微生物学实验指导(10.10)剖析
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实验一显微镜的使用及细菌的革兰氏染色
一、实验目的和内容
(一)实验目的
1. 复习显微镜低倍镜和高倍镜的使用技术,了解油浸系物镜的基本原理,掌握油镜的使用方法。
2. 初步掌握细菌涂片方法及革兰氏染色的步骤
(二)实验内容
1.学习油浸系物镜的使用方法。
2.制作细菌染色装片。
3.进行革兰氏染色法操作。
4.用油镜观察大肠杆菌和苏云金杆菌染色装片。
二、实验原理
(一)油镜的基本原理
普通光学显微镜包括低倍物镜、高倍物镜和油镜3种物镜。油镜是一种高倍放大的物镜,一般都刻有放大倍数,如95×、100×等。油镜头上常刻有OI(Oil,Immersion)或HI(Homogeneous immersion)字样,有的还刻有一圈红线或黑线标记,而且油镜的镜身较高倍镜和低倍镜为长。在低倍物镜、高倍物镜和油镜3种物镜中,油镜的放大倍数和数值孔径(numberal aperture)最大,而工作距离最短(图3-1)。
图1-1 显微镜物镜参数图
显微镜的分辨率是指显微镜能分辨出物体两点间最小距离(D)的能力。D值愈小表明分辨率愈高。D值与光线的波长(λ)成正比,与物镜的数值孔径(NA)成反比.
从上式可看出,缩短光波长和增大数值孔径都可提高分辨率。数值孔径指光线投射到物镜上的最大角度(称镜口角,α)的一半正弦与介质折射率(n)的乘积。影响数值孔径大小的因数,一是
镜口角,二是介质的折射率。
当镜与装片之间的介质为空气时,由于空气(n=1.0)与玻璃(n=1.52)的折射率不同,光线会发生折射,不仅使进入物镜的光线减少,降低了视野的照明度,而且会减少镜口角。当以香柏油(n=1.515)为介质时,由于它的折射率与玻璃相近,光线经过载玻片后可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射,不仅增加了视野的照明废,更重要的是通过增加数值孔径提高分辨率,因而可以使物像明亮清晰。
(二)革兰氏染色
革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家Christain Gram创立的,是细菌学中最重要的鉴别染色法,其原理是利用细菌的细胞壁组成成分和结构的不同。
革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性,革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成、壁厚、类脂质含量低,用乙醇(或丙酮)脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小,透性降低,从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内,经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同,由于其细胞壁肽聚糖层较薄,类脂含量高,所以当脱色处理时,类脂质被乙醇(或丙酮)溶解,细胞壁透性增大,使结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来,用复染剂复染后,细胞被染上复染剂的红色。
三、实验材料和用具
1. 菌种
大肠杆菌(Escherichia coli)、苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)。
2. 试剂
革兰氏染色液(结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、石炭酸复红液等)、香柏油、二甲苯。
3. 仪器及用具
显微镜、擦镜纸、接种环、载玻片、吸水纸、试管、小滴管、酒精灯。
四、操作步骤
(一) 细菌的革兰氏染色
1. 制片
(1)涂菌用无菌操作方法从平板中沾取菌苔一环,用接种环在洁净无脂的载玻片上做一薄而匀、直径约1 cm的菌膜。涂菌后将接种环火焰灭菌。
(2)干燥于空气中自然干燥。亦可把玻片置于火焰上部略加温加速干燥(温度不宜过高)。(3)固定将细菌涂片向上,通过火焰3次,以热而不烫为宜,防止菌体烧焦、变形。目的是杀死细菌并使细菌粘附在玻片上,便于染料着色。
2. 染色
(1)初染于制片上滴加结晶紫染液,染1 min后,用水洗去剩余染料。
(2)媒染滴加卢戈氏碘液,1 min后水洗。
(3)脱色滴加95%乙醇脱色,摇动玻片至紫色不再为乙醇脱退为止(根据涂片之厚薄需时30 s 至1 min),立即水洗。
(4)复染滴加石炭酸复红液复染1 min,水洗。
(5)镜检用滤纸吸干,油镜镜检。
(二)镜检
1. 观察前的准备
(1)将显微镜置于平稳的实验台上,镜座距实验台边沿约为4 cm。坐正。
(2)调节光源:将低倍物镜转到工作位置,把光圈完全打开,聚光器升至与载物台相距约1mm左右。观察染色装片时,光线宜强;观察未染色装片时,光线不宜太强。
2. 低倍镜观察染色装片
首先上升镜筒,将细菌染色装片置于载物台上,用标本夹夹住,将观察位置移至物镜正下方,物镜降至装片0.5 cm处,适当缩小光圈,然后两眼从目镜观察,转动粗调节器使物镜逐渐上升(或使镜台下降)至发现物像时,改用细调节器调节到物像清楚为止。移动装片,把合适的观察部分移至视野中心。
3. 高倍镜观察
眼睛离开目镜从侧面观察,旋转转换器,将高倍镜转至正下方,注意避免镜头与玻片相撞。再用目镜观察,仔细调节光圈,使光线的明亮度适宜。用细调节器校正焦距使物镜清晰为止。将最适宜观察部分移至视野中心,绘图。不要移动装片位置,准备用油镜观察。
4. 油镜观察
(1)提起镜筒约2cm,将油镜转至正下方。在玻片标本的镜检部位(镜头的正下方)滴一滴香柏油。(2)从侧面注视,小心慢慢降下镜筒,使油镜浸在油中至油圈不扩大为止,镜头几乎与装片接触,但不可压及装片,以免压碎玻片,损坏镜头。
(3)将光线调亮,左眼从目镜观察,用粗调节器将镜筒徐徐上升(切忌反方向旋转),直至视野中有物像出现时,再用细调节器校正焦距。如因镜头下降未到位或镜头上升太快未找到物像.必须再从侧面观察,将油镜降下,重复操作直至物像看清为止。仔细观察并绘图。
(4)再次观察,提起镜筒,换上另一块细菌染色装片,依次用低倍镜、高倍镜和油镜观察。绘图。重复观察时可比第一次少加香柏油。