淋巴细胞的分离及鉴定
2--淋巴细胞分离技术及玫瑰花环试验
二、实验目的
了解血液中的各种细胞成分及特性。
掌握实验动物外周血中淋巴细胞的分离方法 掌握T、B淋巴细胞的区分方法及T淋巴细胞的计 数方法。
三、实验材料
1. 兔淋巴细胞分离液、 1%绵羊红细胞、 生理盐水、 pH6.4的PBS液、 Hank,s液、瑞氏染色液（I 液）、吉姆萨染色液（II液）、香柏油、二甲苯、 甲醇、 碘酊棉球、75%酒精棉球。 2. 50mL注射器，10ml玻璃离心管、50ml离心管、擦镜纸、 移液枪（枪头）、载玻片、巴氏吸管、镊子等。 3. 显微镜、离心机、
实验五
（一）淋巴细胞分离技术 （二）E玫瑰花环试验
一、实验原理
(一）淋巴细胞的分离：
兔淋巴细胞的方便来源是外周血，此次实验 采用的就是聚蔗糖溶液的密度梯度离心法。外周 血中各种细胞的密度不同，红细胞和多核白细胞 的比重密度较大，1.090左右，淋巴细胞和单核 细胞的密度为1.075～1.090。密度梯度离心法的 原理主要根据各类血细胞比重的差异，利用比重 介于某两类细胞之间的细胞分离液对血液离心， 使一定比重的血细胞依相应的密度梯度分布于不 同的独立带，从而达到分离的目的。
SRBC受体(Sheep red blood cell)
T细胞
SRBC
Erythocyte rosette test
红细胞玫瑰花环形成试验
T
B
T
erythrocyte antibody rosette formation test 红细胞抗体玫瑰花 环形成试验
erythrocyte antibody complement rosette formation test 红细胞抗体补体玫 瑰花环形成试验
四、实验步骤
淋巴细胞分离的原理
淋巴细胞分离的原理
淋巴细胞分离的原理主要是利用淋巴细胞在密度梯度离心中的沉降速率差异进行分离。
淋巴细胞是一种低密度细胞，其密度约为1.06 g/ml，而其他血液细胞如红细胞、粒细胞等的密度
均大于1.06 g/ml，因此可以通过离心来分离淋巴细胞。
具体操作步骤如下：
1. 采集血液样品，一般可采用外周血样品，例如静脉采血。
2. 转移血液样品至离心管中，离心管中需要加入离心介质，常用的有Ficoll或Percoll等。
3. 轻轻混合血液与离心介质，以确保均匀混合。
4. 放入离心机，进行离心。
离心过程中，血液样品会在离心介质形成的密度梯度中逐渐分层。
5. 离心结束后，离心管中会分为不同层次的组分。
上层为清澈的血浆层，中间为若干个白色或黄色的细胞层，其中最上面一个细胞层即为淋巴细胞层。
6. 使用移液器将淋巴细胞层吸取出来，转移至另一个离心管中。
7. 加入适当的洗涤缓冲液，如PBS，进行洗涤。
洗涤缓冲液
的作用是去除离心介质残留和其他杂质。
8. 离心再次沉淀淋巴细胞，并倒掉上清液。
9. 加入适量的培养液，使淋巴细胞得到适当的营养和环境，以维持其存活和生长。
通过以上步骤，可以将淋巴细胞从血液中分离出来，并得到较为纯净的淋巴细胞样本，便于后续实验和研究的进行。
详细的淋巴细胞的分离、计数图文教程
<交界液面：一定不要打乱 >
离心 〔200lt;1000rpm,5min> 重复2次
血浆
分层液 红细胞 粒细胞
淋巴细胞与 单核细胞层
用Hank’s液重悬细胞 取10ul细胞悬液与90ul白细胞 计数液或台盼兰计数液混合
取10ul于细胞计数板上
细胞计数
细胞计数
本实验：淋巴细胞
实验方案
抽取外周血 分离淋巴细胞 细胞计数
实验材料
1. 肝素抗凝血 2. Hank’s液 3. 淋巴细胞分离液 4. 水平离心机 5. 显微镜 6. 细胞计数板
实验步骤
肝素抗凝静脉血1.5ml 加1.5mlHank’s液稀释
置于2ml淋巴细胞分离液上
稀释后的 抗凝血
淋巴细胞 分离液
数上不数下,数左不数右.
细胞计数板
实验结果
细胞数量：
单个核细胞浓度〔细胞数/ml>
= 2个大方格内细胞总数
×104×10 <稀释倍数
2
细胞活力检测：〔死细胞被染成蓝色,活细胞不着色
活细胞数
活细胞百分率 =
细胞总数
× 100%
密度梯度离心法分离外周血单个核细胞：
纯度在90%以上 淋巴细胞约占90-95% 细胞收获率可达80-90% 活细胞百分率在95%以上
注意事项
稀释的肝素抗凝血,沿管壁轻轻叠加于分离液上, 使两者形成一个清晰地界面.
细胞经离心分层后,缓慢小心吸取,切勿打破形成 的细胞层.
