毕赤酵母LiCl 转化方法
毕赤酵母表达手册
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毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒用于在含多拷贝基因的毕赤酵母菌中表达并分离重组蛋白综述：基本特征：作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。
不仅如此，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。
它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。
同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。
这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。
与酿酒酵母相似技术：许多技术可以通用：互补转化基因置换基因破坏另外，在酿酒酵母中应用的术语也可用于毕赤酵母。
例如：HIS4基因都编码组氨酸脱氢酶；两者中基因产物有交叉互补；酿酒酵母中的一些野生型基因与毕赤酵母中的突变基因相互补，如HIS4、LEU2、ARG4、TR11、URA3等基因在毕赤酵母中都有各自相互补的突变基因。
毕赤酵母是甲醇营养型酵母：毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。
甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，还有过氧化氢。
为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在一个特殊的细胞器－过氧化物酶体－里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。
毕赤酵母感受态制作及转化
毕赤酵母感受态细胞制作1、GS115活化：100ml三角瓶中装入20ml YPD培养基，接种100ul菌保，过夜活化。
2、转接：500ml三角瓶中装入100ml YPD培养基，取1ml活化菌液接种到100ml YPD培养基中，培养至OD约为1.3-1.5。
3、收菌：将菌放置冰上15min，或者放于4°冰箱冷却。
一般100ml菌液可以制备4份感受态细胞。
将无菌水和过滤除菌的山梨醇（1M）提前置于4°冰箱冷却。
4、用100ml离心管收集菌体，4000rpm/min离心5min去除YPD培养基。
5、用20ml预冷的无菌水洗菌体，4000rpm/min离心5min，重复一次。
6、用20ml预冷的山梨醇洗菌体，4000rpm/min离心5min。
7、每个离心管中加入3ml预冷的山梨醇，重悬菌体。
7、将菌体分装至1.5ml灭菌离心管中，分装4管，4000rpm/min离心5min，弃上清。
8、每管加入80ul预冷山梨醇，重悬菌体，置于冰上待用或加入10%DMSO保存于-80冰箱。
毕赤酵母电击法转化1、将感受态细胞在冰上融化，电转杯和山梨醇在冰上预冷。
2、将80ul感受态细胞与5-10ug线性化质粒混合，转移至0.2cm电转杯中，置于冰上5min。
3、根据电转仪选择合适的程序，进行电击。
4、电击后立即加入500ul预冷的山梨醇，将电击杯中液体全部转移至无菌的1.5ml离心管中，30℃水浴2h。
5、将菌体低转速离心5min，吸出多余上清，留100ul涂板即可。
6、将菌液均匀涂布于His缺陷型培养基，30℃培养1-2天。
要准备灭菌的有：水，1M山梨醇，滤器，大离心管，1.5ml离心管，大小枪头，所有的离心都是低温离心。
[VIP专享]毕赤酵母电转化方法及转化子的筛选
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毕赤酵母电转化方法及转化子的筛选菌体的准备：1. 挑取酵母单菌落，接种至含有5ml YPD 培养基的50ml 三角瓶中，30℃、250-300r/min 培养过夜；2. 取100-500µl （≤1:100）的培养物接种至含有50ml 新鲜培养基的200mL三角摇瓶中，28~30℃、250-300r/min培养过夜(约20h)，至OD600 达到1.3~1.5；3. 将细胞培养物于4℃，1500g 离心5min，用50ml 的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；4. 按步骤3 离心，用25ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬5. 按步骤3 离心，用2-5ml，1M的冰预冷山梨醇溶液将菌体沉淀重悬；6. 按步骤3 离心，用160µl的冰预冷的1mol的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终体积约为240 ul；备注：可将其分装为80 µl 一份的包装-70冷冻起来，2周之内使用，但会影响其转化效率。
比如常见的pPIC9K的载体转GS115一般先用MD平板初筛，然后长出的克隆子可以挑到不同浓度的含G418抗性的YPD平板上筛选高拷贝。
对正确筛选出的单菌落接YPD小瓶摇活后，转大瓶BMGY摇瓶发酵。
一般对于甲醇诱导菌株，摇瓶一天左右后开始补加甲醇，就类似BMMY的功能了。
✓KM71比GS115生长的要慢。
毕赤酵母都应该是白色菌落的✓对于LOX家族蛋白的表达，可尝试在酵母培养基中加入Cu2+ 离子，提高表达量和蛋白活性?菌种保存：挑单克隆到YPD中培养18-24h,然后取菌液以1:1加入30%灭菌甘油， -80o C ul/管冻存（一般用10ug以上质粒用SalI酶切，然后直接加乙醇沉淀，70％乙醇洗一遍，约20ul ddH2O重溶。
转化效率一般大于100个克隆每ugDNA。
建议你不要用胶回收kit，回收的DNA可能还有盐，导致电击时放电时间很短。
乙醇沉淀主要步骤如下：1）酶切体系（80ul）中2倍体积的无水乙醇加1/10体积的PH5.2 NaAC，混匀2)-20℃ 20分钟沉淀3)13200rpm，20min，离心后弃上清4)75%乙醇300ul轻轻洗，同上离心5min，弃上清5)37 度烘箱至无乙醇气味（或是用摇床的出风口吹出的暖风吹）。
毕赤酵母化学转化
毕赤酵母化学转化（化学转化）如果没有电转仪，LiCl转化是一种可供选择的方法，转化率是102到103cfu/ug。
