酵母单杂交1
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
2、反转录生成cDNA: 反转录酶，oligo(dT) ,R6 3、与噬菌体载体分子连接 4、噬菌体的包装
mRNA
逆转录酶
cDNA
复制
双链cDNA
载体
重组DNA分子
受体菌
含重组分子的转化菌
文库中筛选 目的基因
DNA探针：带 有特殊碱基序 列的单链DNA 或RNA分子,可 以用放射性物 质或免疫性物 质标记,通过 杂交,DNA探针 常用于检测互 补的碱基序列。
三杂交系统
两个蛋 白之间 通过第 三者发 生相互 作用
TF:介导蛋白质相互作用的第三种因子. 可以是蛋白质,DNA,RNA或小分子配体
适 用 范 围
蛋白质三杂交系统
a 蛋白Z稳定了蛋白A和B之间的作用; b 蛋白质A和B通过蛋白Z相互作用; c 蛋白Z改变了A的结构，使得B能与之作用
酵母单杂交
3. 酵母双(单)杂交的 原理及应用
3.1 酵母双杂交体系 （Yeast tow-hybrid system）
基于对真核生物调控转录起始过程的认识，高灵敏度
的研究蛋白质之间关系的技术。。 细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。 反式转录激活因子GAL4：结构包括两部分： DNA结合功能域(DNA binding domain,DNA-BD) 转录激活结构域（activation domain，DNA-AD） 被分开的两者通过适当的途径在空间上较为接 近时，才能重新呈现完整的GAL4转录因子活性，并可激 活上游激活序列（upstream activating sequence, UAS）的下游启动子，使下游基因得到转录。
将共转化的酵母菌株涂布于选择培养基上，筛选 表达相互作用的杂种蛋白（激活报告基因转录） 的阳性菌落。
酵母双杂交的原理
AD BD
UAS
GAL-LACZ
AD
Prey-AD
Fra Baidu bibliotek
Bait-BD
BD
UAS
GAL-LACZ
双杂交系统的组成示意图
酵母杂交出现假阳性的原因：
1. 可能与酵母中其他蛋白质的作用有关； 2. 在某些酵母菌株中大量表达外源蛋白质 常会带来毒性作用，从而影响菌株生长及 报告基因的表型； 3. 为了抑制背景表达而在培养基中添加的 3-AT（3-Aminotriazole，氨基三唑，一种 除草剂)或6-Azauracil（氮尿嘧啶）也对菌 株有一定毒性，使一些蛋白质间较弱的相 互作用可能会因此而被掩盖 。
酵母单杂交体系的主要优点:
通过筛选DNA文库可直接得到与靶序列相 互作用的蛋白质基因序列，而无需分离、 纯化蛋白。 酵母单杂交体系检测到的与DNA结合的蛋 白质是处于自然构象，克服了体外研究时 蛋白质通常处于非自然构象的缺点，因而 具有很高的灵敏性。
分子生物学技术
1. cDNA文库
cDNA文库(complementary DNA library)以 组织细胞中的mRNA为模板，反转录合成双 链cDNA ，各cDNA分子分别插入载体形成 重组子，再导入宿主细胞克隆扩增。这些 在重组体内的cDNA的集合即cDNA文库。
构建步骤：
1、高质量mRNA制备：纯化试剂盒，生物 素
酵母单杂交体系是1993年由Wang和Reed创立的
酵母单杂交体系是借鉴酵母双杂交体系的 基本原理，通过观察酵母细胞内报告基因 的表达状况，研究DNA一蛋白质之间的相 互作用。
酵母单杂交系统组成
(1)将文库基因片段与GAL4转录激活域融合
表达的cDNA文库质粒；
(2)含有目的基因和下游报告基因的报告质 粒. （3）三缺型酵母受体：Leu- ，His-，Ura （Leu，His及尿嘧啶合成缺陷型 ）
酵母双杂交系统的应用：
发现新蛋白和蛋白的新功能 研究抗原和抗体的作用（细胞内） 检测已知蛋白质之间的相互作用 确定末知蛋白之间的相互作用 确定基因治疗中多肽类药物的作用机理
酵母双杂交系统的优点
