禾本科植物中的R

Rp3/Pi亚科的基因 树
AC134922亚科的基因树
在这三个家族中克隆筛选抗稻瘟病的R基因 根据水稻转化的方便以及这些基因家族的鉴定，我们开始进行了以
下试验：
（1）不管这些Rp1/Pi37基因家族的同源物基因是来自玉米、高粱还 是短柄草都可以产生对稻瘟病的抗病性。 （2）不管水稻中Rp3/Pc基因家族（包括R基因）的那个同源物，都 可以抵抗稻瘟病。
推论： 在一些植物的物种中的快速进化的R基因家族可能包含对一 种病原菌效应器产生抗性的等位基因，会影响相关的物种。 重要性： 我们发现，在玉米、高粱、短柄草、水稻中的一些快速进化 的植物抗性基因，会对一种水稻基因中的一种或多种稻瘟病菌 产生抗性。这些结果表明，快速进化的R基因和病原菌侵染效应 只能通过有限的进化途径来提高适应性，这种进化的机制，我 们叫做“受限差异”。分子系统发生学会提供一种R基因鉴定的 有效的途径和代替图为克隆的一些方法。
稻瘟病菌的快速进化有分歧。
古典的趋同进化论为我们的发现提供了一种可能机制，病原菌的效应器引 起玉米、高粱、短柄草的R基因的应答时相同的。相反，效应器似乎发生了重要
的分子变异，转录特异性的R基因只会对一些特殊的稻瘟病菌株产生抗性，与个
别的R基因不同。这种在稻瘟病中的抗性变异反对常规的趋同进化论，支持类似 于趋同进化的过程，但分子机制不同。
计算16个大的基因家族中的，横向同源物的数目都与同一基因组中其他同源物的差异 （<5%），每个物种的平均拷贝数目以及Ka/Ks的比率。
系统发育树：
描述这一群有机体 发生或进化的拓扑 结构
基因树：
当一个分子系统树 是根据某一个基因 数据构建而来的
物种树：
代表一组物种进 化过程的系统树
Rp1/Pi37亚科的基因树
R基因主要类群编码包括NBS-LRR在内的基因。
NBS位点：包含了一些能结 合并水解ATP、GTP的保守 的结构域。
NBSLRR 基 因
LRR结构域：NBS-LRR基因 识别外来蛋白并参与蛋白 质-蛋白质的相互作用的位 点，决定了基因抗病特异 性。
这样的NBS-LRR基因在识别和抵抗来自昆虫类或线 虫类的病毒、细菌、真菌的不同的病原体起着重要 作用。
禾本科植物中的R基因对稻瘟病的抗病性
杨月
作者介绍：
杨四海、李静、张晓辉、黄菊、陈建群、田大成是南京 大学生命科学学院生物技术制药国家重点实验室成员，这 几年都致力于研究水稻病因及抗性基因。 张奇骏，来自南京农业科学院。 Daniel L. Hartl，来自剑桥哈弗大学生物进化系。
PNAS:
《美国科学院院报》，是被引用最多的综合学科文献 之一。是美国科学院的院刊，也是世界上公认的四大名刊
结果 ：
鉴定亲缘关系较远的相关物种中的快速进化的NBS-LRR基因家族
为了验证候选R基因克隆的基因家族的快速进化。按照最大似然法建立基因树。 16个大的基因家族的数目已经被鉴定在基因树上，是根据以下的标准建立的：平 均每个物种的四个以上的拷贝基因；两个或以上新复制出的间接同源物（核苷酸 差异<5% ）;距离基因树的根部较近的分支并有很高的繁殖能力（≥70%），这 些就是快速进化的基因家族的特征。
系统发生分析：
通过MUSCLE排列NBS-LRR基因 → 根据最大似然法
Kimura参数模型通过氨基酸序列建立基因树。
OVER
（3）不管快速进化的AC134922基因家族中的哪个基因（包括R基
因）均可抗稻瘟病。
