高效液相色谱法同时测定枳壳饮片中4种黄酮类化合物的含量

高效液相色谱法同时测定枳壳饮片中 4 种黄酮类化合 物的含量1
张宏武 1，封宇飞 2，邹忠梅 1
1 中国医学科学院中国协和医科大学，药用植物研究所，北京（100094） 2 卫生部北京医院药学部临床药理室，北京（100730）
E-mail: hongwu_zhang@
摘 要:建立高效液相色谱法测定枳壳饮片中柚皮芸香苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的含
量。采用 SunfireC18 色谱柱（150mm×4.6mm，5µm），以乙腈-0．1％磷酸溶液（20：80） 为流动相，流速为 1mL·min-1，检测波长为 283nm，柱温为 30℃。结果：柚皮芸香苷、柚皮 苷、橙皮苷和新橙皮苷 4 个化合物分别在 0.074~123.7µg·mL-1；0.60~999.0µg·mL-1 ； 0.072~120.3µg·mL-1；0.59~982.0µg·mL-1 范围内线性良好，其平均回收率分别为 96.6%， 96.1%，96.0%，97.2%。该方法简便、快速、准确、重复性好，可用于枳壳中柚皮芸香苷、 柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的同时测定。 关键词:高效液相色谱法；枳壳；柚皮芸香苷；柚皮苷；橙皮苷；新橙皮苷
2 方法与结果
2.1 色谱条件
Sunfire C18 色谱柱（150mm×4.6mm，5µm），以乙腈-0.1％磷酸溶液（20：80）为流动 相，流速为 1mL·min-1，检测波长为 283nm，柱温为 30℃。进样量为 10uL。在该色谱条件 下，柚皮芸香苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷均能达到基线分离。见图 1。
1 仪器与试药
Waters 2690 高效液相色谱仪（996-PDA 二极管阵列检测器,515 泵，Empower 工作站），AT201 型十万分之一电子天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公 司）；Millipore 超纯水机（美国 Millipore 公司）；柚皮芸香苷、柚皮苷、橙皮苷、 新橙皮苷对照品均为自制，经光谱分析和 HPLC 面积归一化法测定含量分别为 97.4%、 96.8%、97.8%、95.8%。乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。28 批麸炒枳壳样品购于全国 12 个不同省、市药店及不同的产地。所有样品由中国医科院药用植物研究所林余霖副研究 员鉴定，均为芸香科植物 Rulaceae 植物酸橙 Citrus aurantium L．及其栽培变种的干燥未成 熟果实。
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表 1 28 种麸炒枳壳中柚皮芸香苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷含量测定结果（n=3）
编
来源
柚皮芸香 柚皮苷
橙皮苷 新橙皮苷 总黄酮
号
苷 mg·g-1
mg·g-1
mg·g-1
mg·g-1
mg·g-1
1
辽宁朝阳大药房
7.43
2.40
3.45
1.67
14.95
枳壳为芸香科 Rulaceae 植物酸橙 Citrus aurantium L．及其栽培变种的干燥未成熟果实， 是临床上常用的理气药之一。具有理气开胸．行滞消胀之功效，主治胸胁气滞、胀满疼痛、 食积不化、痰饮内停、胃下垂、脱肛、子宫脱垂等症。黄酮类成分柚皮苷、新橙皮苷、柚皮 芸香苷、橙皮苷为枳壳的主要活性成分。我国 2005 版药典用高效液相法测定柚皮苷 [1]，枳 壳饮片及制剂中橙皮苷、新橙皮苷的含量测定方法也有报道[2~4]，但枳壳中柚皮芸香苷的含 量测定未见报道。中药为多成分多靶点发挥疗效，基于采用多指标成分定量分析能更加全面 反映枳壳饮片质量的考虑，本文在等度洗脱的条件下，采用 HPLC 法建立了同时测定枳壳水 提物中 4 种黄酮类化合物含量的方法，方法简便、快速、准确、重复性好。
36.43
2.63
24.45
69.01
22
北京宏生堂药店
6.71
34.79
5.43
16.85
63.78
23
辽阳红太阳药业
0
40.86
0
0
40.86
24
沈阳四方药大药房
1.13
36.09
27.82
0.38
65.42
25
沈阳东北大药房
5.57
13.16
4.51
10.71
33.95
26
广州仁和堂药店
4.71
0.28
3.28
0.20
8.47
27
北京同仁堂
2.53
32.71
2.27
21.21
58.72
28 四川省乐山建为县人民 1.10
28.83
1.55
32.21
63.69
ห้องสมุดไป่ตู้
医院
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3 讨论
3.1 检测波长的选择
