基因组测序技术PPT课件

加入DNA多聚酶 4种脱氧核苷酸
A 高酶活性 B 无5’→3´外切酶活性 C 无3´→5´外切酶活性
分别加入少量4种双脱氧核苷酸 ↓
将4种反应产物分别在4条泳道电泳 ↓
ddATP/ddCTP/ddGTP/ ddTTP 的3’碳原子连 接的是氢原子,不是羟 基
根据4个碱基在4条泳道的终止位置读出基因序列
将双链DNA样品变为单链 ↓
每个单链的同一方向末端都用放射性同位素 标记,以便显示DNA条带
↓ 分别用不同方法处理,获得只差一个核苷酸的 降解DNA群体
↓ 电泳,读取DNA的核苷酸顺序
Maxam-Gilbert测序法的特异断裂
32P ATCGATCGAT
Specific Reaction to G
2001年 12月，线虫（Caenorhabditis ele gans）基因组测序完成.
一些主要模式生物基因组测序概况
2000年：3月，Celera公司完成果蝇 （Drosophila me lanogaster）基因组 （180 Mb）的全部测序工作，在当时所 有已测序的基因组中是最大的 ，同时这 也证明了“全基因组鸟枪法”的可行性；
从下到上依次读出DNA 片段的核苷酸序列
（二）Maxam-Gilbert的化学降解法
1.基本原理 是用化学试剂处理具有末端放射性
标记的DNA片段，造成碱基的特异性切 割并产生一组具有不同长度的DNA链降 解产物，经凝胶电泳分离和放射自显 影之后，可直接读出待测DNA片段的核 苷酸序列。
2 技术路线
基本原理:
Cambridge的F. Sanger在1977年发明用双脱氧 链终止法测定单链DNA的序列，其基本原理如 下： ①DNA聚合酶能够用单链DNA作为模板，合成 准确的DNA互补链；
②该酶能够用2‘，3’--双脱氧核苷三磷酸作 底物并将其聚合到新生寡核苷酸链的3‘-末端， 从而终止其延伸反应。
基因组测序技术
一些主要模式生物基因组测序概况
1995年 7月，第一个基因组——流感嗜血杆 菌（Haemophilus influenzae）的全序列发 表，大小为1.8 Mb；
1996年 10月，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 的基因组全部测序完成；
1997年 9月，大肠杆菌（Escherichia coli）基 因组全部测 序完成，全长5 Mb；
在DNA测序反应中，加入模板DNA，引物（特 异性引物），DNA聚合酶，dA，dT，dG，dC 和一种ddNTP。常用Klenow大片段，无5'→3' 外切酶活性。
2.技术路线与要求
制备单链模板 ↓
将单链模板与一小段引物退火 ↓
A 克隆于质粒中DNA→用碱或热变性 B M13克隆单链DNA C 噬粒克隆DNA D PCR产生单链DNA
5ˊP 3ˊHO
5ˊP 5ˊP
OH 3ˊ P 5Baidu Nhomakorabea 制备单链DNA
OH 3ˊ
加放射性引物
DNA聚合酶， HO dATP，dTTP， dGTP，dCTP
OH 3ˊ P32 5ˊ
ddGTP
ddATP
ddTTP ddCTP
聚合产物分别在 4个泳道电泳
ddGTP ddATP ddTTP ddCTP
5 ˊ 32P -GTCATGTGCTAG
5 ˊ 32P GTCATGTGCTA 5 ˊ 32P GTCATGTGCT 5 ˊ 32P GTCATGTGC 5 ˊ 32P GTCATGTG 5 ˊ 32P GTCATGT 5 ˊ 32P GTCATG 5 ˊ 32P GTCAT 5 ˊ 32P GTCA 5 ˊ 32P GTC 5 ˊ 32P GT 5 ˊ 32P G
3. 测序：上测序仪测序 。 4. 利用重叠技术，排出DNA大片段的序列。
二、DNA测序的方法
双脱氧链终止法测序 化学降解法测序 自动化测序 非常规DNA测序
（一）Sanger的双脱氧链末端终止法
1.基本原理: 通过合成与单链DNA互补的多核苷
酸链，由于合成的互补链可在不同位置 随机终止反应，产生只差一个核苷酸的 DNA分子，从而来读取待测DNA分子的 顺序。
化學法
断裂处
32P
ATCGATCG
AT
32P
ATCG
ATCGAT
無放射線片段
断裂处
不能顯像
Maxam-Gilbert 法所用的化学技术
碱基 G
A+G
C+T C
特异修饰方法
Ph8.0,用硫酸二甲酯对 N7进行甲基化,使 C8-C9键对碱基裂解有特殊敏感性
pH2.0 哌啶甲酸可使嘌呤环的N原子化,从 而导致脱嘌呤,并因此消弱腺嘌呤和鸟嘌呤 的糖苷键
OH 3ˊ
G 硫酸二甲酯
G+A 甲酸
分别在4个 试管中进行 特异断裂
T+C
C
肼
肼＋NaCl
5 ˊ 32P -GTCATGTGCTAG
5 ˊ 32P GTCATGTGCTA 5 ˊ 32P GTCATGTGCT 5 ˊ 32P GTCATGTGC 5 ˊ 32P GTCATGTG 5 ˊ 32P GTCATGT 5 ˊ 32P GTCATG 5 ˊ 32P GTCAT 5 ˊ 32P GTCA 5 ˊ 32P GTC 5 ˊ 32P GT 5 ˊ 32P G
肼可打开嘧啶环,后者重新环化成五元环后 易除去
1.5mol/L NaCl存在时,可用肼除去胞嘧啶
5ˊP 3ˊHO 5ˊHO 3ˊHO 5ˊ32P 3ˊHO 5ˊ32P
碱性磷酸 单酯酶
多核苷酸 磷酸激酶
除去 5ˊ磷酸基 γ-32P-ATP
OH 3ˊ P 5ˊ
OH 3ˊ OH 5ˊ
OH 3ˊ P32 5ˊ 分离单链DNA
2000年 12 月，第一个植物基因组—— 拟南芥（Arabidopsis thaliana）基因组 被全部测序 ，大小为125 Mb.
一、测序流程
1.构建生物基因组文库或cDNA文库 DNA的提取和制备→酶切制备克隆用DNA片段 →与载体连接→转化受体细胞 →筛选鉴定→扩增培养。
2. 从基因组文库中提取DNA大片段，进行测序： 将DNA用超声波（或限制性内切酶）切成能够测序 的小片断(200-500bp)→小片断和载体结合，植入 细菌中进行扩增（或用PCR扩增） →从细菌中提 取出繁殖好的质粒→ 酶切，制取测序的DNA片段