主要过程为：取过夜活化培养的菌液按1：1000接种于15ml新鲜的YPD液体培养基，30℃培养至OD600达到0.8-1.0；4℃，4500rpm离心5分钟，用8ml冰预冷的无菌水洗涤菌体，倾除洗涤液，用1mL ，4℃，4500rpm离心5分钟，沉淀用50μl冰预冷的100mmol/L LiCl悬浮，最后定容至80-90ml。
LiCl转化取适量单链鲑精DNA（2mg/mL）煮沸5min，立即置于冰上备用，取上述制备好的感受态细胞12000rpm，离心15s，吸弃LiCl溶液，按顺序依次加入50%PEG 240ml1mmol/L LiCl 36 ml单链鲑精DNA 25ml线性化质粒DNA 10 ml (约10mg)用吸头反复吹打，使细胞沉淀与加入的溶液混匀，30℃静置温育30min，42℃热击20-25min，4500rpm离心10min，吸弃转化液，细胞沉淀加1mlYPD培养基于30℃200 rpm培养2-4hr，取转化混合液100ml 涂布含100μg/mL ZeocinTM的YPDS平板，30℃培养2-3天。
LiCl 转化方法作为电转化的替代方法，在线性化DNA条件下，转化效率介于102~103cfu/ug 之间溶液：1M LiCl 用无离子水溶解，过滤除菌。
（稀释使用无菌水。
）50% PEG 3350 无离子水溶解，过滤除菌，密封保存2mg/ml变性的鲑精DNA片段（10mM Tris-HCl，pH 8.0,10mM EDTA）-20℃保存。
准备感受态细胞：1.在50ml YPD中，培养至OD600 在0.8~1.0之间（大约108个/ml）。
2.收集细胞，用25ml无菌水洗涤，1500g室温离心10min。
3.重悬细胞于1ml 体积的100mMLiCl中，将悬液转移至1.5ml离心管中。
酵母感受态的制备(化学法)
1、毕氏酵母氯化锂转化法（1）试剂1M LiCl（用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌；必要时用消毒去离子水稀释）50% PEG3350（Sigma P3640 用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌，用较紧的盖子的瓶子分装）2mg/ml salmon sperm DNA / TE（10mM Tris-Cl, pH8.0, 1.0mM EDTA）-20℃保存注：醋酸锂对毕氏酵母无效，仅氯化锂有效；PEG3350可屏蔽高浓度LiCl的毒害作用；（2）感受态毕氏酵母的制备接种Pachia pastoris到50ml YPD培养基中，30℃摇菌过夜（约24～28h）培养到OD值为0.8～1.0（约108 Cells/ml）；收获细胞，用25ml无菌水洗涤一次，室温下1500g离心10min；重悬细胞于1ml 100mM LiCl溶液中，将悬液转入1.5ml离心管；离心机最大速度离心15秒沉淀菌体，重悬菌体于400ul 100mM LiCl溶液中；按50ul/管分装，立即进行转化；注：不要将感受态酵母菌冰浴；（3）毕氏酵母的转化煮沸1ml鲑鱼精DNA 5min，迅速冰浴以制备单链担体DNA；将感受态酵母菌离心，以Tips去除残余的LiCl溶液；对于每一个转化，按以下顺序加入：50% PEG3350 240ul1M LiCl 36ul2mg/ml 单链Salmon sperm DNA 25ul5～10ug/50ul H2O 质粒DNA 50ul剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体完全分布均匀（约1min）；30℃水浴孵育30min；42℃水浴热休克20～25min;6000～8000rpm离心收集酵母菌体；重悬酵母于1ml YPD培养基，30℃摇床孵育；1～4h后，取25～100ul菌液铺选择性培养基平板，于30℃培养2～3天鉴定；2、毕氏酵母PEG1000转化法（1）试剂缓冲液A：1.0M Sorbitol，10mM Bicine，pH8.35（sigma）,3%（v/v）ethylene gl ycol缓冲液B：40%（w/v）PEG1000（sigma），0.2M Bicine，pH8.35缓冲液C：0.15M NaCl，10mM Bicine，pH8.35未污染的新鲜、试剂级DMSO，-70℃保存注：缓冲液A、B、C均用滤膜过滤，-20℃保存;将DNA直接加在冻结的酵母细胞上是本实验的关键之处（即使在冰上解冻的待转化细胞，其摄取外源DNA的能力也在解冻过程中迅速下降；如进行多样品的转化，建议按6样品/组进行）;（2）待转化毕氏酵母的制备接种环接种Pachia pastoris于YPD平板，30℃培养2d;挑取单克隆酵母菌株于10mlYPD培养基中，30℃振荡培养过夜；取步骤2中小量菌液接种到100mlYPD培养基中振荡培养，待其OD值从0.1升到0. 5～0.8；室温下3000g离心收集酵母菌体，50ml缓冲液A洗涤一次；重悬菌体于4ml缓冲液A中，按0.2ml/管分装于1.5ml的离心管中，每管加入11ulD MSO，混合后迅速于液氮中冷冻，-70℃保存（3）毕氏酵母的转化将约50ug线性化质粒DNA溶于20ul TE或水中，直接加于冻结的酵母细胞中；加入担体DNA（40ug变性超声线性化鲑鱼精DNA）以获得最大转化率；37℃水浴孵育5min，中间混合样品1～2次；取出离心管，加入1.5ml缓冲液B，彻底混匀；30℃水浴孵育1h；室温下2000g离心10min，去除上清液，菌体沉淀重悬于1.5ml缓冲液C中；离心样品，去除上清液，轻微操作将样品重悬于0.2ml缓冲液C中；将所有转化液铺于选择性平板，于30℃孵育3～4天后，鉴定；3、毕氏酵母电转化法（1）E.coli TOP10F’感受态细胞的制备取10ul TOP10F’菌液，接种于200ml LB液体培养基中活化培养，37℃，200 rpm，16～18小时。
毕赤酵母电转化
毕赤酵母电转化：
介绍：该方法无需产生去壁细胞，是产生毕赤酵母重组子的简便方法。
与去壁细胞效率相似。
细胞准备：
1 在含5mlYPD 的50ml 离心管中，培养毕赤酵母，30 度过夜
2 取0.1-0.5ml 过夜培养物，接种含500ml 新鲜培养基的2L 摇瓶，过夜生长至OD600＝1.3-1.5
3 在
4 度，1500g离心5min收集细胞,用500ml预冷的灭菌水悬浮细胞
4 如上离心，用250 ml预冷的灭菌水悬浮细胞
5 如上离心，用20ml预冷的1M山梨醇悬浮细胞
6 如上离心，用1 ml 预冷的1M山梨醇悬浮细胞，至终体积约1.5ml