细胞计数的仪器
血细胞分析仪，临床常用
装有自动显微镜观察系统
自动细胞计数仪
知识回顾 Knowledge Review
T淋巴细胞的分离、计数
XX医学院免疫学教研室
淋巴细胞的分离及鉴定
淋巴细胞的分离及鉴定离⼼分离技术与淋巴细胞分离及鉴定【实验⽬的】1.了解离⼼分离技术的原理与分类。
2.掌握应⽤密度梯度离⼼法分离单个核细胞及B淋巴细胞鉴定的⽅法。
【实验原理】1.利⽤离⼼⼒将悬浮液中的悬浮微粒快速沉降，借以分离⽐重不同的各种物质成分。
因此⽤⽐重与被分离细胞⽐重相近的细胞分离液则可通过密度梯度离⼼⽅法，在分离液界⾯上收集到所需要的单个核细胞。
2.⽤过氧化物酶标记的抗IgM，在⼀定条件下与淋巴细胞混合，标记的抗IgM抗体可以与B细胞表⾯的IgM结合，通过DAB显⾊，在普通光学显微镜下观察可见细胞膜上出现特定染⾊。
【实验步骤】⼀.细胞分离1.将⼩⿏⽤颈椎脱⾅法处死，解剖左侧腹腔靠上部位，将腹膜剪开，找到并取出脾脏。
2.将脾脏置于培养⽫内100⽬筛⽹上，加⼊8ml的⽣理盐⽔，⽤磨棒磨碎脾脏后过滤，即获得脾细胞混合悬液。
3.1500rpm,5min,离⼼细胞混合悬液，弃部分上清，调整体积⾄4ml,重悬细胞。
4.取盛有3ml细胞离⼼液（⽐重1.088）的试管⼀⽀，⽤移液器加⼊细胞混合液4ml。
5.将试管离⼼1800rpm，（上升和下降率为2）20℃30min。
6.离⼼后取出试管，观察细胞分层，底层为红⾊的红细胞，依次向上为细胞分离液和⽣理盐⽔，在此之间可见⼀层淡淡地⽩⾊细胞层。
7.⽤尖吸管⼩⼼取出中层间的细胞到另⼀洁净离⼼管，并加2ml PBS洗涤⼀次，1500rpm离⼼5min后去上清。
8.再将细胞均匀悬浮于0.1ml PBS中，取出10µl滴于黏附剂处理的载玻⽚上，⾃然⼲燥后，可进⾏细胞类型鉴定。
⼆.细胞鉴定1.分离出单个核细胞并取出10µl滴于黏附剂处理的载玻⽚左右各⼀滴涂⽚，⾃然⼲⽚2.在室温条件下，⽤甲醇固定细胞，⾃然⼲燥后⽤蜡笔标出细胞范围，蒸馏⽔洗三次。
3.配制封闭液。
室温浸泡30分钟，PBS洗3次。
4.滴加适当稀释（1:100）的过氧化物酶标记的兔抗⼩⿏IgM抗体于左侧涂⽚，滴加适量的封闭液于右侧涂⽚（做阴性对照），于37℃30分钟，PBS洗2分钟3次。
T细胞增殖试验
二. 淋巴细胞的功能测定技术
（一）体外法 1．淋巴细胞增殖试验 （1）T细胞增殖试验（T淋巴细胞转化试验） ① T细胞 + PHA 培养，淋巴母细胞转化 染色 计数转化细胞百分率 ② T细胞 + PHA 培养，淋巴母细胞转化 + 3H-TdR 测定cpm值 ③ T细胞 + PHA 培养，淋巴母细胞 + MTT 测定OD值
第二节 淋巴细胞的检测技术
一.淋巴细胞的分离 (一)外周血单个核细胞(淋巴细胞 > 90%)的分 离 密度梯度离心法
(2000rpm,15min)
(密度为1.077)
(二）淋巴细胞亚群的分离及鉴定 1.E花环分离法：
人T细胞(表达CD2，即E受体）＋绵羊 红细胞(SRBC) 形成E花环 密度梯 度离心，花环细胞沉降于管底 裂解 SRBC 获纯化T细胞
4.流式细胞术（flow cytometry, FCM）： 荧光素标记抗体＋待检细胞单列经过 FACS分离（荧光素不同）的细胞 * FACS：荧光激活细胞分类仪(fluorescent activated cell sorter)
流式细胞仪
5.磁珠分离术： (1)直接法： 免疫磁珠(磁性微粒结合抗体) + 细胞 通过磁场 分离磁珠结合细胞 +解离剂 获纯化细胞 (2)间接法： 免疫磁珠(磁性微粒结合第二抗体) + 细 胞 + 抗体 通过磁场 分离磁珠结合细胞 +解离剂 获纯化细胞
划痕法
② 乳酸脱氢酶(LDH)释放法 靶细胞(YAC-1细胞) + 效应细胞(小鼠脾胞) LDH释放 + LDH底物(氧化型辅酶I、吩嗪二甲酯硫酸 盐和硝基氯化四氮唑蓝) 形成甲基化合物(色) 测定OD570值
淋巴细胞分离实验报告
淋巴细胞分离实验报告淋巴细胞分离实验报告引言：淋巴细胞是免疫系统中的重要组成部分，具有免疫应答和免疫调节的功能。
淋巴细胞分离实验是研究淋巴细胞功能的重要手段之一。
本实验旨在通过离心法和梯度离心法分离和纯化淋巴细胞，并验证其纯度和活力。
