称为“样品空白” ； 当试剂、显色剂有吸收而试液无色时，以不加试液的 试剂、显色剂按照操作步骤配成参比溶液，称为试剂空白。 总之，要求用参比溶液调A=0后，测得被测组分的吸光 度与其浓度的关系符合朗伯—比尔定律。
编号 A318 nm 1 2 3 4 5 6 7
平均值 标准 偏差 变异 系数
0.298 0.286 0.294 0.301 0.309 0.297 0.294
0.297
0.48%
1.617%
4、加样回收率实验 取一银杏叶样品，用石油醚转移并定容至100mL， 从中分别取出0.5mL置于R0~R5共6个25mL容量瓶中。从 标样备用液中分别取出100、200、300、400、500mL置 于上述R1~R5共5个容量瓶中。将上述6（R0~R5）容量瓶 分别定容至25mL测定。结果见下表。
b为液层厚度，cm； c为被测组分的浓度。 说明：在一定条件下溶液的吸光度A与被测物质的浓 度和液层厚度的乘积成正比。但必须满足入射光是单色光 、被照射物质是均匀的非散射性物质等条件。
3、 紫外—可见吸收光谱法的定量分析 （1） 单组份定量方法 1）标准曲线法 2）标准对比法：是标准曲线法的简化，即只配制一个 浓度为标准溶液，并测量其吸光度，求出吸收系数k， 然后由Ax=kcx求出cx （2）多组分定量方法 吸光度具有加合性，因此可以在同一试样中测定多个 组份。 （3）双波长法： 当混合物的吸收曲线重迭时，可利用双波长法来测定。
第五节、紫外—可见吸收光谱分析实验技术
当光度计使用一段时间后其波长和吸光度将出现漂移， 因此需要对其进行校正。
波长标度校正：
使用镨-钕玻璃（可见光区）和钬玻璃（紫外光区）进 行校正。因为二者均有其各自的特征吸收峰。
吸光度标度校正：
采用 K2CrO4 标准液校正（在25°C时，于不同波长处 测定0.04000g/L的 KOH 溶液（0.05mol/L）的吸光度 A， 调整光度计使其A 达到标准吸光度。
1 .Lambert-Beer 定律 当强度为I0的入射光束,通过装有均匀待测物的介质时， 该光束将被部分吸收，未被吸收的光将透过待测物溶液。 当入射光波长一定时，待测溶液的吸光度A与其浓度 和液层厚度成正比，即。
A bc
ε为摩尔吸光系数
2、朗伯—比尔定律
A bc
ε为摩尔吸光系数，仅与入射光的波长、被测组分的性 质和温度有关，在一定条件下是被测物质的特征性常数。 ε值越大，吸光程度越大，定量测定时的灵敏度越高； ε>1.0x104时为强吸收， ε=1.0x103—4为较强吸收， ε< 1.0x102为弱吸收；
图 .银杏内酯紫外扫描曲线
2.银杏内酯标准曲线的制定 从标样备用液中抽取50μL(5µ g/mL)、100μL、150μL 、200μL、250μL和300μL分别用石油醚定容至10 mL，在 λmax分别测定吸光度值，重复3次，绘制标准曲线。
表. 标准曲线测定值（λ=318nm） 标样取量 50 100 150 200 250 300
2．单波长双光束分光光度计
与单光束相似，不同的是在单色器与吸收池之间加了 一个斩光器。把均匀的单色光变成频率、强度相同的交替 光，一束通过参比溶液，另一束通过样品溶液，然后由检 测器交替接收参比信号和样品信号，并把它们的差值转变 为电信号，经放大后由显示系统显示出来。
双光束分光光度计适用于在宽的光谱区域内扫描复杂 的吸收光谱图，但对生物样品等复杂的试样不易找到合适 的参比溶液。
表. 加样回收实验 样品号 R0 R1 R2 R3 R4 R5
A318nm
回收率(%)
0.217
/
0.331
97.6
0.459
103.675
0.565
99.117
0.663
95.537
0.845
92.38
平均回收率为97.66%，该法较可靠，测定结果准确度较高。
5、稳定性研究 从标样备用液中取出200μ L定容至10mL，分别于0、 30、60、90、120min测λ max。测定间隙容量瓶密封冷 藏保存。结果见下表。
2、分光系统(单色器)
将由不同波长的“复合光”分开为一系列“单一”波长的
“单色光”的器件。 理想的100%的单色光是不可能达到的，实际上只能 获得的是具有一定“纯度”的单色光，即该“单色光具有一 定的宽度（有效带宽）。 有效带宽越小，分析的灵敏度越高、选择性越好、分 析物浓度与光学响应信号的线性相关性也越好。 构成：狭缝、准直镜、棱镜或光栅、会聚透镜 常用的色散元件有棱镜和光栅。商品仪器多选用光 栅，因光栅可在整个波长区提供良好的均匀一致的分辨 能力，而且成本低，便于保存。
