高效液相色谱法同时测定枳壳饮片中4种黄酮类化合物的含量

0
0
59.94
12
天津市敬一堂药店
4.45
40.26
1.31
21.97
67.99
13 广州保利祝福你大药店 5.36
0.46
3.59
0
9.41
14
广州柏康连锁药店
4.43
3.03
4.43
1.08
12.97
15 上海雷允上西区分公司 5.34
39.03
2.95
22.94
70.26
16 浙江杭州中药饮片厂
8.52
27.68
77.14
7
广州市统一药店
4.24
40.05
1.58
23.08
68.95
8
天津津东大药房
0
26.49
0
0
26.49
9 重庆医科大学第一附属 9.42
20.40
5.94
13.2
48.96
医院
10
重庆市益寿堂药店
3.88
21.87
3.27
0.13
29.15
11 重庆市桐君阁大药店
0
59.94
0.28
3.28
0.20
8.47
27
北京同仁堂
2.53
32.71
2.27
21.21
58.72
28 四川省乐山建为县人民 1.10
28.83
1.55
32.21
63.69
医院
-4-
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3 讨论
3.1 检测波长的选择
将含有柚皮芸香苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷对照品混合溶液进样分离后，利用 DAD 检测器在 200～400 nm 扫描其吸收光谱，4 种成分均在 283 nm 处有最大吸收，因此选择其 为测定波长。
2.4 样品含量测定
对市售 28 批麸炒枳壳饮片按照 “供试品溶液的制备”项下的方法制备供试品溶液，按 “2.1”项下色谱条件进样 10µL，记录峰面积，计算枳壳饮片中柚皮芸香苷、柚皮苷、橙皮苷、 新橙皮苷含量，结果见表 1。
结果表明，市售大部分麸炒枳壳饮片中以柚皮苷和新橙皮苷为主，样品均有柚皮苷，但 含量从 0.21 mg·g-1 ～59.94mg·g-1， 相差 200 多倍; 新橙皮苷含量最高可达到 32.31 mg·g-1， 但有 7 份麸炒枳壳未检测到。同样，柚皮芸香苷和橙皮苷的含量差异也很大，分别从 0.00 mg·g-1～9.42 mg·g-1，0.00 mg·g-1～27.82 mg·g-1，4 种黄酮总量差异也很大，8.02 mg·g-1～82.73 mg·g-1，相差 10 倍之多。
2.2 对照品溶液及供试品溶液的制备
2.2.1 对照品溶液
精密称取柚皮芸香苷对照品 1.27mg、柚皮苷对照品 10.32mg、橙皮苷对照品 1.23mg、 新橙皮苷 10.25mg 置 10mL 容量瓶中，加甲醇溶解，稀释并定容，作为对照品溶液。
2.2.2 供试品溶液
称取枳壳饮片约 10g，用粉碎机粉碎，过 60 目筛，精密称取 1.0g，置 20mL 圆底烧瓶 中，加 20mL 水，水浴加热回流提取 1h，放冷，滤过，药渣加入 20mL 水同样操作提取 2 次，每次 1h，过滤，合并过滤液，减压浓缩，移至 10mL 容量瓶，加水定容，为供试品原 液，再精密量取供试品原液 1mL 置 10mL 量瓶中，加水稀释并定容，为供试品溶液。进样 前 0.45µm 滤膜过滤。
取同一份供试品溶液，在 0、4、8、12、16、20、24h 分别进样测定，按“2.1”项下色谱 条件进样 10ul, 记录峰面积，结果表明，供试品溶液在 24h 内基本稳定，柚皮芸香苷、柚皮 苷、橙皮苷、新橙皮苷峰面积的 RSD 分别为 0.21%，0.40%，0.23%，1.0%。 2.3.5 回收率试验
精密量取同一已知含量的枳壳饮片约 1.0g 置 4 个 10mL 容量瓶中，分别加入柚皮芸香 苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷对照品混合溶液 0，0.4，0.6，0.8ml，按照“供试品的制备” 项下方法制备，取续滤液按 2.1”项色谱条件下测定，记录峰面积，由测得量与加入量计算 回收率，结果低、中、高 3 种浓度的柚皮芸香苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的平均回收率 （n=3）分别为 96.6%，96.1%，96.0%，97.2%；RSD 分别为 0.26%，0.51%，1.9%，1.7%。