用体内实验来研究蛋白质的相互作用，方法精确， 不受外界影响，易于操作; 所有操作均在核酸水平进行，无需纯化大量的蛋 白质，可以精确测定蛋白质的弱相互作用； 运用范围较大：酵母双杂交系统中的诱饵蛋白可 以是完整的蛋白质，也可以是蛋白质的一个功能 区，可以大到一个完整的肿瘤抑制蛋白，也可以 小到一个约22个氨基酸的多肽。
Fused peptide
Gal-AD
cyc1
lacz 薛红卫 2004
基本流程:
构建含靶结合序列的报告载体 转化酵母细胞 检测基础报告表达 筛选AD融合文库 排除假阳性筛选出阳性克隆 扩增阳性克隆，以证实DNA一蛋白质结合 活性 进一步分析:
酵母单杂交技术的应用
(1)确定已知DNA一蛋白质之间是否存在相互 作用; (2)分离编码结合于目的顺式调控元件或其他 短DNA结合位点蛋白的新基因; (3)定位已经证实的具有相互作用的DNA结合 蛋白的DNA结合结构域以及准确定位与 DNA结合的核苷酸序列。 （4）正向与反向单杂交体系的结合还可用于 筛选阻碍DNA与蛋白质相互作用的突变的 单个核苷酸
双杂交系统组成部分:
选择缺失GAL4编码基因的酵母寄主菌株
表达诱饵蛋白的载体，诱饵即是我们感兴趣的蛋 白，它和DNA结合结构域融合. 表达靶蛋白的载体，靶蛋白即是我们要寻找的可 以与诱饵相互作用的蛋白，靶蛋白可以是一个已 知的蛋白，也可以是cDNA文库编码的蛋白.同诱 饵相似，靶蛋白和转录激活结构域融合. 一个或多个报告基因(lacz his3 leu)
A cDNA AD融合表达文库
A B
B 双重报道子
筛选cDNA AD融合表达文库的示意图
Construction of library Gal-AD Fused peptide
Introduce bait vector into yeast
Gal cis
cyc1 lacz
Library screening
酵母双杂交系统的局限性
该系统要求Bait蛋白能够被稳定地表达成融 合蛋白，且该融合蛋白必须能被转运到细 胞核内，因而不能被转运到细胞核内的蛋 白质如细胞浆蛋白、细胞膜蛋白的相互作 用的研究就不宜用该系统; 如果某些哺乳动物细胞蛋白质是经过翻译 后加工才能相互作用，则该系统也不适用， 因为酵母的后加工系统与哺乳动物细胞后 加工系统不尽相同.
mRNA
逆转录酶
cDNA
复制
双链cDNA
载体
重组DNA分子
受体菌
含重组分子的转化菌
文库中筛选 目的基因
DNA探针：带 有特殊碱基序 列的单链DNA 或RNA分子,可 以用放射性物 质或免疫性物 质标记,通过 杂交,DNA探针 常用于检测互 补的碱基序列。
三杂交系统
两个蛋 白之间 通过第 三者发 生相互 作用
TF:介导蛋白质相互作用的第三种因子. 可以是蛋白质,DNA,RNA或小分子配体
适 用 范 围
蛋白质三杂交系统
a 蛋白Z稳定了蛋白A和B之间的作用; b 蛋白质A和B通过蛋白Z相互作用; c 蛋白Z改变了A的结构，使得B能与之作用
酵母单杂交
3. 酵母双(单)杂交的 原理及应用
3.1 酵母双杂交体系 （Yeast tow-hybrid system）
基于对真核生物调控转录起始过程的认识，高灵敏度
的研究蛋白质之间关系的技术。。 细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。 反式转录激活因子GAL4：结构包括两部分： DNA结合功能域(DNA binding domain,DNA-BD) 转录激活结构域（activation domain，DNA-AD） 被分开的两者通过适当的途径在空间上较为接 近时，才能重新呈现完整的GAL4转录因子活性，并可激 活上游激活序列（upstream activating sequence, UAS）的下游启动子，使下游基因得到转录。
将共转化的酵母菌株涂布于选择培养基上，筛选 表达相互作用的杂种蛋白（激活报告基因转录） 的阳性菌落。
酵母双杂交的原理
AD BD
UAS
GAL-LACZ
AD
Prey-AD
Fra Baidu bibliotek
Bait-BD
BD
UAS
GAL-LACZ
双杂交系统的组成示意图
酵母杂交出现假阳性的原因：