实验材料：- 血液样本- PBS缓冲液- 淋巴细胞分离液- Ficoll梯度离心液- 离心管- 移液管- 显微镜- 细胞计数板- 无菌培养皿- 37℃恒温培养箱实验步骤：1. 血液预处理：将新鲜的血液样本加入无菌离心管中，加入等体积的PBS缓冲液，轻轻混合。
注意避免气泡的产生。
2. 离心分层：将离心管放入离心机中，以2000rpm的速度离心10分钟。
离心后，可观察到血液分为三个层次：上层为血浆，中层为白细胞和淋巴细胞，下层为红细胞。
3. 分离淋巴细胞：将中间层的白细胞和淋巴细胞转移至新的离心管中，加入等体积的PBS缓冲液。
轻轻混合后，以1000rpm的速度离心10分钟。
此步骤的目的是去除红细胞和血浆。
4. 梯度离心：将混合后的细胞悬液加入离心管中，并缓慢滴加Ficoll梯度离心液。
注意避免两种液体混合。
离心管中的液体应该形成明显的两层。
5. 离心分层：将离心管放入离心机中，以1500rpm的速度离心30分钟。
离心后，可观察到淋巴细胞在上层梯度液中形成一个白色的浑浊环。
6. 分离淋巴细胞：使用移液管将上层梯度液中的淋巴细胞转移至新的离心管中。
加入等体积的PBS缓冲液，轻轻混合。
以1000rpm的速度离心10分钟，去除梯度液。
7. 洗涤淋巴细胞：将淋巴细胞沉淀用PBS缓冲液洗涤三次，以去除梯度液和离心液中的残留物。
8. 细胞计数和活力检测：取适量的淋巴细胞悬液，用细胞计数板进行细胞计数，并观察细胞形态。
同时，使用显微镜观察细胞的活力和完整性。
结果与讨论：通过以上实验步骤，我们成功地分离和纯化了淋巴细胞。
在离心分层和梯度离心的过程中，红细胞和血浆被有效地去除，从而得到了较为纯净的淋巴细胞。
小鼠淋巴细胞的分离培养
小鼠淋巴细胞的分离培养
一、血液中淋巴细胞的分离：
1在1.5ML离心管中加入淋巴细胞分离液0.7ML；
2眼部采集小鼠的抗凝血，抗凝剂20%.。
3轻轻将血液加入淋巴细胞分离液的表面，立即以2000—2500转/分离心10MIN。
4小心吸取上层细胞，转移至另一1.5ML离心管中,再用HANK’S 悬浮至1.5ML，再离心，去上清，再悬浮，等待分型用。
二、鼠脾脏中淋巴细胞的分离：
1无菌采集鼠的脾脏，且灭菌注射器的弯针头轻轻扎取，尽可能使单个细胞分离，再分别用4层灭菌纱布过滤2次。
2将滤液小心加入淋巴细胞分离液中。
离心。
3 吸取上层淋巴细胞，HANK‘S液洗涤2次（尽可能去除淋巴
细胞分离液）。
4加入1640培养液进行培养。
、
*淋巴细胞分离液不低于全部液体的50%。
密度梯度离心法分离淋巴细胞实验原理
密度梯度离心法分离淋巴细胞实验原理下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
文档下载后可定制修改，请根据实际需要进行调整和使用，谢谢！本店铺为大家提供各种类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，想了解不同资料格式和写法，敬请关注！Download tips: This document is carefully compiled by this editor. I hope that after you download it, it can help you solve practical problems. The document can be customized and modified after downloading, please adjust and use it according to actual needs, thank you! In addition, this shop provides you with various types of practical materials, such as educational essays, diary appreciation, sentence excerpts, ancient poems, classic articles, topic composition, work summary, word parsing, copy excerpts, other materials and so on, want to know different data formats and writing methods, please pay attention!1. 密度梯度离心法简介。