注意：可冻存80ul 等量的电感受态细胞，但转化效率会下降很多
转化：
1 取80ul上述细胞与5-20ug线性化DNA（溶于5-10ulTE）混合，转入预冷的0.2cm 电转杯中。
2 在冰上放置5min
3 根据所使用装置推荐的酿酒酵母参数进行电击
4 立即加入1ml 预冷的1M山梨醇至杯中，将内容物转移至灭菌离心管中
5 分成200-600ul等份，涂于MD 或RDB平板上
6 在30 度孵育平板至克隆产生，按P41 筛选Mut+/Muts表型。
「毕赤酵母电转化方法及转化子的筛选」
毕赤酵母电转化方法及转化子的筛选菌体的准备：1.挑取酵母单菌落,接种至含有5 ml YPD 培养基的50ml三角瓶中,30C、2 50 —300r/min培养过夜；2.取100-5 0 0 口〔W 1:100〕的培养物接种至含有50ml新鲜培养基的200mL三角摇瓶中,28~30C、250-30 0 r/m i n 培养过夜〔约20h〕,至OD60O 到达 1.3~1.5;3.将细胞培养物于4 C, 1500g离心5 mi n ,用50ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；4 . 按步骤3离心,用2 5ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬5 . 按步骤3离心,用2 -5ml,1M的冰预冷山梨醇溶液将菌体沉淀重悬；6 .按步骤3 离心,用1 60 d的冰预冷的1mo 1的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬,其终体积约为240 ul;备注：可将其分装为8 0.一份的包装-70冷冻起来,2周之内使用,但会影响其转化效率. 比方常见的pPIC9K的载体转GS 115 一般先用MD平板初筛,然后长出的克隆子可以挑到不同浓度的含G4 1 8抗性的YPD平板上筛选高拷贝.对正确筛选出的单菌落接YPD小瓶摇活后,转大瓶B MGY摇瓶发酵.一般对于甲醇诱导菌株,摇瓶一天左右后开始补加甲醇, 就类似BMMY 的功能了.? KM71比GS 11 5生长的要慢.毕赤酵母都应该是白色菌落的? 对于LOX家族蛋白的表达,可尝试在酵母培养基中参加C u 2+离子,提升表达量和蛋白活性?菌种保存：挑单克隆到YPD中培养1 8 -2 4 h ,然后取菌液以1 :1参加30%M菌甘油,-8 0 °Cul/管冻存〔一般用10ug以上质粒用S alI酶切,然后直接加乙醇沉淀,7 0 %乙醇洗一遍,约20ul d dH2O重溶.转化效率一般大于100个克隆每ugDNA.建议你不要用胶回收kit,回收的D NA可能还有盐,导致电击时放电时间很短.乙醇沉淀主要步骤如下：1〕酶切体系〔8 0 ul〕中2倍体积的无水乙醇加1/1 0体积的PH5.2 NaAC,混匀2〕-20C 20 分钟沉淀3 〕1 3 2 0 0rpm, 2 0min,离心后弃上清4?〕7 5%乙酉I 3 0 0u 1轻轻洗,同上离心5 m in,弃上清5〕3 7度烘箱至无乙醇气味〔或是用搔压的出风口吹出的暖风吹〕.20〕6?ul ddH2O重溶〕电击转化：8. 将5 ~20 2的线性化DNA溶解在5-10科l TE溶液中,与80 d的上述步骤6 所得的菌体混匀,转至0.2cm冰预冷的电转化杯中；9.将电转化杯冰浴5mi n ;10.根据电转化仪提供的资料,参考其他文献及屡次摸索,确定适宜的电压、电流、电容等参数,按优化的参数,进行电击；1 1.电击完毕后,马上参加1ml 1M的冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀,转至1.5ml的EP管中；〔置于30度摇床低速培养1h,再涂板〕12.将菌体悬液涂布于M D平板上,每2 0 0 ~ 6 00 pl涂布一块平板；13.将平板置于30 c倒置培养,直至单个菌落出现〔3-4天〕.推荐：电压1.5kV ;电容2 5^F电阻2 0 0 Q o电击时间为 4 ~ 10msec=P i chia酵母表达直接PCR鉴定重组子的方法1.平板上的菌落长到肉眼可见时〔约12小时〕；2,取1ml酵母悬液4000rmp离心,pbs重悬,煮沸5 mins,放到冰上5 mins,直接就可以用做pc r的模板了3,将除了模板之外的其它P CR反响液的组分准备好,并分装.3.用灭菌的牙签挑取菌落,在PCR管中涮一下,PCR扩增,禾I」用5AOX 1和3'AOX 1引物对转化子进行PCR复筛,同时检测基因插入〔如果重组质粒以单交换的方式整合到P i ch ia pas tor i s基因组,那么会扩增到两条带,一条为 2.2k b 〔KM7 1为3 .6k b〕宿主茵AOXI基因,另一条为包括目的基因和成熟肽序列和a-facto r信号肽序列的片段.〕Ea ch 50皿aliq u ot of competen t Pichia c e lls with3g由n ea rize d p1a s midD NA wi 1 l y ield50 co 1 on i es on selecti v e medium.M u t s 表型重组酵母的诱导表达实验As a g e n er a l ru1 e whe n i n ducing exp ression,n ever a ll o w c ultu r est o be more than10-30% of y o ur total f lask volume.1,挑选一单菌落,置于装有5 0ml MGY、BMG或BMGY培养基的50 0 ml摇瓶中,于28 -30 C /2 5 0- 3 00 r pm 培养至OD600 = 2—6 〔-1 6 - 1 8 h〕;2,室温下1 5 0 0 ~300 0 g离心^5 m i n,收集菌体,用1 /5至U 1/1 0原培养体积的MM, BMM 或BMMY 重悬菌体〔约2.5~5ml 〕;3,将步骤2 所得的菌液置于100ml的摇瓶中,用双层纱布或粗棉布封口,放置于2 8 -30 °C/ 2 5 0 - 300 rpm的摇床上继续生长；4,每24 h向培养基中添加1 00 %甲醇至终浓度为0. 5 ~1.0%;5,按时间点分别取菌液样品,取样量为1ml,置于1.5 ml EP 管中,最大转速离心2~ 3 min ,分别收集上清和菌体, 分析目的蛋白的表达量和菌液最正确收获时间.时间点一般取：0、2 4、48、72、96 和 1 2 0 h;6. 