荧光介绍及荧光显微镜的使用

荧光显微镜的种类 透射式 落射式
荧光显微镜的主要部件
透射式
• • • • 汞灯光源 激发滤色镜 暗场聚光镜 吸收滤色镜 落射式
• • • •
汞灯光源 激发滤色镜 分色镜 吸收滤色镜
落射荧光显微镜原理
吸收滤色镜
汞
灯
分色镜
物 标 镜 本 激发滤色镜
透射荧光显微镜原理
目镜
吸收滤色镜 物镜 暗场聚光镜 汞灯
（二）盖玻片 • • • • • • •
盖玻片厚度在0.17mm左右，光洁。
（三）标本
组织切片或其他标本不能太厚，如太厚激发光大部分消耗在标本下部， 而物镜直接观察到的上部不充分激发。另外，细胞重迭或杂质掩盖，影响判 断。
（四）封裱剂
封裱剂常用甘油，必须无自发荧光，无色透明，荧光的亮度在pH8.5～ 9.5时较亮，不易很快褪去。所以，常用甘油和0.5mol/l pH9.0～9.5的碳酸盐 缓冲液的等量混合液作封裱剂。
测试题 1、该仪器由哪几部分组成？
2、什么是荧光？荧光有几种类型？有什么性 质？ 3、该仪器的使用要点有哪些？ 4、荧光显微镜分哪两种？
谢谢大家！
欢迎提出宝贵意见！
二、可见光显微镜的使用
• 光源在显微镜下方，不需要开汞灯
源自文库
• 可以观察载玻片上的任何物质
三、成象系统
1、照相机
2、图象采集软件
Leica100图象分析软件，把显微镜下看到的图象拍摄 下来，保存成图片文件，再进行相关分析。
使用要点
• 标本制作 • 正确选择滤色镜 • 200W的超高压汞灯作光源 ，需预热15分。寿命有限，标 本应集中检查，以节省时间，保护光源。 • 防止污染（载物台已被EB污染） • 染色后尽快观察，荧光逐渐减弱
荧光介绍及荧光显微镜的使用
Leica 图象分析仪
组成部分 • 显微镜
荧光显微镜 可见光显微镜
• 成象系统
照相机 图象采集软件
一、荧光显微镜的使用
优点： • 检出能力高 • 对细胞的刺激小 • 能进行多重染色 用途： • 物体构造的观察 • 荧光的有无、色调比较进行物质判别 • 发荧光量的测定对物质定性、定量分析
（五）镜油
一般暗视野荧光显微镜和用油镜观察标本时，必须使用镜油，最好使用 特制的无荧光镜油，也可用上述甘油代替。
单细胞凝胶电泳试验（彗星试验）
制胶片
细胞裂解
DNA碱解旋
单细胞悬 液制备
电泳
染色与观察
中和
对照组与实验组中肺泡巨噬细胞DNA迁移的实验图象
DAPI+FITC+Texas Red
什么是荧光 ?
• 物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态， 再回到低能状态时释放出的光。 • 即：物质吸收短波光，发射出的长波光。
•
一种光化荧光
荧光的种类
自发荧光：物质受光激发产生的固有荧光 二次荧光：物质借荧光色素受光激发产生的荧光
自发荧光
二次荧光
荧光的性质
• • • • • • 吸收光 保持固有的荧光特性 荧光波长＞激发波长 荧光强度极小于激发光的强度 有不同程度的衰减 荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光效率
激发滤色镜
荧光激发滤色块
透过能使标本产生荧光的特定波长的光，同 时阻挡对激发荧光无关的光。 几种主要的荧光激发滤色块
激发方法 紫 兰 绿 代号 V B ， B2 G 主波长 405nm 495nm 546nm
荧光显微镜标本制作要求
（一）载玻片 •
载玻片厚度应在0.8～1.2mm之间，太厚的坡片，一方面光吸收多，另 一方面不能使激发光在标本上聚集。载玻片必须光洁，厚度均匀，无明显自 发荧光。有时需用石英玻璃载玻片。