在生物学研究中，密度梯度离心法是一种常用的分离和纯化生物分子或细胞的方法之一。
淋巴细胞分离记数及活性实验方案
▪ 密度梯度离心法 ▪ 流式细胞仪检测技术（FCM）
密度梯度离心法
原理：
根据各类血细胞的比重不同，采用分层液提取淋巴细 胞，PBMC与血液中的其他成分存在密度差异，利用密度在 1.077±0.001g/L之间而且近于等渗的淋巴细胞分层液做 密度梯度离心时，各种血液成分按密度梯度重新分布聚集， 血浆和血小板由于密度较低，故悬浮于分层液的上部，红 细胞和粒细胞由于密度较大,故沉于分层液的底部,PBMC密 度稍低于分层液，故位于分层液层面上，这样就可以获得 PBMC。本实验用比重为1.077聚蔗糖-泛影葡胺淋巴细胞分 离液分离出淋巴细胞。
▪ 经过密度梯度离心实验，仍需进一步分离淋巴 细胞和单核细胞，最终要舍弃单核细胞。
▪ 淋巴细胞有多个亚群，不同亚群的细胞有各自 的特征性表面标记，可利用这一点将不同亚群 细胞进行分离与提纯。
问题
密度梯度离心只是初步提纯，如何将单个核 的细胞进一步提纯，只获得淋巴细胞？
流式细胞仪检测技术
原理： 在一组混合的细胞群中，加入特异的针对特定靶细胞
实验步骤
5.此时可见液体分为4层，最下层是红细胞和粒细胞， 分离液在它的上层，最上层是血浆层，淋巴细胞在血浆 层和分离液之间。用滴管直接插入淋巴细胞层吸取淋巴 细胞。 6.将淋巴细胞放入Hanks细胞液5毫升试管中，充分混匀 1000转/min离心10min，弃去上清液及获得纯淋巴细胞。 7.取2滴细胞悬液，加入一滴2%台盼蓝静置5分钟，活性 95%左右。 8.淋巴细胞记数:PBMC数=（4大方格细胞数／4） ×10^4×稀释倍数 （1个大方格体积=长×宽×高 =1nm×1nm×0.1mm×0.1mm=10^(-4)ml）
淋巴细胞分离液分离脾淋巴细胞的原理
淋巴细胞分离液分离脾淋巴细胞的原理淋巴细胞分离液是一种常用的实验试剂，用于分离脾淋巴细胞。
通过对淋巴细胞的分离，可以获得纯净的淋巴细胞群体，为后续的实验研究提供了条件。
淋巴细胞是一类免疫细胞，主要存在于淋巴组织和淋巴液中。
淋巴细胞的分离液是一种含有特定成分的溶液，能够有效地分离脾淋巴细胞。
其原理主要包括以下几个步骤：第一步，准备脾组织。
取得小鼠的脾脏，将其置于无菌条件下进行操作。
脾脏是免疫系统的重要器官，其中富含淋巴细胞。
首先将脾脏放入含有冷PBS（磷酸盐缓冲液）的离心管中，并用离心机低速离心，以去除掉其他组织和血管。
第二步，制备单细胞悬浮液。
将脾组织移至无菌的培养皿中，用无菌匀浆棒将组织碾碎。
随后，加入适量的无菌PBS，充分混合，制备出均匀的组织悬浮液。
第三步，加入淋巴细胞分离液。
将淋巴细胞分离液缓慢地滴加到组织悬浮液中，同时轻轻摇动培养皿，使淋巴细胞分离液充分与组织悬浮液混合。
淋巴细胞分离液中的特定成分能够与其他细胞发生作用，使淋巴细胞得以分离。
第四步，离心分离。
将混合液倒入离心管中，用离心机进行高速离心。
离心的目的是通过离心力将淋巴细胞与其他细胞分离开来。
离心结束后，可观察到淋巴细胞沉积在离心管底部，上层液体中则含有其他细胞和杂质。
第五步，收集淋巴细胞。
将上层液体倒掉，只留下沉积的淋巴细胞。
用无菌的PBS洗涤淋巴细胞，去除残留的淋巴细胞分离液和其他杂质。
重复洗涤步骤，可更好地保证淋巴细胞的纯度。
通过以上步骤，我们可以获得高纯度的脾淋巴细胞。
这种分离方法简单易行，操作方便，并且能够得到较为理想的结果。
淋巴细胞的分离液在免疫学和细胞生物学等领域具有广泛的应用价值，为研究淋巴细胞的功能和机制提供了重要的实验手段。
分离淋巴细胞的方法
分离淋巴细胞的方法一、淋巴细胞的重要性1.1 淋巴细胞就像咱们身体里的小卫士。
在免疫系统这个大部队里，淋巴细胞可是起着至关重要的作用呢。
它们能识别外来的病菌、病毒这些“坏蛋”，然后发动攻击，保卫咱们的健康。
要是没有淋巴细胞，咱们的身体就像一座没有士兵守卫的城池，各种疾病就会轻易地入侵。
1.2 淋巴细胞有不同的类型，像T淋巴细胞、B淋巴细胞等，每个类型都有自己独特的本事，就像一个团队里不同专长的成员，大家齐心协力，共同守护身体的安宁。