第六节、紫外—可见吸收光谱法的定量分析实例 1.银杏内酯最大紫外吸收波长的测定 取银杏内酯标准品100mg，用定容至100mL（1mg/mL）， 从中取出0.20mL用石油醚定容至10 mL(20µ g/mL)。为减少 测定随机性，分别用UV-3000（自动）、UV-754（手动）紫 外扫描，得到银杏内酯紫外扫描曲线，结果见图。并确定 最大吸收波长λ max=318nm。
1．单波长单光束分光光度计 单光束分光光度计只有一条光路，通过变换参比池 和样品池的位置，使它们分别进入光路进行测定。
首先用参比溶液调透光率100％，然后对样品溶液测 量并读数。使用单光束分光光度计时，每换一次波长，要 用参比溶液校正透光率到100％，才能对样品进行测定。 若要做紫外—可见全谱区分析，则很麻烦，并且光源 强度不稳定会引入误差，此时可改用双光束分光光度计。
第二节、光谱仪器
组成： 1.光源； 2.单色器； 3.样品容器； 4.检测器（光电转换器）； 5.信号显示器（ 电子读出、数据处理及记录）
1、光源 是一种有光谱特性的器件，理想的光源必须满足： ①在使用波长范围内有足够的辐射强度和良好的稳定性； ②辐射光是连续的，其强度不随波长的变化而发生明显的变化。 常用的紫外光源是氢灯或氘灯，波长范围为160--375nm， 同样条件下氘灯的辐射强度比氢灯大4倍左右。 常用的可见光源为钨灯或碘钨灯，使用的波长范围为350 ～1000nm。 近年来，碘钨灯因寿命长、强度大而代替了钨灯。
f 入射狭缝 准直镜 棱镜 物镜 焦面 准直镜
出射狭缝
物镜
f
入射狭缝
光栅 出射狭缝
其中最主要的分光原件为棱镜和光栅。
3、吸收池 除发射光谱外，其它光谱分析都需要吸收池。盛放 试样的吸收池由光透明材料制成。 ①石英或熔融石英： 紫外光区—可见光区—3m； ②玻璃： 可见光区（350-1000nm）； ③透明塑料： 可见光区（350-1000nm）； ④盐窗（NaCl晶体）：红外光区。
1 仪器测量条件 由于光源不稳定性、读数不准等常带来误差。当分析 高浓度的样品时，误差更大。通常可通过调节溶液浓度或 改变光程b来控制A的读数在0.15~1.00范围内。 入射光波长的选择 为使测定有较高的灵敏度，应选择λ max作为入射光， 但要注意λ max所在的波峰不能太尖锐，这样由波长不准 确或非单色光引起偏离朗伯—比尔定律的程度较小，测定 结果较准确。 如果有干扰物质存在，应根据“干扰最小，吸收较大” 的原则选择入射光。
4 吸光度范围的选择
由计算可知，当透光率T为0.37即吸光度为0.43时，浓 度测量的相对误差最小；当透光率T为0.65—0.15即吸光度 为0.2—0.8时，浓度测量的误差较小，准确度较高。 这可以通过选择不同厚度的吸收池和改变试样的用量 及定容体积等方法进行调节。控制A在此范围内进行测定。 5 配对池的选择 吸收池由于在使用过程中受化学腐蚀或摩擦的程度不 同，因此在相同条件下测定的本底吸光度有差异，差异最 小的同一规格的吸收池称为配对池。 工作时用空气或蒸馏水在一定波长下测定吸光度值， 选择配对池投入使用。
多通道转换器
(Multichannel transducer)
电荷转移器件 Charge-transfer device, CTD：
电荷注入器件(Charge-injection device, CID)
UV-Vis
5、信号显示器
由检测器进行光电转换后，信号经适当放大，用记 录仪进行记录或数字显示。 目前国产许多紫外—可见分光光度计的仪器都配置 有工作站和激光打印机，测定信号的记录、处理、打印 操作都可以通过工作站的计算机进行控制，工作较方便。
(photo transducer)
UV-Vis
350-(500)max-750nm 据光敏材料而定 ibid 190-1100nm
真空光电管（Vacuum phototube） 光电倍增管（Photomultiplier tube） 硅二极管（Silicon diode） 光二极管阵列（Photodiode array, PDA）
4、光电转换器 （1）光电转换器是将光辐射转化为可以测量的电信号 的器件。 （2）理想的光电转换器要求： 灵敏度高； S/N大； C）光电转换器种类及应用波段 暗电流小； 响应快且在宽的波段内响应恒定。 检测器种类 检测器 应用波段
早期检测器 人眼(Vis)，相板及照像胶片(UV-Vis) 硒光电池（Photovoltaic cell,光伏管） 光电转换器