将含有柚皮芸香苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷对照品混合溶液进样分离后，利用 DAD 检测器在 200～400 nm 扫描其吸收光谱，4 种成分均在 283 nm 处有最大吸收，因此选择其 为测定波长。
精密称取同一批药材粉末 5 份，按照“供试品的制备”项下方法制备供试品溶液，按“2.1” 项下色谱条件重复进样 5 次，记录峰面积，计算柚皮芸香苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷含 量，其平均含量分别为 5.55mg/g, 36.76mg/g, 2.67mg/g, 26.02mg/g；RSD 分别为 0.56%，0.11%， 1.2%，1.6%。 2.3.4 稳定性试验
3.2 样品的处理
我们比较了 95%乙醇回流提取、超声 20min，水溶液回流提取、超声 20min，4 种提取 方式的考察，发现 95%乙醇和水溶液回流提取方式提取比较完全。但考虑中药饮片临床入 药多为水煎液，故选择水溶液回流提取。
4.50
26.83
4.24
20.79
56.36
17
上海养合堂
5.07
0.38
2.57
0
8.02
18 广州大森林公司前进分 5.36
0.21
3.82
0.15
9.54
店
19
哈尔滨敬修堂药店
0.04
39.10
0.62
0
39.76
20
哈尔滨福生堂药店
6.27
0.23
2.17
0
8.67
21
北京松兰饮片厂
5.50
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柚皮苷：Y=4 ×106 X-31503 4,（r =0.9996），橙皮苷：Y=523735 X-69214 （r =0.9998）， 新橙皮苷：Y=4×106 X-3393 62（r =0.9998）。柚皮芸香苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷最 低检测浓度为（S/N>3）：3.70，3.00，3.60，2.95ng·mL-1。 2.3.2 精密度试验
0
0
59.94
12
天津市敬一堂药店
4.45
40.26
1.31
21.97
67.99
13 广州保利祝福你大药店 5.36
0.46
3.59
0
9.41
14
广州柏康连锁药店
4.43
3.03
4.43
1.08
12.97
15 上海雷允上西区分公司 5.34
39.03
2.95
22.94
70.26
16 浙江杭州中药饮片厂
2.3 方法学考察
2.3.1 线性关系及检出限考察
精密量取含有柚皮芸香苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷对照品原溶液适量，用流动相依 次稀释成柚皮芸香苷：0.074，0.74，7.4，74，123.7µg·mL-1；柚皮苷：0.60，6.0，60.0，600.0， 999.0µg·mL-1；橙皮苷：0.072，0.72，7.2，72，120.3µg·mL-1；新橙皮苷：0.59，5.9，59.0， 590.0，982.0µg·mL-1 系列浓度，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。根据对照品浓 度（C，µg·mL-1）和对照品峰面积（As）进行线性回归。柚皮芸香苷在 0.0 74 ~123.7µg·mL-1； 柚皮苷在 0.60 ~999.0µg·mL-1；橙皮苷在 0 .072 ~120.3µg·mL-1；新橙皮苷在 0. 59~982.0µg·mL-1 内呈良好的线性，线性回归方程分别为：柚皮芸香苷：Y=345 857 X-1072 2（r =0.9999），
8.52
27.68
77.14
7
广州市统一药店
4.24
40.05
1.58
23.08
68.95
8
天津津东大药房
0
26.49
0
0
26.49
9 重庆医科大学第一附属 9.42
20.40
5.94
13.2
48.96
医院
10
重庆市益寿堂药店
3.88
21.87
3.27
0.13
29.15
11 重庆市桐君阁大药店
0
59.94
分钟
A
B
图 1 高效液相色谱图
Fig.1 HPLC chromatograms
A. 对照品（reference substances） B. 枳壳样品 （Citrus aurantium L. sample） 1. 柚皮芸香苷（Narirutin） 2. 柚皮苷（naringin） 3. 橙皮苷（hesperidin） 4. 新橙皮苷（neohesperidin）
取同一份对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件日内重复进样 5 次，并连续测定 5d，记录 峰面积，柚皮芸香苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷日内峰面积的 RSD 分别为 0.18%, 0.20%, 0.28%, 0.31%；日间峰面积的 RSD 分别为 0.29%, 0.12%, 0.44%, 0.39%。 2.3.3 重复性试验