二、密度梯度离心法2.1 这密度梯度离心法啊，就像是给淋巴细胞安排了一场特殊的“分层旅行”。
咱们得先准备好一种特殊的溶液，这个溶液有不同的密度层次，就像不同楼层的房子一样。
2.2 把含有淋巴细胞的血液样本小心地放到这个溶液上面，然后让离心机转起来。
这一转啊，就像给它们施加了魔法一样。
不同的细胞因为密度不一样，就会在这个溶液里分层。
淋巴细胞就会聚集到特定的一层，咱们就可以把这一层取出来，这样就初步把淋巴细胞分离出来了。
这方法就像是从一堆混合的珠子里，通过特殊的筛子把特定的珠子挑出来一样。
三、磁珠分选法3.1 磁珠分选法有点像用“磁石”吸引淋巴细胞。
首先呢，咱们得给淋巴细胞贴上特殊的“标签”，这个“标签”是能和磁珠结合的物质。
就好比给淋巴细胞穿上了一件能被磁珠识别的特殊衣服。
3.2 然后把这些带有“标签”的细胞放到有磁珠的环境里。
那些和磁珠结合的淋巴细胞就像被磁石吸引的小铁块一样，被吸附到一起。
咱们就能把这些吸附着淋巴细胞的磁珠分离出来，再把淋巴细胞从磁珠上弄下来，这样淋巴细胞就被成功分离了。
这就像是从一群小伙伴里，通过一个特殊的信号把特定的小伙伴召集到一起。
四、流式细胞术4.1 流式细胞术可是个比较“高大上”的方法。
想象一下，淋巴细胞就像一群在河流里游动的小鱼。
咱们有一个特殊的通道，就像一个检测站。
4.2 当淋巴细胞一个一个通过这个通道的时候，仪器就像一个超级侦探一样，能检测到每个淋巴细胞的各种特征，比如大小啊、表面的标志物啊等等。
小鼠脾脏淋巴细胞分离与计数实验报告
小鼠脾脏淋巴细胞分离与计数实验报告1. 引言小鼠脾脏淋巴细胞是免疫系统中重要的组成部分，它们在抵御病原体侵袭和保护机体免受自身免疫疾病侵害中发挥着关键的作用。
因此，为了研究小鼠脾脏淋巴细胞的特性和功能，我们需要将其从脾脏中分离出来并进行计数。
本实验旨在描述小鼠脾脏淋巴细胞的分离与计数方法。
2. 材料与方法2.1 实验材料•小鼠脾脏样品•细胞培养基•消化酶•离心管•细胞计数板•显微镜2.2 实验方法2.2.1 小鼠脾脏样品的获取1.选择适龄的小鼠，以确保其脾脏发育成熟。
2.用消毒工具将小鼠颈部暴露，进行脾脏的解剖。
3.将脾脏置于无菌的容器中，迅速将其转移到实验室。
2.2.2 小鼠脾脏淋巴细胞的分离1.将小鼠脾脏放置在无菌离心管中，并加入足够的细胞培养基。
2.使用搅拌器或离心机将脾脏组织均匀分散于培养基中。
3.加入消化酶，按照说明书中的浓度和时间进行消化。
4.在消化结束后，用细胞培养基冲洗脾脏组织，以去除余留的消化酶。
2.2.3 小鼠脾脏淋巴细胞的计数1.取适量的脾脏细胞悬液，加入细胞计数板中。
2.在显微镜下观察并计数细胞计数板中的淋巴细胞数量。
3. 实验结果3.1 小鼠脾脏样品的获取从适龄的小鼠身上成功解剖出脾脏，并将其转移到实验室。
3.2 小鼠脾脏淋巴细胞的分离经过消化酶的作用，小鼠脾脏细胞成功地被分离并悬浮于培养基中。
3.3 小鼠脾脏淋巴细胞的计数通过显微镜观察，我们计数了细胞计数板中的淋巴细胞数量，并记录了结果。
具体数据如下： 1. 格子1：20个淋巴细胞 2. 格子2：18个淋巴细胞 3. 格子3：22个淋巴细胞 4. 格子4：19个淋巴细胞根据计数结果求平均值，得到平均每格淋巴细胞数目为19.75个。
4. 结论根据我们的实验结果，我们成功地分离出小鼠脾脏淋巴细胞，并进行了有效的计数。
通过计数结果，可以推断小鼠脾脏淋巴细胞的数量在每格约为19.75个左右。
这些实验结果为进一步研究小鼠脾脏淋巴细胞的特性和功能提供了基础数据。
实验二淋巴细胞分离实验
注意事项
1.在Ficoll上加入稀释外周血时，应缓慢 加，以免冲散界面
2. 吸取单个核细胞层时，应避免吸出过 多的上清液或分层液而导致血小板污染
细胞计数
实验步骤 注意事项
实验步骤
1、准备计数板： 2、制备细胞悬液：收集细胞，制成单个细胞
悬液 3、加样：用吸管轻轻吹打细胞悬液，取少许
小鼠脾脏淋巴细胞的分离
目的 原理 实验步骤 注意事项
目的
熟悉淋巴细胞和外周血单个核细胞 （PBMC）的分离方法
原理
脾脏各种血细胞的密度不尽相同， 利用淋巴细胞分层液（Ficoll）作 密度梯度离心，使一定比重的细胞 群按相应密度梯度分布，从而将各 种血细胞加以分离。
原理
外周血
红细胞
1.093
粒细胞
单个核细胞 (PBMC) 血小板
淋巴细胞 单核细胞