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柚皮苷：Y=4 ×106 X-31503 4,（r =0.9996），橙皮苷：Y=523735 X-69214 （r =0.9998）， 新橙皮苷：Y=4×106 X-3393 62（r =0.9998）。柚皮芸香苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷最 低检测浓度为（S/N>3）：3.70，3.00，3.60，2.95ng·mL-1。 2.3.2 精密度试验
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表 1 28 种麸炒枳壳中柚皮芸香苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷含量测定结果（n=3）
编
来源
柚皮芸香 柚皮苷
橙皮苷 新橙皮苷 总黄酮
号
苷 mg·g-1
mg·g-1
mg·g-1
mg·g-1
mg·g-1
1
辽宁朝阳大药房
7.43
2.40
3.45
1.67
14.95
枳壳为芸香科 Rulaceae 植物酸橙 Citrus aurantium L．及其栽培变种的干燥未成熟果实， 是临床上常用的理气药之一。具有理气开胸．行滞消胀之功效，主治胸胁气滞、胀满疼痛、 食积不化、痰饮内停、胃下垂、脱肛、子宫脱垂等症。黄酮类成分柚皮苷、新橙皮苷、柚皮 芸香苷、橙皮苷为枳壳的主要活性成分。我国 2005 版药典用高效液相法测定柚皮苷 [1]，枳 壳饮片及制剂中橙皮苷、新橙皮苷的含量测定方法也有报道[2~4]，但枳壳中柚皮芸香苷的含 量测定未见报道。中药为多成分多靶点发挥疗效，基于采用多指标成分定量分析能更加全面 反映枳壳饮片质量的考虑，本文在等度洗脱的条件下，采用 HPLC 法建立了同时测定枳壳水 提物中 4 种黄酮类化合物含量的方法，方法简便、快速、准确、重复性好。
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高效液相色谱法同时测定枳壳饮片中 4 种黄酮类化合 物的含量1
张宏武 1，封宇飞 2，邹忠梅 1
1 中国医学科学院中国协和医科大学，药用植物研究所，北京（100094） 2 卫生部北京医院药学部临床药理室，北京（100730）
E-mail: hongwu_zhang@163.com
分钟
A
B
图 1 高效液相色谱图
Fig.1 HPLC chromatograms
A. 对照品（reference substances） B. 枳壳样品 （Citrus aurantium L. sample） 1. 柚皮芸香苷（Narirutin） 2. 柚皮苷（naringin） 3. 橙皮苷（hesperidin） 4. 新橙皮苷（neohesperidin）
1 本课题得到教育部高等学校博士学科点基金（20070023030）的资助。
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1.00
1.00
AU
1 2
3 4
AU
1 2
3 4
0.80
0.80
0.60
0.60
0.40
0.40
0.20
0.20
0.00
0.00
5.00
10.00
分钟
15.00
5.00
10.00
4.50
26.83
4.24
20.79
56.36
17
上海养合堂
5.07
0.38
2ห้องสมุดไป่ตู้57
0
8.02
18 广州大森林公司前进分 5.36
0.21
3.82
0.15
9.54
店
19
哈尔滨敬修堂药店
0.04
39.10
0.62
0
39.76
20
哈尔滨福生堂药店
6.27
0.23
2.17
0
8.67
21
北京松兰饮片厂
5.50
精密称取同一批药材粉末 5 份，按照“供试品的制备”项下方法制备供试品溶液，按“2.1” 项下色谱条件重复进样 5 次，记录峰面积，计算柚皮芸香苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷含 量，其平均含量分别为 5.55mg/g, 36.76mg/g, 2.67mg/g, 26.02mg/g；RSD 分别为 0.56%，0.11%， 1.2%，1.6%。 2.3.4 稳定性试验
2.3 方法学考察
2.3.1 线性关系及检出限考察
精密量取含有柚皮芸香苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷对照品原溶液适量，用流动相依 次稀释成柚皮芸香苷：0.074，0.74，7.4，74，123.7µg·mL-1；柚皮苷：0.60，6.0，60.0，600.0， 999.0µg·mL-1；橙皮苷：0.072，0.72，7.2，72，120.3µg·mL-1；新橙皮苷：0.59，5.9，59.0， 590.0，982.0µg·mL-1 系列浓度，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。根据对照品浓 度（C，µg·mL-1）和对照品峰面积（As）进行线性回归。柚皮芸香苷在 0.0 74 ~123.7µg·mL-1； 柚皮苷在 0.60 ~999.0µg·mL-1；橙皮苷在 0 .072 ~120.3µg·mL-1；新橙皮苷在 0. 59~982.0µg·mL-1 内呈良好的线性，线性回归方程分别为：柚皮芸香苷：Y=345 857 X-1072 2（r =0.9999），