对分泌表达,别离样品的上清液；对胞内表达,别离样品的菌体沉淀,带检测样品用液氮或干冰速冻后,于—80 ° C保存备用；7, 可以用S DS-PAG E、Western-B lo t及活性实验检测与鉴定重组蛋白的表达.Mu t +表型重组酵母的诱导表达实验1. 挑选一单菌落,置于装有25ml MG Y、BMG或BMGY培养基的2 50m l摇瓶中,于28-30 ° C/250-30 0rpm培养至OD6O0 = 2-6 〔〜16-18 h〕;2,室温下1500-3 000 g离心5m i n,收集菌体,用M M、BMM或BMMY重悬菌体,使O D600 =1. 0 左右〔约 1 00~200ml〕;3.将步骤2所得的菌液置于1L的摇瓶中,用双层纱布或粗棉布封口,放置于28-30° C/250- 3 00 rpm的摇床上继续生长；4,每2 4 h向培养基中添加1 00%甲醇至终浓度为0 .5〜1.0%;5,按时间点分别取菌液样品, 取样量为Im l,置于1. 5ml EP管中,最大转速离心2~3min, 分别收集上清和菌体,分析目的蛋白的表达量和菌液最正确收获时间.时间点一般取：0、6、12、24、36、48、60、72、84 和9 6h;6.对分泌表达,别离样品的上清液；对胞内表达,别离样品的菌体沉淀,带检测样品用液氮或干冰速冻后,于-80° C保存备用；7. 可以用SDS-PAGE、Wester n-Blot及活性实验检测与鉴定重组蛋白的表达.BMG Y和BM MY的换液方式有2种：1.一种是离心换液,即在生长培养结束后,转移到灭菌大离心管中,4 0O0rpm室温离心5 分钟后,用BMMYfc下菌体,再转移到摇瓶,整个过程均用灭菌移液管操作.2〕另一种是静止换液,即在生长培养结束后,将摇瓶在无菌室静止4小时后,直接在酒精灯旁倾倒培养液,再参加诱导培养基,此种方法的缺点有少量生长培养基残留.是离心换液或者静止换液,到底那个好,只有根据自己的实验结果来考量.如果只是从防治污染的角度来说,静止换液也好一些,由于操作毕竟少一些,速度也快.用新开启的分析纯甲醇,一直放在无菌室里面,每次直接用灭菌T IP吸取参加摇瓶就可以了.也有人试过用膜过滤,结果膜都溶解了.菌体是在BMM件培养的,可以不用BMMY做对照,在6 0 0nm处测OD值,培养基和P B S 光吸收都很低,P B S更方便.麦芽浸提液培养酵母〔不换液,补料〕,生长阶段结束后,密度可到达10-12,诱导培养结束后,密度可到达1 8左右.如果用1体积白M0,在生长阶段结束后,换液时 ,参加1/10 — 1/2体积白MMYS行诱导培养〔即浓缩培养〕,细胞密度也可到达20以上.通常,真正的高密度发酵只有在发酵罐里才能实现,OD 600可到达40- 6 0及以上.摇瓶很难到达那样的密度,不过可以采取浓缩培养的方式实现高密度.摇瓶不能像发酵罐那样保证通气量,但可以通过装量来暂时替代这个指标.,SMu t +/Mu t 的筛选用Sac I,Sa 1 I or S t u I线性化插入HIS4位点的载体转化GS15 5后,多数转化子应为Mut+,但也有Hi s Mut '的转化子存在(见Invitr ogen protocol p36), Not I o r Bgl 11线性化插入AOX I位点的载体转化GS155后,用MD/MM 平板可区分M ut+/Mu St .Use the p 1 a t es c o nt a in i ng the H i s + t a ans f orma n t s and scre e n f or the Mut+ and MutS ph e no type as d escrib e d below.2.U sing a st e ril e to othpick , pick one c o lony and s t reak o r patch one H i s+ tr a nsforman tin aregular patte r n on bot h an MM plate an dan M D p late, m aking s u re topatcht h e MM p 1 ate firs t .3.U se a new to o thpick f or each t r a nsform ant and con tinueunt i l1 00tr a n s form a nts have b ee n patch e d (2—3 p lates).4.T o different i a t e Mut+ fr o m Mu tS, make one patch forea c hof t h e contr ols (GS11 5/His+ M u tSA 1 b u min an d GS11 5 / H i s+ Mut+3 -g al) ont o theMD and M M pl a t es.5.Incu b ate t he p 1 ates at 30 ℃ for 2 days.6.After 2 days or 1 onger at 3 0C, s core t h e plates. Mut + tra n sforma n ts w ill grow well on both M D and MM pl a tes. Mut S tr a n s f o rmants will grow we ll o n M D plate s , b ut sh o w litt 1 e o r no growth o n t he MM pla t es.。
毕赤酵母转化方法
毕赤酵母转化方法
实验概要
本实验介绍了毕赤酵母电转化方法。
该方法无需产生去壁细胞，是产生毕赤酵母重组子的简便方法。
与去壁细胞效率相似。
实验步骤
1. 细胞准备：
1) 在含5mlYPD 的50ml 离心管中，培养毕赤酵母，30 度过夜。
2) 取0.1-0.5ml 过夜培养物，接种含500ml 新鲜培养基的2L 摇瓶，过夜生长至OD600＝1.3-1.5。
3) 在4 度，1500g离心5min收集细胞，用500ml预冷的灭菌水悬浮细胞。
4) 如上离心，用250 ml预冷的灭菌水悬浮细胞。
5) 如上离心，用20ml预冷的1M山梨醇悬浮细胞。
6) 如上离心，用1 ml 预冷的1M山梨醇悬浮细胞，至终体积约1.5ml。
注意：可冻存80ul 等量的电感受态细胞，但转化效率会下降很多。
2. 转化：
1) 取80ul上述细胞与5-20ug线性化DNA(溶于5-10ulTE)混合，转入预冷的0.2cm 电转杯中。
2) 在冰上放置5min。
3) 根据所使用装置推荐的酿酒酵母参数进行电击。
4) 立即加入1ml 预冷的1M山梨醇至杯中，将内容物转移至灭菌离心管中。