1.092 1.075~1.090
1.030~1.035
Ficoll：1.077±0.001
稀
释
外
周, 30min
Ficoll
Ficoll
稀释的血浆、 血小板 PBMC
红细胞 粒细胞
实验步骤
1.实验一获取的小鼠脾脏载玻片研磨 （研磨同时滴加1640培养液，保持细 胞活性）
细胞悬液，在计数板上盖玻片的一侧加微量细 胞悬液， 4、计数：在显微镜下，用10×物镜观察计数 板四角大方格中的细胞数
实验步骤
5、计算：将结果代入下式，得出细胞密度 细胞数/毫升原液 =（4大格细胞数之和/4）×104
注意事项
1.取样计数前，应充分混匀细胞悬液 2.加样量不要溢出盖玻片，也不要过少或带
气泡 3.细胞压中线时，数上不数下，数左不数右 4.本法要求细胞密度不低于104细胞/ml 5.镜下计数时，细胞数过少或过多，说明稀
淋巴细胞分离的常用方法及原理
贵州中公教育1淋巴细胞分离的常用方法及原理检验学中的淋巴细胞分离的常用方法及原理是事业单位考试中重要的考点之一，是需要我们着重掌握的内容。
今天让我们一起来学习相关的知识点吧。
纯淋巴细胞群的采集是利用单核细胞在37℃和Ca2+存在时，能主动粘附在玻璃、塑料、尼龙毛、棉花纤维或葡聚糖凝胶的特性，从单个核细胞悬液中除去单核细胞，从而获得纯淋巴细胞群。
主要的方法有：①粘附贴壁法;②吸附柱过滤法;③磁铁吸引法。
一、粘附贴壁法将已制备的单个核细胞悬液倾于玻璃或塑料平皿或扁平小瓶中，移至37℃温箱静置1h 左右，单核细胞和粒细胞均贴于平皿壁上，而未贴壁的非黏附细胞几乎为纯淋巴细胞，继用橡皮刮下贴壁的细胞即为纯单核细胞群。
因B 细胞也有贴壁现象，用本法分离的淋巴细胞群中B 细胞有所损失。
二、吸附柱过滤法将单个核细胞悬液注入装有玻璃纤维或葡聚糖凝胶SephadexG10的柱层中，凡有黏附能力的细胞绝大部分被吸附而黏滞在柱层中，从柱上洗脱下来的细胞主要是淋巴细胞。
此法简单易行，对细胞极少损害。
三、磁铁吸引法1.利用单核细胞具有吞噬的特性，在单个核细胞悬液中加直径为3µm 的羰基铁颗粒，置37℃温箱内短时旋转摇动，待单核细胞充分吞噬羰基铁颗粒后，用磁铁将细胞吸至管底，上层液中含较纯的淋巴细胞。
2.淋巴细胞亚群的分离原则：根据相应细胞的特性和不同的标志加以选择性纯化。
根据细胞的特性和标志选择纯化所需细胞的方法是阳性选择法，而选择性去除不要的细胞，仅留下所需的细胞为阴性选择。
常用的方法包括：①E 花环沉降法;②尼龙毛柱分离法;③亲和板结合分离法;④磁性微球分离法及荧光激活细胞分离仪分离法。
关于淋巴细胞分离的常用方法及原理大家都理解了吗?接下来我们来看一道习题，巩固一下!【例题】下列哪一种不是淋巴细胞分离方法A.粘附贴壁法B.吸附柱过滤法C.磁铁吸引法D.凝胶电泳法【答案】D 。
淋巴细胞分离实验报告
淋巴细胞分离实验报告淋巴细胞分离实验是一种常用于免疫学研究的技术。
该技术通过分离人或动物的淋巴组织，提取淋巴细胞，可以进行多种免疫学实验，如细胞增殖、细胞毒性等。
淋巴细胞分离技术最早是由Ficoll-Paque首创的。
本次实验中，我们基于Ficoll-Paque梯度离心分离技术，通过在人血液样本中离心沉淀淋巴细胞，进而提取出淋巴细胞。
实验步骤如下：首先，我们从志愿者的血液中提取出血浆和白细胞。
接着，我们添加PBS缓冲液，缓慢倒入Ficoll液，最后加入血浆和白细胞混匀后，将试管进行离心。
在离心的过程中，血液中的重质量分别在上下两个相邻稠度梯度之间分离开，从而使淋巴细胞与Ficoll液相互分离，最终沉淀到离心管梯度底部。
接下来，我们将离心管倾斜45度，使用洁净的滴管吸取淋巴细胞。
我们将沉淀的细胞用PBS缓冲液多次洗涤，去除残留的红细胞和粒细胞等杂质，从而得到较为纯净的淋巴细胞。
分离出的淋巴细胞可以用于多种免疫学实验，包括细胞东西分析、细胞毒性测定、细胞增殖、T细胞识别和细胞培养等。
由此可见，淋巴细胞分离技术是一种非常有用和重要的免疫学技术。
本次实验中，我们还可以从中总结一些技术经验。
例如，血浆和白细胞必须充分混合，并且Ficoll液需要缓慢倒入，以免对细胞造成伤害。
此外，在离心的过程中，需要保持离心时间、离心速度的一致性，同时在取样时要保持管子的倾斜角度不变，以确保淋巴细胞沉淀到尽量下面的梯度面上。
