补体过度激活与自身免疫型复发性流产的关系

上海交通大学学报（医学版）
Vol．31No．8Aug．2011
Journal of Shanghai Jiaotong University （Medical Science ）
［基金项目］上海市创新行动计划基金（0814*******）（Shanghai Innovation Action Plan Foundation ，0814*******）。

［文章编号］1674-
8115（2011）08-1125-04·论著·
补体过度激活与自身免疫型复发性流产的关系
肖世金1，赵爱民1，鲍世民
2（1．上海交通大学医学院附属仁济医院妇产科，上海200127；2．中国科学院上海实验动物中心，上海201615）
［摘要］目的建立自身免疫型复发性流产（RSA ）小鼠模型，探讨补体在自身免疫型RSA 发病机制中的作用。

方法采用子宫注射人β2GP-1免疫Balb /c 小鼠（子宫β2GP-1注射组，n =15）；分别以子宫无关蛋白注射组（n =6）、子宫佐剂注射组（n =13）、子宫生理盐水（NS ）注射组（n =10）及正常未孕组（n =10）、正常妊娠组（n =15）作为对照。

比较各组小鼠胚胎丢失率、胎盘平均质量、外周血补体C3浓度及胎盘组织衰变加速因子（DAF ）的质量浓度。

结果子宫β2GP-1注射组小鼠胚胎丢失率显著高于正常妊娠组和各子宫注射对照组（P ＜0．05），胎盘平均质量显著低于正常妊娠组和各子宫注射对照组（P ＜0．05），外周血补体C3水平和胎盘组织DAF 的质量浓度显著低于正常妊娠组和各子宫注射对照组（P ＜0．05）。

结论通过子宫注射人β2GP-1的方法可诱导建立符合自身免疫型RSA 临床特征的小鼠模型，补体系统过度激活可能是自身免疫型RSA 的发病机制之一。

［关键词］复发性流产；自身免疫；动物模型；β2GP-1；补体C3；衰变加速因子；小鼠［DOI ］10．3969/j．issn．1674-8115．2011．08．018
［中图分类号］R714．21
［文献标志码］A
Relationship between excessive complement activation and autoimmune-type recurrent spontaneous abortion
XIAO Shi-jin 1，ZHAO Ai-min 1，BAO Shi-min 2
(1．Department of Obstetrics and Gynecology，Renji Hospital，Shanghai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai 200217，China;2．Experimental Animal Center of Shanghai，Chinese Academy of Sciences，Shanghai 201615，China)［Abstract］Objective
To establish the mouse model of autoimmune-type recurrent spontaneous abortion (RSA)，and
explore the role of complement in the pathogenesis of autoimmune-type RSA．
Methods
The mouse model of autoimmune-
type RSA was established by intrauterine injection of human β2GP-1in Balb /c mice (intrauterine injection of β2GP-1group，n =15)，and intrauterine injection of unrelated protein group (n =6)，intrauterine injection of adjuvants group (n =13)，intrauterine injection of normal saline group (n =10)，normal unpregnancy group (n =10)and normal pregnancy group (n =15)were served as controls．The embryo loss rates，mean placental weight，concentrations of complement C3in peripheral blood and mass concentrations of decay accelerating factor (DAF)in placental tissues were compared among groups．
Results
The embryo loss rate in intrauterine injection of β2GP-1group was significantly higher than those in
normal pregnancy group and intrauterine injection control groups (P ＜0．05)．The mean placental weight，concentrations of complement C3in peripheral blood and mass concentrations of DAF in placental tissues in intrauterine injection of β2GP-1group were significantly lower than those in normal pregnancy group and intrauterine injection control groups (P ＜0．05)．Conclusion
Intrauterine injection of human β2GP-1can establish autoimmune-type RSA mouse model．Excessive
complement activation may paly an important role in the pathogenesis of autoimmune-type RSA．
［Key words］recurrent spontaneous abortion;autoimmune;animal model;β2GP-1;complement C3;decay accelerating
factor;mouse
目前认为自身免疫型复发性流产（recurrent spontaneous abortion ，RSA ）属抗磷脂抗体综合征（anti-phospholipids syndrome ，APS ）的表现之一。

APS 是一组以任何动、静脉血栓和（或）反复发生的
早孕期流产或中孕期胎死宫内或孕34周前因严重
的先兆子导致的以早产为主要临床表现的非炎症性自身免疫性疾病，常累及多系统，多有持续性抗磷脂抗体（APA ）或抗β2糖蛋白1（β2GP-
1）抗体阳·
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上海交通大学学报（医学版）Vol．31
性［1］，自身免疫型RSA病理变化为蜕膜血管病变和胎盘血管血栓形成、梗死。

APS及自身免疫型RSA 的发病机制至今未明，既往研究多集中在APA介导的免疫损伤；然而，多种并不产生APA的自身免疫性疾病或循环抗体阴性患者亦发生自身免疫型RSA。