为了进行这些试验，克隆了一些从Rp1/Pi37、Rp3/Pc、AC134922基因家族得到的启 动子和终止子，并将它们导入到水稻中，所有的克隆基因都被排好序列并注释。根据六个 非病原性基因的高水平的核苷酸差异、它们的地理分布以及产生大量孢子的能力。遍布中 国，从85个株系中分离出的12种稻瘟病菌。由12株稻瘟病株系的每一株产生孢子，长成的 水稻转基因株系。根据他们对稻瘟病菌的敏感性/抗病性进行分类。
多的种子。
10棵转基因株系幼苗 + 2棵R基因的幼苗 + 2棵易感的（无效R基因载体）的 幼苗
3 个 星 期 后
喷洒稻瘟病菌的孢子混悬剂（湿润、26℃恒温箱、黑暗中24小时）
病害检查之前，于12h光下、12h黑暗的光周期，90%相对湿度下 培养7天
病害检查
抗稻瘟病实验：
用严格的标准检测每个转化株是否具有R基因表型。 2株R基因对照植株获得了明显的抗性， 来自TP309和Shin2 无效基因载体的转基因株系的水稻有 明显的易感性。
原体植株产生抗性，测量在一个抗性转化株中的一些基因的表达，
“保守性”“趋向性”“受限差异”
抗稻瘟病的种间交叉的R基因的进化分子机制仍然在研究。有一个种间交叉
抗性的先例。其中一个例子，玉米的一个NBS-LRR基因，RX01，对玉米细菌条纹
叶枯病以及水稻细菌条纹病产生了抗性，而RX01基因并不显示出快速进化的特 征以及水稻的这种病原菌进化慢的特点。这与我们所描述的R基因家族以及水稻
和与病原菌效应器的相互作用方面提供了新的方法。
材料与方法
植物材料及稻瘟病来源
抗稻瘟病试验
Hale Waihona Puke Baidu基因表达试验
系统发生分析
植物的材料：
这些使用的种子有不同的来源。染色体的DNA是通过
CTAB法从新鲜的叶子中提取的。根据它们的基因组设计引 物。 长的PCR产物被注入到双运载体PCAMBIAI3000中→单
基因拷贝→农杆菌转化→得转基因株系→用来繁殖得到足够
为了验证这种预测，我们描述了在玉米、高粱、短柄草中R基 因家族编码的NBS-LRR基因的特征，证明了这些R基因进行快速的 进化。我们克隆了一些这样的基因，把它们导入侵染了稻瘟病的水
稻株系中。发现25%的克隆基因会对12种稻瘟病菌中至少一种产生
抗性。这些结果证实了，不仅在种内，也会出现在种间，R基因编 码的NBS-LRR基因也会进行快速地进化。
我们的发现提供一个满意的解释。于是，我们提出了一个独特的机制叫“受限分歧”：
R基因和病原菌效应器可以遵循有限的进化途径来提高适应性。我们的结果提供了对R 基因鉴定的途径，将有助于阐明R基因和效应器的相互作用机制，会产生之久的病原体 抗性。
稻瘟病是由稻瘟病菌引起的，稻瘟病菌是水稻中的毁灭性 的病原菌，它可以传染其他的像大麦、小麦等重要的作物。 这种病原菌进化快速，显示出大量的物种特异性。 植物中有几种防御病原菌的屏障： 第一道屏障：含细胞壁、蜡质层在内的固有的结构屏障。 第二道屏障：跨膜的病原体相关的分子模式识别受体的主 动应 答，抵抗进化较慢的许多病原共有的蛋白质结构域。 第三道屏障：针对特异的病原菌种类 。在这个过程中， 病原体效应器激活宿主的R基因。
拟南芥有约150个NBS-LRR基因，在水稻中超过400个.R基因扩增涉
及串联重复和片段重复，因此这些基因易形成基因簇。
有些基因显示出快速进化的典型特征：多种多样的拷贝数目，在 系统进化树上有较短的分支。值得注意的是，同一基因组内不同的同 源物之间有较低的差异；较高的Ka/Ks（非同义替换/同义替换）比率 以及物种内高水平的多态性。
讨论
用传统的标准评定分子进化的速率，证实了在玉米、高粱、 短柄草中编码的NBS-LRR基因的三种快速进化的R基因。这些基
因家族中的每个基因都被导入到水稻易感株系中，测定转化株对