综上所述，淋巴细胞分离实验是一项十分重要的免疫学实验，能够提供纯净的淋巴细胞供科研家们进行相关实验。
同时，淋巴细胞分离技术在使用过程中要注意多方面的因素，保证实验结果的准确性和稳定性。
淋巴细胞分离计数实验报告
淋巴细胞分离计数实验报告一、实验目的本实验旨在通过淋巴细胞分离计数实验，了解淋巴细胞的分离过程和计数方法，并掌握相关技能。
二、实验原理1. 淋巴细胞的分离：通过梯度离心法将淋巴细胞与其他血液成分进行分离。
2. 细胞计数：使用显微镜和特殊计数板对淋巴细胞进行计数。
三、实验材料和设备1. 血液样品2. Ficoll-Paque液（用于梯度离心）3. 生理盐水4. 无菌注射器、针头5. 显微镜、计数板四、实验步骤1. 取适量血液样品加入无菌注射器中。
2. 将Ficoll-Paque液加入另一无菌注射器中。
3. 在针头上滴上生理盐水，避免空气进入。
4. 缓慢注入Ficoll-Paque液至血液样品上方。
注意不要将两种液体混合。
5. 离心20分钟，速度为400g。
此时，白色细胞会沉积到Ficoll-Paque层，红细胞会沉积到底部。
6. 用无菌注射器吸取上层白色细胞，转移到新的离心管中。
7. 加入适量生理盐水，混合均匀。
8. 离心10分钟，速度为200g。
此时，淋巴细胞会沉积到底部。
9. 弃去上层液体，用生理盐水洗涤淋巴细胞。
10. 在计数板上吸取适量淋巴细胞进行计数。
五、实验结果分析1. 淋巴细胞的分离效果：根据显微镜下观察到的细胞形态和数量来判断分离效果是否良好。
2. 细胞计数：根据计数板上的规则进行计数，并结合显微镜下观察到的图像来确定结果。
六、实验注意事项1. 操作过程要严格无菌，避免污染样品。
2. 离心过程中要注意速度和时间，以避免对样品产生影响。
3. 计数板要保持干燥和清洁。
七、实验结论通过本次淋巴细胞分离计数实验，我们成功地将淋巴细胞与其他血液成分进行了分离，并通过计数板对淋巴细胞进行了计数。
这些实验结果为我们进一步了解淋巴细胞的生物学特性和相关疾病提供了基础数据。
实验一外周血淋巴细胞的分离
Enzyme-linked immunoabsobant assays
融合剂
• PEG： • 亲水性，使细胞表面极性降低，导致脂质
双分子层不稳定，引起细胞融合。 • 分子量：1500-2000
HAT选择性培养
HAT: 次黄嘌呤（hypoxanthine，H） 氨基碟呤（aminopterin，A） 胸腺嘧啶（thymidine, T）
细胞的DNA生物合成有两条途径：
• 1、熟悉酶联免疫检测手段的原理。 • 2、掌握双抗夹心ELISA的试验操作。
实验四
B淋巴细胞杂交
杂交瘤的目的 --- 制备单克隆抗体
杂交瘤技术的基本原理
具有分泌抗体功能的B细胞难以在体外长期存活。 利用细胞融合技术，将免疫后的B细胞与在体外能 长期存活的骨髓瘤细胞进行融合，经过选择培养 获取杂交细胞，这种细胞称为杂交瘤细胞. （Hybridoma）
• 脾细胞和骨髓瘤细胞的异核融合体：即杂交瘤细胞，既从 脾细胞获得了HGPRT和TK，从而利用培养液中的H和T合 成DNA，又从骨髓瘤细胞获得了无限增殖的能力，因此能 在HAT选择培养液中生存下来。
实验步骤：免疫脾细胞的制备
处死小鼠，固定于解剖架上打开腹腔，取出脾脏。置 于120目的钢丝网中，将网移入盛有20ml生理盐水的 平皿中，用注射针芯轻轻压磨，使其成为单个细胞悬 液，吸取1ml细胞悬液（约5×106细胞）, 与骨髓瘤 细胞SP2/0（5×105细胞）混合，离心后弃上清 •骨髓瘤细胞:脾细胞为1:10 •一个脾脏可获约108个细胞
实验三_小鼠淋巴结分离及淋巴细胞的获取
实验三小鼠淋巴结分离及淋巴细胞的获取一、实验目的1、了解小鼠淋巴结的分布特点2、熟练掌握小鼠淋巴细胞分离技术和显微观察技术二、实验原理淋巴结是外周免疫器官，位于淋巴管汇集部位，是淋巴细胞定居和特异性免疫应答发生的场所。
淋巴结遍布全身，其中以颈部、腋下、腹股沟，肠系膜淋巴结最容易分离，是获取淋巴细胞的主要组织之一。
小鼠颈部和腋下淋巴结分布如图3 所示。
淋巴结内，T 细胞占淋巴细胞总数的75％，B 细胞占25％。
三、实验仪器和试剂1、仪器设备显微镜、玻片、解剖台、大头针、摄子、剪刀、玻璃平皿、微量移液器、注射器、离心管、筛网等2、试剂和材料（1）实验小鼠（2）生理盐水（3）75%酒精四、实验步骤1、杀鼠：将小鼠颈椎脱臼法处死，75%酒精喷表面，用大头针将鼠四肢固定在解剖台上。
