光学显微镜样品的相称观察方法

光学显微镜下样品的几种衬度模式--体视显微镜专题之三（Microimage译）

Tina(2010-06-18 18:34:32)

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高分辨率光学显微镜下，活体以及无色透明的样品由于缺少衬度，在明场下几乎看不清。使用全孔径的物镜，无色样品的图像非常差，甚至周期性有规律的结构也不行，如衍射格栅、线性光纤、集成电路、丝状藻类、硅藻等。

尽管透明样品通常通过散射和衍射产生相位差影响光线，但由于人眼看不到相位差，所以这些物体在显微镜下仍然看不见。除非给样品染上有色染料，或者显微镜使用者关了虹彩光阑尽量减少聚光镜的工作孔径。然而，这些极端的措施会极大地消弱物镜的分辨率。

现代光学显微镜的光学系统能够在大倍数下产生高分辨率图像，但如果图像没有衬度，这是无用的。衬度并不是样品内在的特性，但依赖于样品和光的相互作用以及光学系统的效率，即需要有个合适的检测器记录图片信息。在显微镜光学系统中控制图像衬度依赖于几个因素：数值孔径的设置、检测器的特点、光学校正程度、样品类型、采用的衬度原理。除了特异的增强衬度附件，显微镜中还有几个设置可以提高衬度。光学系统中最关键的是视场以及聚光镜数值孔径的设置，同时也可通过调节数码相机来改变衬度，或者改变数码检测器的放大倍数、实时处理图像、给样品染色等等。

图1有三张图，展示了一个透明近乎无色的Zygnema丝状藻类在三种衬度模式下的图像：明场、相差和DIC。

光可以在一系列机制下与样品相互作用产生图像衬度。这些包括来自表面的反射、吸收、折射、偏振、荧光和衍射。衬度也可以通过改变显微镜的光学部件和照明模式来增强，或通过数码技术或图像处理图像，下面的讨论集中显示样品和光的不同中作用，并回顾了几种光学显微镜技术（表1）。表1展示了不同种样品及其不同材质在透射和落射显微镜下，如何选择衬度增强技术。这个表格可被用来指导如何解决光学显微镜下某些特定的成像问题。

人眼对样品中波长的振幅和波长本身的变化非常敏感。基于这个原因，许多样品切的很薄（1-30微米），再被染上化学染料以产生衬度和区分样品中的不同结构。这个技术已经在生物样品中用了几百年了，染料选择性的吸收一个或几个波长，穿过或发射其他波长。

这些技术同样适用于荧光染料，它可用于增强样品的衬度。在荧光标本中，一个或几个可见到近红外的波长被激发时，它们常发射更长波长的光，从而在黑色背景下变得清晰可见。

光学显微镜的衬度增强技术（表1）

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