5) 分成200-600ul等份，涂于MD 或RDB平板上。
6) 在30 度孵育平板至克隆产生，筛选Mut /Muts表型。
毕赤酵母转化方案
毕赤酵母转化方案引言毕赤酵母（Baker’s Yeast）是一种常见的酵母菌，广泛用于食品加工和发酵过程中。
毕赤酵母可以将碳源转化为二氧化碳和乙醇，从而实现食品发酵和面团膨胀。
本文将介绍毕赤酵母的转化方案，包括酵母培养、酵母转化条件以及转化效果的评价。
酵母培养在进行毕赤酵母的转化实验之前，首先需要进行酵母的培养。
以下是酵母培养的步骤：1.将酵母菌存活液取出适量转移到含有酵母培养基的培养皿中。
2.用无菌棉签在培养皿上划线，以便观察酵母生长情况。
3.将培养皿封闭并置于恒温摇床中，在适当的温度下培养酵母。
酵母转化条件酵母的转化条件对于转化效果具有重要影响。
以下是常见的酵母转化条件：温度酵母转化的温度是一个重要的参数，常用的温度范围为25-40摄氏度。
不同温度下酵母的代谢和生长速率不同，因此选择合适的转化温度可以提高转化效率。
pH值pH值是影响酵母生长和代谢的另一个重要参数。
酵母转化的pH范围通常为4-7，在这个范围内酵母的生长和代谢能力较强。
溶氧量溶氧量是影响酵母转化效果的另一个因素。
较高的溶氧量可以促进酵母的生长和代谢，提高转化效率。
因此，在实验过程中应保证适当的氧气供应，通过搅拌或通气的方式提高溶氧量。
传质条件传质条件（如搅拌速度、传质面积等）也会对酵母转化效果产生影响。
适当的搅拌可以保证培养液中养分的均匀分布，提高转化效率。
同时，增加传质面积（如使用气泡或转子发酵罐）可以增加酵母与培养基之间的接触面积，促进转化反应进行。
转化效果评价转化效果通常通过酵母的生长情况、代谢产物的生成以及发酵过程的监测来进行评价。
1.酵母的生长情况可以通过观察培养液中的酵母颗粒的数量和大小以及液体的浑浊度来判断。
较好的转化效果应该能够促使酵母迅速生长和繁殖。
2.代谢产物的生成是评价转化效果的重要指标之一。
对于毕赤酵母来说，主要的代谢产物是二氧化碳和乙醇。
可以通过气体检测仪或化学分析方法来测定其生成量，以评估转化的效果。
毕赤酵母电转化方法的探索
毕赤酵母电转化方法的探索
随着科学技术的发展，毕赤酵母电转化方法日益引起了众多资深专家学者的关注，同时也在应用领域中越来越多的被采用。
毕赤酵母电转化方法是将底物介质中的毕赤酵母（Saccharomyces cerevisiae）经过电转化后，结合相应的共价捕获试剂，有效地实现了毕赤酵母的有效分离与检测。
它的优点之一是良好的灵敏度、准确性和选择性，具有良好的应用前景，能够用于检测低浓度毕赤酵母的底物介质，有效增强了检测的灵敏度。
此外，毕赤酵母电转化方法具有完全机械化特点，使得它能够更好地支持工业
化生产，并对实验室负荷有很好的控制，有效提高了工作效率。
另外，毕赤酵母电转化方法具有体积小，维护方便，使用成本低等特点，在检测技术方面也占据了一席之地。
总之，毕赤酵母电转化方法是一种在应用中越来越广泛、性能优异的新型检测
技术，它的有效应用对于众多工业化生产有着广泛的支持与帮助，予以了企业在检测技术，生产管理等方面减少以及维护成本的宝贵支持与帮助。
LiCl法转化毕赤酵母
LiCl法转化毕赤酵母LiCl法转化毕赤酵母感受态毕赤酵母的制备1. 接种Pichia pastoris到50 mL YPD培养基中，30 ℃摇菌过夜（约24～28h）培养到OD值为0.8～1.0（约108 Cells/ml）；培养基里有流沙样的菌体在流动2. 收获细胞，用25 mL无菌水洗涤一次，室温下5000 rpm离心10 min；3. 重悬细胞于1 mL 100 mM LiCl溶液中，将悬液转入1.5 mL离心管；4. 12000 rpm离心15 s沉淀菌体，重悬菌体于400 μL 100 mM LiCl溶液中；5. 按50 μL /管分装，立即进行转化；注：不要将感受态酵母菌冰浴；毕氏酵母的转化1.煮沸1ml鲑鱼精DNA 5min，迅速冰浴以制备单链担体DNA；鲑鱼精DNA主要是防止目的基因的降解，协助目的基因的转化2. 将感受态酵母菌离心，以Tips去除残余的LiCl溶液；3. 对于每一个转化，按以下顺序加入：50% PEG3350 240 μL1M LiCl 36 μL2mg/ml 单链Salmon sperm DNA 25 μL5～10 μg/50 μL H2O 质粒DNA 50 μL4. 剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体完全分布均匀（约1min）；5. 30 ℃水浴孵育30 min；6. 42 ℃水浴热休克20～25 min;7. 8000rpm离心10 min，收集酵母菌体；8. 重悬酵母于500 μL YPD培养基，30℃摇床孵育；9. 1～4 h后，取25～100 μL菌液涂布于选择性培养基平板（YPD+Zeocin），于30 ℃培养2-5天鉴定；试剂1M LiCl <用去离子蒸馏水配制，0.22um滤膜过滤除菌；必要时用消毒去离子水稀释>50% PEG3350 < 用去离子蒸馏水配制，0.45um滤膜过滤除菌，用较紧的盖子的瓶子分装>(氯化锂转化法只能PEG3350,不能用PEG8000)2 mg/ml salmon sperm DNA / TE（10mM Tris-Cl, pH8.0, 1.0mM EDTA）-20℃保存注：醋酸锂对毕氏酵母无效,对酿酒酵母有效，仅氯化锂有效；PEG3350可屏蔽高浓度LiCl的毒害作用。
毕赤酵母电转化方案
毕赤酵母电转化方案一、培养基1.BMMY培养基：酵母粉l0g，蛋白胨20g，溶于700mL去离子水，湿热灭菌30min，冷却后加入100mL 1M pH6.0磷酸钾缓冲液，100mL 10×YNB，2mL 500×B，100mL 10×M，4℃保存。
2.BMGY培养基：酵母粉l0g，蛋白胨20g，溶于700mL去离子水，湿热灭菌20min，冷却后加入100mL 1M，pH6.0，磷酸钾缓冲液，100mL 10×YNB，2mL 500×B，100mL 10×GY，4℃保存。
3.YPD培养基：酵母粉l0g，蛋白胨20g，溶于900mL去离子水，湿热灭菌30min，冷却后加入100mL 10×D，4℃保存。
4.MD培养基：800mL灭菌水中加入100mL l0×YNB，2mL 500×B，100mL 10×D，4℃保存。
5.1M，pH6.0的磷酸钾缓冲液：132mL 1M K2HPO4，868mL 1M KH2PO4，pH6.0，湿热灭菌，4℃保存。