1. 可能与酵母中其他蛋白质的作用有关； 2. 在某些酵母菌株中大量表达外源蛋白质 常会带来毒性作用，从而影响菌株生长及 报告基因的表型； 3. 为了抑制背景表达而在培养基中添加的 3-AT（3-Aminotriazole，氨基三唑，一种 除草剂)或6-Azauracil（氮尿嘧啶）也对菌 株有一定毒性，使一些蛋白质间较弱的相 互作用可能会因此而被掩盖 。
酵母单杂交体系的主要优点:
通过筛选DNA文库可直接得到与靶序列相 互作用的蛋白质基因序列，而无需分离、 纯化蛋白。 酵母单杂交体系检测到的与DNA结合的蛋 白质是处于自然构象，克服了体外研究时 蛋白质通常处于非自然构象的缺点，因而 具有很高的灵敏性。
分子生物学技术
1. cDNA文库
cDNA文库(complementary DNA library)以 组织细胞中的mRNA为模板，反转录合成双 链cDNA ，各cDNA分子分别插入载体形成 重组子，再导入宿主细胞克隆扩增。这些 在重组体内的cDNA的集合即cDNA文库。
构建步骤：
1、高质量mRNA制备：纯化试剂盒，生物 素
酵母单杂交体系是1993年由Wang和Reed创立的
酵母单杂交体系是借鉴酵母双杂交体系的 基本原理，通过观察酵母细胞内报告基因 的表达状况，研究DNA一蛋白质之间的相 互作用。
酵母单杂交系统组成
(1)将文库基因片段与GAL4转录激活域融合
表达的cDNA文库质粒；
(2)含有目的基因和下游报告基因的报告质 粒. （3）三缺型酵母受体：Leu- ，His-，Ura （Leu，His及尿嘧啶合成缺陷型 ）
酵母双杂交系统的应用：
发现新蛋白和蛋白的新功能 研究抗原和抗体的作用（细胞内） 检测已知蛋白质之间的相互作用 确定末知蛋白之间的相互作用 确定基因治疗中多肽类药物的作用机理
酵母双杂交系统的优点
用体内实验来研究蛋白质的相互作用，方法精确， 不受外界影响，易于操作; 所有操作均在核酸水平进行，无需纯化大量的蛋 白质，可以精确测定蛋白质的弱相互作用； 运用范围较大：酵母双杂交系统中的诱饵蛋白可 以是完整的蛋白质，也可以是蛋白质的一个功能 区，可以大到一个完整的肿瘤抑制蛋白，也可以 小到一个约22个氨基酸的多肽。
Fused peptide
Gal-AD
cyc1
lacz 薛红卫 2004
基本流程:
构建含靶结合序列的报告载体 转化酵母细胞 检测基础报告表达 筛选AD融合文库 排除假阳性筛选出阳性克隆 扩增阳性克隆，以证实DNA一蛋白质结合 活性 进一步分析:
酵母单杂交技术的应用
(1)确定已知DNA一蛋白质之间是否存在相互 作用; (2)分离编码结合于目的顺式调控元件或其他 短DNA结合位点蛋白的新基因; (3)定位已经证实的具有相互作用的DNA结合 蛋白的DNA结合结构域以及准确定位与 DNA结合的核苷酸序列。 （4）正向与反向单杂交体系的结合还可用于 筛选阻碍DNA与蛋白质相互作用的突变的 单个核苷酸
双杂交系统组成部分:
选择缺失GAL4编码基因的酵母寄主菌株
表达诱饵蛋白的载体，诱饵即是我们感兴趣的蛋 白，它和DNA结合结构域融合. 表达靶蛋白的载体，靶蛋白即是我们要寻找的可 以与诱饵相互作用的蛋白，靶蛋白可以是一个已 知的蛋白，也可以是cDNA文库编码的蛋白.同诱 饵相似，靶蛋白和转录激活结构域融合. 一个或多个报告基因(lacz his3 leu)
A cDNA AD融合表达文库
A B
B 双重报道子
筛选cDNA AD融合表达文库的示意图
Construction of library Gal-AD Fused peptide
Introduce bait vector into yeast
Gal cis
cyc1 lacz
Library screening
酵母双杂交系统的局限性
该系统要求Bait蛋白能够被稳定地表达成融 合蛋白，且该融合蛋白必须能被转运到细 胞核内，因而不能被转运到细胞核内的蛋 白质如细胞浆蛋白、细胞膜蛋白的相互作 用的研究就不宜用该系统; 如果某些哺乳动物细胞蛋白质是经过翻译 后加工才能相互作用，则该系统也不适用， 因为酵母的后加工系统与哺乳动物细胞后 加工系统不尽相同.