由12种不同的稻瘟病菌引起的稻瘟病产生抗性。我们又检测了水 稻基因组中这些相应的R基因家族的成员，其中有20种R基因至 少对一种稻瘟病植株产生抗性有关。其中13种可以至少对1种病 表明R基因对稻瘟病的抗性与转化基因的过表达无关。
有可能产生对快速进化的病原菌的抗性。来自同一祖先的NBS-LRR基因在物种间 保持一种相似的功能。这28种鉴定出来的抗稻瘟病的R基因（15种来自玉米、高
粱、短柄草，13种来自水稻）分布在这三种家族中：17种来自Rp1/Pi37家族，5
种来自Rp3/Pc基因家族，6种来自AC134922基因家族，一些拓扑学研究表明很有 可能在物种形成之前，它们来自同一祖先。这种R基因的鉴定方法，在研究基因
之一。自1914年创刊至今，PNAS提供具有高水平的前沿
研究报告、学术评论以及美国国家科学学会学术动态的报
导和出版。文献涵盖生物、物理和社会科学。 在SCIE所有期刊中，特征因子位列世界第二。
在SCI综合学科类排名第三位。2011年影响因子为9.681。
摘要：
当把玉米、高粱、短柄草基因组中的某些基因导入水稻中，就会产生对稻瘟病的抗 病性。这些基因就是所谓的抗性基因（R基因），能够编码核苷酸结合位点及富含亮氨 酸重复序列。随后，在水稻和这些植物中发现了三种快速进化的R基因家族。在这些基 因中，随机选取一些导入到对由稻瘟病菌引起的稻瘟病敏感的水稻株系中。用这些植 株对12种不同的稻瘟病菌进行敏感性或抗性试验。总体上看，从玉米、水稻、短柄草 中克隆的60个核苷酸结合位点-富含亮氨酸重复序列（NBS-LRR）发现了有15种功能性 的抗稻瘟病R基因。其中13种在水稻的20个NBS-LRR间接同源物上获得。这些结果表 明对快速进化的病原菌产生了抗性。传统进化的保守性和传统进化的趋同性均不能对
R基因抵抗快速进化的病原菌的唯一来源
这项研究中大量的已鉴定的抗稻瘟病的R基因证实了鉴定新的R基因就是根据
进化的分析在基因家族的同源物中仔细挑选出来的。这个方法比图位克隆法以及
其他常用的方法更有效。先前使用其他方法鉴定出来的不同的抗稻瘟病R基因的 数量是28.
实验中鉴定R基因的高效率，支持在快速进化的基因家族中的NBS-LRR基因很
我们根据发现建立了一个模型：
在抗菌的过程中，抗生素的目标蛋白会限制向更适应进化的途径。如果这也 是由于快速进化的R基因的话，猜想这种病原菌效应器进化的途径是相互融合或 缠绕的，这些相应的R基因的进化途径也将是如此。这样，在相关病原菌中快速 进化的效应器与它们相互作用的R基因会出现一种进化的现象。快速进化的NBSLRR基因显著地进行正向选择，基因的转换频率高，易发生重组、转换、不等交 换等，都会产生大量的序列差异，从而有利于应对进化较快的病原菌。
重复的实验和转化株的筛选表明所有挑选的物种中的许多基因都不断地对 稻瘟病产生抗性。
我们发现R基因的抗性很少是由于转基因的反常的过表达。为了验证这个可 能性 。对Rp1/Pi37基因家族的一个基因进行检测，测量它们基因的表达水平。将 从玉米和高粱中克隆的Rp1/Pi37基因家族的2个基因导入水稻易感植株中，发现 转基因NBS-LRR基因的表达水平，分别比他们内生性控制低37.5和47.1倍，表明 基因并没有高表达。另外Rp1/Pi37基因家族GM2到Shin2基因的种内转化株显示 出表达水平上没有明显的差别。在病原菌接种48h后，转基因个体中的这三种基 因的表达水平分别比没有病原菌接种的转基因植物相对增加17.2倍、10.4倍、7.4 倍。这些实验中基因的表达水平与以前报告中的数据相似。