6.10×YNB：YNB 134g(含硫酸铵)溶于1000mL去离子水，过滤除菌，4℃保存7.500×B：20mg Biotin溶于100mL去离子水，过滤除菌，4℃保存。
8.10×M：5mL甲醇与95mL去离子水混合，过滤除菌，4℃保存。
9.10×GY：100mL甘油与900mL去离子水混合，湿热灭菌，4℃保存。
10.10×D：100g葡萄糖溶于1000mL去离子水，过滤除菌，4℃保存。
11.1M 山梨醇：18.2g D-山梨醇溶于100mL去离子水，过滤除菌，4℃保存。
二、转化步骤1．接种毕赤酵母的单菌落到含有5mLYPD液体培养基的三角瓶中，30℃过夜培养。
2．转接含有50mL YPD液体培养基的大三角瓶，接种量1%，30℃培养过夜，直到OD600=1.3～1.5；3．1500g，4℃条件下离心培养液5min，再用50mL冰浴的双蒸水重悬细胞；4．重复第三步的离心操作，然后用25mL冰浴的双蒸水重悬细胞；5．重复第三步的离心操作，然后用2mL冰浴的1M的山梨醇溶液重悬细胞；6．重复第三步的离心操作，然后用100μL冰浴的1M的山梨醇溶液重悬细胞，使菌悬液体积大约为150μL；7．将80μL处理好的感受态细胞和5～20μg经过线性化了的DNA（溶解在双蒸水中，体积为5～10μL）加入一个1.5mL预冷离心管中，混匀。
LiCl法转化毕赤酵母
LiCl法转化毕赤酵母感受态毕赤酵母的制备1. 接种Pichia pastoris到50 mL YPD培养基中，30 ℃摇菌过夜（约24～28h）培养到OD值为0.8～1.0（约108 Cells/ml）；培养基里有流沙样的菌体在流动2. 收获细胞，用25 mL无菌水洗涤一次，室温下5000 rpm离心10 min；3. 重悬细胞于1 mL 100 mM LiCl溶液中，将悬液转入1.5 mL离心管；4. 12000 rpm离心15 s沉淀菌体，重悬菌体于400 μL 100 mM LiCl溶液中；5. 按50 μL /管分装，立即进行转化；注：不要将感受态酵母菌冰浴；毕氏酵母的转化1.煮沸1ml鲑鱼精DNA 5min，迅速冰浴以制备单链担体DNA；鲑鱼精DNA主要是防止目的基因的降解，协助目的基因的转化2. 将感受态酵母菌离心，以Tips去除残余的LiCl溶液；3. 对于每一个转化，按以下顺序加入：50% PEG3350 240 μL1M LiCl 36 μL2mg/ml 单链Salmon sperm DNA 25 μL5～10 μg/50 μL H2O 质粒DNA 50 μL4. 剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体完全分布均匀（约1min）；5. 30 ℃水浴孵育30 min；6. 42 ℃水浴热休克20～25 min;7. 8000rpm离心10 min，收集酵母菌体；8. 重悬酵母于500 μL YPD培养基，30℃摇床孵育；9. 1～4 h后，取25～100 μL菌液涂布于选择性培养基平板（YPD+Zeocin），于30 ℃培养2-5天鉴定；试剂1M LiCl <用去离子蒸馏水配制，0.22um滤膜过滤除菌；必要时用消毒去离子水稀释>50% PEG3350 < 用去离子蒸馏水配制，0.45um滤膜过滤除菌，用较紧的盖子的瓶子分装>(氯化锂转化法只能PEG3350,不能用PEG8000)2 mg/ml salmon sperm DNA / TE（10mM Tris-Cl, pH8.0, 1.0mM EDTA）-20℃保存注：醋酸锂对毕氏酵母无效,对酿酒酵母有效，仅氯化锂有效；PEG3350可屏蔽高浓度LiCl的毒害作用。
一种毕赤酵母高效转化感受态细胞的制备方法和转化方法
一种毕赤酵母高效转化感受态细胞的制备方法和转化方法我折腾了好久毕赤酵母高效转化感受态细胞的制备和转化方法，总算找到点门道。
一开始我真是瞎摸索，就到处找资料，按照那些传统方法做，结果老是不尽人意。
就说制备感受态细胞吧，我先是跟着一种方法，在培养毕赤酵母的时候，温度控制没搞好。
我以为只要大概在合适的范围就行了，结果这可不行，酵母生长就不太好，最后得到的感受态细胞质量很差，转化效率那叫一个低啊。
后来我再试的时候，就特别注意这个温度的事儿了。
我就把培养箱的温度精确到了小数点后一位，就好比守护一个小火苗似的，一点儿都不敢大意。
还有那个培养基的营养成分，以前我觉得只要按照配方来就好，后来发现原材料的质量也很关键。
就像是做菜，同一道菜，新鲜的食材和不新鲜的食材做出来可完全是两个味儿。
比如我之前用的一种葡萄糖，可能是放久了，有点受潮，用了这个做培养基后，酵母就不爱长。
我再来和你说说转化那步。
最开始的时候，我在添加DNA的时候，没控制好量。
当时就是凭感觉，觉得多加点肯定更好。
结果错得离谱，转化效率反而下降了。
后来我就一点点摸索，就像给一个饭量本来就小的人喂饭一样，一点点试着加合适的量。
还有在处理细胞的时候，轻柔很重要。
我之前晃荡那些试管啥的特别粗鲁，就像是赶一群羊，横冲直撞的。
结果好多细胞都被我弄坏了。
现在我都轻拿轻放的。
关于沉淀细胞这步呢，离心的速度和时间不好确定。
我试了好几个组合。
比如慢速离心时间长一点，还有快速离心时间短一点，找到一个相对合适的范围。
但这也不是一成不变的，要是酵母的生长状态不一样，这个参数可能也得微调呢。
这就像是给不同大小的孩子穿鞋子，得找合适的码。
对于电击转化那些参数，电压、电容和电阻这些，就更头疼了。
我最开始乱设一通，想着也许哪个组合就对了。
但很多时候细胞一电击就死了不少，或者就是没成功转化。
后来呢，我就从一些成功的例子开始试，一步步调整，像摸着石头过河一样，慢慢向最适合的值靠近。
虽然我现在还是不能拍着胸脯说我找到的就是最好的参数组合，但比起最开始已经好得多了。
毕赤酵母转化方法
毕赤酵母转化方法
毕赤酵母是一种微生物，也称为红曲霉，常用于酿造传统的中国米酒和黄酒，具有丰富的酶活性和营养价值。
主要包括培养、提取、纯化、保存等多个步骤。
首先是培养毕赤酵母。
毕赤酵母可在红曲粉、糖、脂肪等培养基上培养。
通常可以将毕赤酵母接种在含有适量营养成分的培养基上，设定适当的培养条件，如温度、pH值、
通气量等，培养一定时间后，毕赤酵母就会扩增繁殖。
提取毕赤酵母的方法有多种，一般是通过离心、过滤、溶剂提取等手段，从培养基中提取出毕赤酵母。
然后可以通过纯化的方法将提取的毕赤酵母进一步纯化，去除杂质，得到较为纯净的毕赤酵母。
为了保存毕赤酵母，可以通过冻干法、冻存法、罐装法等方式进行。
其中，冻干法是将提取的毕赤酵母在低温下冻干，去除水分后进行密封保存；冻存法是将毕赤酵母培养液直接以冷冻的方式保存；罐装法则是将毕赤酵母罐装封存，加入防腐保鲜剂，延长保存期限。