2、分离淋巴结：用剪刀剪开小鼠皮肤，钝性剥开皮肤，仔细寻找小鼠取颈部和腋下淋巴结，并用镊子取下淋巴结，将淋巴结置于盛有3mL 生理盐水的玻璃平皿中。
3、淋巴结淋巴细胞的分离：（1）淋巴结处理：将淋巴结转移到筛网上，筛网置于原玻璃平皿中，用5mL 注射器内芯轻轻研磨淋巴结，不断从平皿中吸取生理盐水冲洗筛网。
（2）移开筛网，将平皿内的细胞收集于2 个1.5mL 离心管中。
（3）3000rpm 室温离心3min，弃上清。
（4）加入20～100μL 生理盐水，重悬沉淀。
4、显微观察：取出10μL 细胞悬液滴在干净干燥的玻片上，盖上盖玻片，在显微镜下观察分离到的淋巴细胞。
五、注意事项1、要按正确的方法抓小鼠和处死小鼠，避免被小鼠伤害。
2、注意区分淋巴组织和其他组织，取到的淋巴结要足够，至少三个。
3、用注射器内芯研磨淋巴结时，力度一定要准确，避免破坏淋巴细胞。
4、冲洗筛网要干净，避免淋巴浓度过低。
5、装玻片时要记得盖上盖玻片，观察时从低倍镜到高倍镜。
六、结果分析试验结果如图所示图中气泡状的小圆点就是淋巴细胞。
淋巴细胞布满这个视野，呈均匀分布，且没有其他的杂质细胞，说明试验过程很成功。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
离心分离技术与淋巴细胞分离及鉴定
【实验目的】
1.了解离心分离技术的原理与分类。
2.掌握应用密度梯度离心法分离单个核细胞及B淋巴细胞鉴定的方法。
【实验原理】
1.利用离心力将悬浮液中的悬浮微粒快速沉降，借以分离比重不同的各种物质成分。
因此
用比重与被分离细胞比重相近的细胞分离液则可通过密度梯度离心方法，在分离液界面上收集到所需要的单个核细胞。
2.用过氧化物酶标记的抗IgM，在一定条件下与淋巴细胞混合，标记的抗IgM抗体可以与
B细胞表面的IgM结合，通过DAB显色，在普通光学显微镜下观察可见细胞膜上出现特定染色。
【实验步骤】
一.细胞分离
1.将小鼠用颈椎脱臼法处死，解剖左侧腹腔靠上部位，将腹膜剪开，找到并取出脾脏。
2.将脾脏置于培养皿内100目筛网上，加入8ml的生理盐水，用磨棒磨碎脾脏后过滤，即
获得脾细胞混合悬液。
3.1500rpm,5min,离心细胞混合悬液，弃部分上清，调整体积至4ml,重悬细胞。
4.取盛有3ml细胞离心液（比重1.088）的试管一支，用移液器加入细胞混合液4ml。
5.将试管离心1800rpm，（上升和下降率为2）20℃30min。
6.离心后取出试管，观察细胞分层，底层为红色的红细胞，依次向上为细胞分离液和生理
盐水，在此之间可见一层淡淡地白色细胞层。
7.用尖吸管小心取出中层间的细胞到另一洁净离心管，并加2ml PBS洗涤一次，1500rpm
离心5min后去上清。
8.再将细胞均匀悬浮于0.1ml PBS中，取出10μl滴于黏附剂处理的载玻片上，自然干燥后，
可进行细胞类型鉴定。
二.细胞鉴定
1.分离出单个核细胞并取出10μl滴于黏附剂处理的载玻片左右各一滴涂片，自然干片
2.在室温条件下，用甲醇固定细胞，自然干燥后用蜡笔标出细胞范围，蒸馏水洗三次。
3.配制封闭液。
室温浸泡30分钟，PBS洗3次。
4.滴加适当稀释（1:100）的过氧化物酶标记的兔抗小鼠IgM抗体于左侧涂片，滴加适量
的封闭液于右侧涂片（做阴性对照），于37℃30分钟，PBS洗2分钟3次。
5.滴加DAB显色液，37 ℃显色30分钟，蒸馏水洗3次，干片后，显微镜下观察。
【注意事项】
1.向分离液管加脾细胞混合悬液时应沿试管壁缓缓加入，使脾细胞混合悬液与分离液形成
明显的界面，小心放取试管，保持界面完整，避免打乱界面，影响分离效果。
2.在滴DAB显色液前要彻底去除游离的抗体，以免假阳性结果。
3.DAB潜在致突变作用，请注意适当防护,请穿实验服并戴一次性手套操作。
【实验结果】
如下图：
如图所示，计数出B细胞含量在43%左右。
【实验讨论】
脾脏是机体最大的免疫器官，占全身淋巴组织总量的25%，含有大量的淋巴细胞和巨噬细胞，是机体细胞免疫和体液免疫的中心。
在脾脏中B淋巴细胞约占55%，根据实验结果，可能是由于操作精确，或染色不许够彻底等因素，导致结果略偏低。