本课题组曾于1997年报道［2］，RSA患者蜕膜血管存在微血栓，血管壁存在免疫球蛋白IgM和补体C3的沉着，并且有类似移植物免疫排斥的病理现象。

补体具有重要的生物学功能，除具有溶菌、溶细胞及调理、免疫黏附等作用外，还可作为炎症介质，在许多疾病中发挥免疫病理作用。

补体异常激活可能在APS及自身免疫型RSA的发病机制中起着重要的作用。

本研究将建立自身免疫型RSA小鼠模型，探讨补体C3及C3调节因子———衰变加速因子（decay accelerating factor，DAF）与自身免疫型RSA的关系。

1材料与方法
1．1实验动物与造模方法
6 8周龄清洁级雌性Balb/c近交系小鼠69只，原种来源于日本国立遗传研究所，由中国科学院上海实验动物中心遗传室保种，经遗传质量检测符合此品系的国际标准。

本研究获得上海交通大学医学院附属仁济医院伦理委员会批准。

实验小鼠分为正常未孕组（正常雌性小鼠，n=10）、正常妊娠组（未进行任何干预的雌雄Balb/c合笼小鼠，n=15）、子宫β2GP-1注射组（n=15）组、子宫注射对照组（n= 29）；子宫注射对照组又分为子宫无关蛋白注射组（n=6）、子宫佐剂注射组（n=13）和子宫生理盐水（NS）注射组（n=10）；无关蛋白为小牛血清（BSA），佐剂为完全弗氏佐剂（CFA）。

各组间鼠龄及体质量的差异均无统计学意义（P＞0．05）。

子宫注射方法及可行性参见相关文献［3］。

1．2免疫方法及观察指标
子宫β2GP-1注射组第一次免疫采用含10μg 人β2GP-1（Cell Sciences）的PBS与CFA（Sigma）1ʒ1比例混合液50μL注射（子宫无关蛋白注射组、子宫佐剂注射组及子宫NS注射组分别采用BSA、CFA、NS代替人β2GP-1；NS组无CFA，采用双倍体积的NS）；1周后采用IFA代替CFA，剂量同第一次；加强免疫10d后，雌、雄小鼠按2ʒ1合笼；自合笼之日起，每天8：00和14：00分别观察1次，如见阴栓即确定出血或坏死［4－5］。

胚胎丢失率=［丢失胚胎数/（丢失胚胎数+存活胚胎数）］ˑ100%。

胎盘平均质量=胎盘总质量/存活胎盘数。

正常胎鼠数据标准来源于15只Balb/cˑBalb/c小鼠。

1．3母胎界面DAF检测
于妊娠第14天解剖小鼠，将胎盘标本置于4%中性多聚甲醛中固定，石蜡包埋，3μm切片进行免疫组织化学染色。

兔抗小鼠DAF单抗（Santa Cruz）1ʒ50稀释，按Histostain Plus二抗试剂盒（Invitrogen）说明书操作。

结果判断：出现棕黄色染色的细胞为阳性细胞，在高倍镜下每张切片随机选取10个视野，每个视野中阳性细胞的比例≥10%为阳性，＜10%为阴性［6］。

1．4血清C3水平检测
于妊娠第14天眶下静脉取小鼠外周血1mL，1500r/min离心5min后取上清；利用C3-ELISA试剂盒（K-SSAY）检测，严格按照说明书操作；根据吸光度及标准曲线换算小鼠血清C3质量浓度。

1．5统计学方法
采用SPSS11．0统计软件分析数据。

率的比较采用χ2检验；计量资料采用珋
xʃs表示，比较采用t检验。

P＜0．05表明差异有统计学意义。

2结果
2．1胚胎丢失率
子宫β2GP-1注射组与正常妊娠组的胚胎丢失率比较，差异有统计学意义（P＜0．001）；子宫β2GP-1注射组与子宫佐剂注射组、子宫无关蛋白注射组、子宫NS注射组胚胎丢失率比较，差异均有统计学意义（P=0．023，P=0．030，P=0．010）；而3个子宫注射对照组之间胚胎丢失率比较，差异无统计学意义（P＞0．05）（表1）。

2．2胎盘平均质量
子宫β2GP-1注射组的胎盘平均质量与正常妊娠组比较，差异有统计学意义（P=0．005）；子宫β2GP-1注射组与子宫佐剂注射组、子宫无关蛋白注射组、子宫NS注射组的胎盘平均质量比较，差异均有统计学意义（P=0．015，P=0．015，P=0．004）；而3个子宫注射对照组之间胎盘平均质量比较，差异无统计学意义（P＞0．05）（表1）。

2．3胎盘DAF表达水平
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No．8肖世金，等：补体过度激活与自身免疫型复发性流产的关系
计学意义（P=0．028）；子宫β2GP-1注射组胎盘DAF阳性表达率亦显著低于子宫无关蛋白注射组、子宫佐剂注射组和子宫NS注射组（P=0．024，P= 0．018，P=0．032）；而3个子宫注射对照组胎盘DAF 阳性表达率与正常妊娠组比较，差异无统计学意义（P＞0．05）（图1，表1）。