取同一份对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件日内重复进样 5 次，并连续测定 5d，记录 峰面积，柚皮芸香苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷日内峰面积的 RSD 分别为 0.18%, 0.20%, 0.28%, 0.31%；日间峰面积的 RSD 分别为 0.29%, 0.12%, 0.44%, 0.39%。 2.3.3 重复性试验
2 方法与结果
2.1 色谱条件
Sunfire C18 色谱柱（150mm×4.6mm，5µm），以乙腈-0.1％磷酸溶液（20：80）为流动 相，流速为 1mL·min-1，检测波长为 283nm，柱温为 30℃。进样量为 10uL。在该色谱条件 下，柚皮芸香苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷均能达到基线分离。见图 1。
2 河北安新安康大药房
5.53
30.28
4.97
16.38
57.16
3
河北安新万通药业
4.39
22.87
4.47
12.6
44.33
4 辽宁朝阳成大方圆药店 8.45
29.54
3.89
22.35
64.23
5 辽宁朝阳康宁大药房
4.34
0.50
2.11
0.09
7.042
6 天津南开同辉大药房
6.45
34.49
摘 要:建立高效液相色谱法测定枳壳饮片中柚皮芸香苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的含
量。采用 SunfireC18 色谱柱（150mm×4.6mm，5µm），以乙腈-0．1％磷酸溶液（20：80） 为流动相，流速为 1mL·min-1，检测波长为 283nm，柱温为 30℃。结果：柚皮芸香苷、柚皮 苷、橙皮苷和新橙皮苷 4 个化合物分别在 0.074~123.7µg·mL-1；0.60~999.0µg·mL-1 ； 0.072~120.3µg·mL-1；0.59~982.0µg·mL-1 范围内线性良好，其平均回收率分别为 96.6%， 96.1%，96.0%，97.2%。该方法简便、快速、准确、重复性好，可用于枳壳中柚皮芸香苷、 柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的同时测定。 关键词:高效液相色谱法；枳壳；柚皮芸香苷；柚皮苷；橙皮苷；新橙皮苷
3.2 样品的处理
我们比较了 95%乙醇回流提取、超声 20min，水溶液回流提取、超声 20min，4 种提取 方式的考察，发现 95%乙醇和水溶液回流提取方式提取比较完全。但考虑中药饮片临床入 药多为水煎液，故选择水溶液回流提取。
36.43
2.63
24.45
69.01
22
北京宏生堂药店
6.71
34.79
5.43
16.85
63.78
23
辽阳红太阳药业
0
40.86
0
0
40.86
24
沈阳四方药大药房
1.13
36.09
27.82
0.38
65.42
25
沈阳东北大药房
5.57
13.16
4.51
10.71
33.95
26
广州仁和堂药店
4.71
1 仪器与试药
Waters 2690 高效液相色谱仪（996-PDA 二极管阵列检测器,515 泵，Empower 工作站），AT201 型十万分之一电子天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公 司）；Millipore 超纯水机（美国 Millipore 公司）；柚皮芸香苷、柚皮苷、橙皮苷、 新橙皮苷对照品均为自制，经光谱分析和 HPLC 面积归一化法测定含量分别为 97.4%、 96.8%、97.8%、95.8%。乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。28 批麸炒枳壳样品购于全国 12 个不同省、市药店及不同的产地。所有样品由中国医科院药用植物研究所林余霖副研究 员鉴定，均为芸香科植物 Rulaceae 植物酸橙 Citrus aurantium L．及其栽培变种的干燥未成 熟果实。