除了以上提到的基本方法外，还可以采用分子生物学技术、生物工程技术等现代方法对毕赤酵母进行改良和优化，提高其发酵性能和产酶能力。
如通过基因工程技术改良毕赤酵母菌株，使其更适合特定的酿造需求，提高其发酵产酶的效率和产量。
总的来说，毕赤酵母转化方法是一个综合的过程，需要在培养、提取、纯化、保存等环节中进行科学的操作和控制，以确保毕赤酵母的质量和产出效果。
随着科技的不断发展和进步，毕赤酵母的转化方法也将不断完善和提升，为酒类行业的发展做出更大的贡献。
毕氏酵母(Pichia_pastoris)感受态细胞制备及转化 (1)
毕氏酵母（Pichia pastoris）感受态细胞制备及转化1、毕氏酵母氯化锂转化法（1）试剂1M LiCl（用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌；必要时用消毒去离子水稀释）50% PEG3350（Sigma P3640 用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌，用较紧的盖子的瓶子分装）2mg/ml salmon sperm DNA / TE（10mM Tris-Cl, pH8.0, 1.0mM EDTA）-20℃保存注：醋酸锂对毕氏酵母无效，仅氯化锂有效；PEG3350可屏蔽高浓度LiCl的毒害作用；（2）感受态毕氏酵母的制备接种Pachia pastoris到50ml YPD培养基中，30℃摇菌过夜（约24～28h）培养到OD 值为0.8～1.0（约108 Cells/ml）；收获细胞，用25ml无菌水洗涤一次，室温下1500g离心10min；重悬细胞于1ml 100mM LiCl溶液中，将悬液转入1.5ml离心管；离心机最大速度离心15秒沉淀菌体，重悬菌体于400ul 100mM LiCl溶液中；按50ul/管分装，立即进行转化；注：不要将感受态酵母菌冰浴；（3）毕氏酵母的转化煮沸1ml鲑鱼精DNA 5min，迅速冰浴以制备单链担体DNA；将感受态酵母菌离心，以Tips去除残余的LiCl溶液；对于每一个转化，按以下顺序加入：50% PEG3350 240ul1M LiCl 36ul2mg/ml 单链Salmon sperm DNA 25ul5～10ug/50ul H2O 质粒DNA 50ul剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体完全分布均匀（约1min）；30℃水浴孵育30min；42℃水浴热休克20～25min;6000～8000rpm离心收集酵母菌体；重悬酵母于1ml YPD培养基，30℃摇床孵育；1～4h后，取25～100ul菌液铺选择性培养基平板，于30℃培养2～3天鉴定；2、毕氏酵母PEG1000转化法（1）试剂缓冲液A：1.0M Sorbitol，10mM Bicine，pH8.35（sigma）,3%（v/v）ethylene glycol 缓冲液B：40%（w/v）PEG1000（sigma），0.2M Bicine，pH8.35缓冲液C：0.15M NaCl，10mM Bicine，pH8.35未污染的新鲜、试剂级DMSO，-70℃保存注：缓冲液A、B、C均用滤膜过滤，-20℃保存;将DNA直接加在冻结的酵母细胞上是本实验的关键之处（即使在冰上解冻的待转化细胞，其摄取外源DNA的能力也在解冻过程中迅速下降；如进行多样品的转化，建议按6样品/组进行）;（2）待转化毕氏酵母的制备接种环接种Pachia pastoris于YPD平板，30℃培养2d;挑取单克隆酵母菌株于10mlYPD培养基中，30℃振荡培养过夜；取步骤2中小量菌液接种到100mlYPD培养基中振荡培养，待其OD值从0.1升到0.5～0.8；室温下3000g离心收集酵母菌体，50ml缓冲液A洗涤一次；重悬菌体于4ml缓冲液A中，按0.2ml/管分装于1.5ml的离心管中，每管加入11ulDMSO，混合后迅速于液氮中冷冻，-70℃保存（3）毕氏酵母的转化将约50ug线性化质粒DNA溶于20ul TE或水中，直接加于冻结的酵母细胞中；加入担体DNA（40ug变性超声线性化鲑鱼精DNA）以获得最大转化率；37℃水浴孵育5min，中间混合样品1～2次；取出离心管，加入1.5ml缓冲液B，彻底混匀；30℃水浴孵育1h；室温下2000g离心10min，去除上清液，菌体沉淀重悬于1.5ml缓冲液C中；离心样品，去除上清液，轻微操作将样品重悬于0.2ml缓冲液C中；将所有转化液铺于选择性平板，于30℃孵育3～4天后，鉴定；3、毕氏酵母电转化法（1）E.coli TOP10F’感受态细胞的制备取10ul TOP10F’菌液，接种于200ml LB液体培养基中活化培养，37℃，200 rpm，16～18小时。
酵母电转化——精选推荐
酵母电转化(2006)1)将划线培养的毕赤醉母GS115单菌落接种于3mLYPD培养基中，280度,250r/min 摇荡培养24-48h,2)取培养物100uL转接种于20mLYPD培养基中，28℃摇荡过夜，OD600=1. 3-1. 5，4'C 1500r/min离心5min收获细胞3)细胞依次用100mL, 50mL冰预冷水和20mL冰预冷的1moI/L山梨醇洗涤，4度,1500g离心5min,最后用0. 8mL冰预冷的lmol/L山梨醇悬浮菌体，置冰浴。
4)取Sa 1 I线性化的重组载体l0ul (l0ug)与80gL毕赤酵母感受态细胞混匀，然后转移到冰预冷的0.2 cm的电转移杯中，冰上放置5mino(2)将电转移杯放在电穿孔仪上用脉冲电流电击一次，电击条件:电压1500V电容25uF，电阻200，时间5ms,温度O 'c(3)电击结束，立即加入1mL冰预冷的lmol/L山梨醉，混匀，取250uL转化物涂营养缺陷型MD培养基平皿，置28'C恒温培养2-4d，能在MD培养基上生长的菌落为His，转化子。
另一种方法:①从毕赤氏酵母GS115平板上挑取一单菌落，接种于10 mL YPD培养基中，30℃，250 r/ min,振荡培养过夜;②从上述过夜培养液中吸取1 ML，接种于200 mL YPD培养基中，30℃，250 r/min, 振荡培养至OD600为1.1-1.5;③500Xg离心培养液，沉淀细胞，用去离子水和1 m的山梨糖醇各洗两次;④加入1 ML预冷的1M的山梨糖醇重悬细胞，此即为感受态细胞;⑤把感受态细胞分装，每管100 uL，-70℃保存，备用.①将冻存于一70℃的GS115感受态细胞取出，冰浴融解;②分别将四种各10 uL线性化重组表达载体加入100 uL GS115感受态细胞中，用Tip头轻轻混匀;③将混匀的感受态细胞和重组表达载体混合物加入2 mm的电击杯底部，轻轻振荡，使混合物完全沉落于电击杯底部，冰浴5m in;④将JY2000-1B基因导入仪的电压调到1500 V，电阻调到200 ，电容调到25 uF, 电击10m s;⑤将1 mL 1 M冰浴的山梨糖醇加入电击杯，混匀，各吸出200 pL，分别涂于4个YP D+Zeocin平板上;⑥将平板置于30℃培养箱，培养2d至长出菌落。