2．4血清C3质量浓度
子宫β2GP-1注射组外周血C3质量浓度显著低于正常妊娠组，差异有统计学意义（P=0．025）；子宫β2GP-1注射组外周血C3质量浓度亦显著低于子宫无关蛋白注射组、子宫佐剂注射组和子宫NS注射组，差异有统计学意义（P=0．029，P=0．034，P= 0．032）；3个子宫注射对照组C3质量浓度与正常妊娠组比较，差异均无统计学意义（P＞0．05）；正常妊娠组外周血C3质量浓度显著高于正常未孕组（P＜0．05）。

表1各组小鼠观察及检测指标
Tab1Comparison of indices among groups
组别总胚胎数/n胚胎丢失数/n丢失率/%平均胎盘质量/g DAF阳性表达率/%C3质量浓度/（ng/mL）正常未孕组（n=10）34．48ʃ4．77
正常妊娠组（n=15）14264．23①0．0961ʃ0．0046①66．7①39．01ʃ3．58①②子宫β2GP-1注射组（n=15）1373223．360．0089ʃ0．007526．734．86ʃ3．61
子宫注射对照组
子宫无关蛋白注射组（n=6）5459．26①0．0992ʃ0．0068①83．3①39．08ʃ3．37①子宫佐剂注射组（n=13）1081110．19①0．0952ʃ0．0036①69．2①38．38ʃ4．52①子宫NS注射组（n=10）9677．29①0．0992ʃ0．0068①70．0①38．73ʃ4．32①①P＜0．05与子宫β2GP-1注射组比较；②P＜0．05与正常未孕组比较。

A．DAF表达阴性；B．部分细胞DAF表达阳性；C．部分细胞DAF表达强阳性。

图1胚胎组织DAF免疫组织化学检测ˑ400
Fig1Expression of DAF in embryonic tissues detected by immunohistochemistryˑ400
3讨论
目前，生殖免疫学观点认为，与免疫有关的RSA 可分为同种免疫型和自身免疫型两种类型；而自身免疫型RSA本质是一种自身免疫病，是APS的临床表现之一，流产可以是独立的临床表现，也可以与APS其他临床表现如动静脉血栓形成和（或）血小板减少同时存在［1］。

与自身免疫型RSA有关的自身抗体主要是APA，但APA介导流产的机制仍未明了。

现有观点［7－9］认为，补体系统在正常妊娠中发挥着重要作用；但补体系统异常激活则可产生一系列C3开始依次激活；前者为经典激活途径，后者为旁路激活途径。

由于C3在补体的两条激活途径中处于中枢位置，C3的调节因子DAF在调节补体的激活过程中起着重要的作用。

DAF能使已经结合的C2a与C4a分离、Bb与C3b分离，使C3和C5转换酶难以维持，从而在经典和替代两条激活途径中的C3、C5两个环节阻断补体级联反应，防止补体系统及其趋化来的炎症细胞对机体细胞的免疫攻击。

目前已有少数研究表明，子宫局部的补体特别是某些片段如C3a、C5a、B因子等在介导炎症反应、抗体的免疫调理过程中发挥极大的作用。

有研究［7］发现，阻断补
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道［2］，RSA患者蜕膜血管存在微血栓，血管壁存在免疫球蛋白IgM和补体C3的沉着，并且有类似移植物免疫排斥的病理现象。

本研究发现，自身免疫型RSA及APS小鼠外周血C3浓度及母胎界面C3调节因子DAF显著下降，表明C3及其调节因子DAF在自身免疫型RSA的发病机制中发挥着重大作用，再次证实正常的补体系统在妊娠中有保护作用，而过度补体系统激活可能导致病理妊娠，特别是流产的发生，推测在自身免疫型RSA中的自身抗体介导的补体经典途径过度激活补体系统而对胚胎进行免疫攻击，导致流产。

补体系统是免疫系统的一个重要组成部分，补体系统的异常激活可产生一系列的免疫损伤，导致相关疾病的产生。

补体系统异常激活产生免疫损伤主要通过两种途径实现，一是通过抗体介导的免疫损伤，二是激活后产生的补体活性成分造成的免疫损伤。

有研究［8－11］表明，补体系统在正常妊娠中发挥着重要作用，而补体系统异常则可能导致病理妊娠，通过抑制C3及B因子等可改善妊娠结局。

另有研究［9］发现，人母胎界面DAF的表达的下降，可导致胚胎种植失败，原因可能是DAF表达的下降降低了对C3激活的抑制作用。

目前，关于补体系统与自身免疫型RSA的相关性已逐渐引起人们的关注。

本研究发现，自身免疫型RSA小鼠模型出现外周血C3浓度及母胎界面C3调节因子DAF的表达显著下降，表明自身免疫型RSA模型小鼠存在补体系统的过度激活而被消耗。

造成补体系统过度激活的原因，一方面可能是由于循环和子宫局部自身抗体的存在引起的抗体介导的自身免疫反应所致，而另一方面则是由于C3调节因子DAF表达的下降而导致了对C3抑制作用的丧失。

本研究结果进一步表明，补体系统在自身免疫型RSA的发病机制中可能起着重要作用。

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［收稿日期］2011-01-25［本文编辑］吴洋
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