毕赤酵母转化相关整理
1.电转化相关事项①在电转完毕涂MD平板时，我是不加抗生素的，因为MD平板本身就有组氨酸营养缺陷的筛选标记，据说再加抗生素很容易压力过大，不长菌。
20度培养48-55h后，酵母长出来，挑单菌落，到YPD液体培养基（刚筛选时我一般只加0.5mg/ml的G418），菌长好后，提基因组，验证插入基因和拷贝数，拷贝数这时也可以通过添加不同浓度G418的平板来验证。
如果基因插入没问题，再培养诱导，测活。
②YPD可以直接灭菌，刚开始我葡萄糖单灭，后来发现酵母粉蛋白胨葡萄糖一起加也没问题。
③.温度方面，毕赤酵母最常用的是30度，只要不长时间超过32度就没有问题，诱导温度与表达的蛋白是否被降解有关，但通常30度。
④.生物素方面，只要用到酵母粉的培养基都可以不用。
⑤. MD是的氮源是无机氮，没有组氨酸，空的毕赤酵母不在它上面不会长，长的有99％都是重组菌⑥可以用G418 YPD平板筛选高考贝菌，一般情况下拷贝数高的表达量就高（但有些蛋白酶不一定表达量高就好），一般情况下MD平板上长出的菌可以直接用牙签挑到1.5mg/ml或2mg/ml G418的平板上，这个时候一般培养三天时间，长的大的菌落可能就没有几个了，这几个大的获得高表达的可能性是最大的。
⑦灭菌温度方面，只要有葡萄糖的都115度20分钟，没有的都可以121度20分钟。
⑧甲醇诱导方面，一天加一次终浓度1％的甲醇即可，前提条件是第一次一定要换掉培养基。
⑨蛋白降解方面，在发酵上一般通过调整pH,收获时间来解决，通过诱导温度是不理想的；从宿主上可以选用SMD1168，SMD1165,SMD1163,SMD1168用的最多，从分子上，可以突变掉目标蛋白的酶切位点。
可以通过不同的载体不同的线性化位点对已有的高表达酵母进行再转化，以获得更高表达的菌株；些方法也可以进行两种不同蛋白的共表达。
⑩电击之后，加入1ml的山梨醇，吸入1.5ml的ep管中，置于30度摇床低速培养1h，再涂板。
毕赤酵母电击转化注意事项
毕赤酵母电击转化注意事项一、制备感受态的菌液收集时间：1、准确测定OD值：OD在1.2～1.5之间。
1）为了准确测定OD值，建议将菌液稀释不同浓度测定（1、2、4、8、16倍稀释，看其OD值是否呈线性关系）。
每个倍数做3－5个重复，应该可以大致推断OD值是否准确！菌液看上去浑浊，但OD值不高，很可能OD稀释倍数不够！2）OD值是否测准也可以这样估算：OD600为40左右时，菌体湿重（6000rpm离心5min）约0.95g/10ml。
高密度发酵时菌体湿重将相应下降。
2、75ml的菌，经18h左右的培养，最后sorbital洗涤完毕后，50ml离心管里所剩菌体特别浓，需要1ml sorbitol才可溶解为糊状。
正常培养的OD在1.2～1.5之间的500ml菌液，收集的感受态也用1ml稀释的，没那么粘稠。
可以看看降低培养温度（27摄氏度）或缩短培养时间（12h）。
3、甚至不用转接,直接挑单克隆在50－100mlYPD中摇过夜，效果也很好二、制备感受态的菌液量如果只转一个样品，50ml就够了，一般50ml的培养液如果OD值正常的话够做10管感受态的，其他的按比例缩小。
用大试管摇5ml菌液，然后取1ml毫升在1.5mlEP管中制感受态，每一步的离心时间30秒就行。
整个流程时间短，制备好的感受态用来做转化的效率很高。
山梨醇离心，洗涤的过程之后的重悬的时候注意浓度，不要过于粘稠和稀释。
三、感受态的保存感受态细胞做好后由于电转化杯还没有处理好等原因，在冰上放几个小时再做可能有一定的影响，尽量马上制备马上转化。
如果感受态细胞要保存，不需要加甘油，一般80ul EP管分装，-70 或-80 摄氏度保存。
另附：酵母GS115点种分离纯化接种GS115于5ml YPD液体培养基，30℃，200rpm振荡过夜，涂布YPD平板，30℃培养48 小时，用YNB基本培养基和含His的补充培养基作点种分离纯化，挑选在补充培养基生上生长而在基本培养基上不生长的单菌落划YPD平板，4℃保存。
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实验概要
本文介绍了毕赤酵母LiCl 转化方法。
该程序是电转化的替代方法。
转化效率为102-103cfu/ug线性化DNA。
实验原理
主要试剂
溶液准备：不能用醋酸锂，一定要用氯化锂
1. 用无菌去离子蒸馏水配制1M LiCl，过滤除菌，用无菌水稀释
2. 用无菌去离子蒸馏水配制50%PEG(3350)，过滤除菌，存于盖紧的瓶中
3. 用TE(10mM Tris-HCl pH8.0，1.0mM EDTA)溶解2mg/ml 变性断裂鲑鱼精DNA，存于-20度
主要设备
实验材料
实验步骤
1. 细胞准备：
1) 在50mlYPD 中培养毕赤酵母至OD600＝0.8-1.0(约108个/ml)。
2) 收集细胞，用25ml灭菌水洗涤，室温1500g离心10min。
3) 去除水，用1ml 100mM LiCl 重悬细胞。
4) 将细胞悬液转至1.5ml 离心管中。
5) 最大转速沉淀细胞15s，用吸头吸去LiCl。
6) 在400ul 100mM LiCl中悬浮细胞。
7) 将50ul细胞悬浮液移到1.5ml离心管中，每次用一管，现做现用，不要置于冰上或-20度保存。
2. 转化：
1) 煮沸单链DNA 5min，快速放于冰水中使变冷，后置于冰上。
注意：载体DNA不需要在每次用之前都煮，在-20 度保存等份少量样品，每次解冻一管，用3-4 次后再煮。
2) 取上面第7步中细胞，离心去除LiCl。
3) 每个转化样品，按顺序加入下列试剂，PEG 可保护细胞免受高浓度LiCl的有害作用240ul 50%PEG，36ul 1M LiCl，25ul 2mg/ml 单链DNA，溶解于50ul灭菌水中的质粒DNA(5-10ug)。
4) 剧烈涡旋细胞沉淀至完全混匀(1min)。
5) 在30 度孵育30min(不要摇动)。
6) 在42 度水浴热击20-25min。
7) 6000-8000rpm离心，将转化溶液转移走。
8) 用1ml 灭菌水重悬细胞沉淀。