_饲料中粗蛋白测定注意事项

饲料中粗蛋白测定注意事项

张世娟,徐英江,宫向红,张秀珍,于召强

(山东省海洋水产研究所,山东　烟台　264006)

摘　要:系统研究了饲料中粗蛋白测定中消化温度、消化时间、催化剂用量、蒸馏时间等对粗蛋白测定的影响,并对凯氏定氮法

中的一些注意事项进行了讨论。

关键词:饲料;粗蛋白;测定

N o t e w o r t h y I s s u e s o f C r u d e P r o t e i nA n a l y s i s o f F e e d s t u f f

Z H A N GS h i -j u a n ,X UY i n g -j i a n g ,G O N GX i a n g -h o n g ,Z H A N GX i u -z h e n ,Y UZ h a o -q i a n g

(M a r i n e F i s h e r i e s R e s e a r c h I n s t i t u t e o f S h a n d o n g P r o v i n c e ,S h a n d o n g Y a n t a i 264006,C h i n a )

A b s t r a c t :Al o t o f e x p e r i m e n t a l p a r a m e t e r s s u c h a s d i g e s t i o n t e m p e r a t u r e a n d d i s t i l l a t i o n t i m e t h a t m a y i n f l u e n c e t h e

a c c u r a c y o f c r u d e p r o t e i n a n a l y s i s w e r e s t u d i e d ,a n d s o m e n o t e w o r t h y i s s u e s w e r e a l s o p r o p o s e d f o r K j e l d a h l p r o t e i n a n a l y -s i s m e t h o d .

K e y w o r d s :f e e d s t u f f ;c r u d e p r o t e i n ;a n a l y s i s

作者简介:张世娟(1981-),女,硕士,山东省海洋水产研究实习员,主要从事水产品及饲料质量安全研究。

随着饲料工业的快速发展,饲料产量迅速增长,饲料中蛋白质含量的测定显得日益重要,虽然粗蛋白测定无法鉴别三聚氰胺和尿素等物质,但是在目前条件下,饲料中粗蛋白的测定仍然是评价饲料营养价值的重要指标[1]。

饲料中粗蛋白的测定大致分为两种:凯氏定氮法和自动定氮仪法[2-3]。凯氏定氮法仪器虽然设备简单,试剂消耗少,但人为因素影响比较大;自动定氮仪法虽然自动化程度高,但是该法的测定试剂消耗比较大。本文就凯氏定氮法(蒸馏法)和全自动凯氏定氮法中常见的影响饲料蛋白测定的因素进行了讨论,为饲料中粗蛋白测定人员提供参考。

1　实验材料及仪器

1.1　实验样品

山东升索鱼用饲料。

1.2　仪器

电子天平(精密度为0.0001g )、2300全自动凯氏定氮仪(瑞

典福斯特卡托公司)、凯式蒸馏装置。

1.3　试剂

标准盐酸(0.1036m o l /L 盐酸标准溶液);接收液(10g /L 硼酸溶液)、400g /L 氢氧化钠溶液、1g /L 溴甲酚绿溶液、1g /L 甲基红溶液;浓硫酸;基尔特克催化剂(m K 2S O 4∶m C u S O 4.5H 2O =60:5);硫酸铵(A R ,纯度≥99.5%)。以上试剂均为分析纯度剂,溶液均用不含氨的蒸馏水配制。

2　分析方法及结果

2.1　硼酸吸收液的调节

为了使实际样品和空白样品的酸度一致,消化的时候一般选用无氮蔗糖做空白。空白样品消耗盐酸的量以0.05～0.15m L 为宜,如果空白样品消耗盐酸的量为0或者空白样品的吸收液不变色,则需要调节硼酸吸收液得到正的空白值,空白值可通过调整硼酸的p H 值来进行调节。国标G B /T 6432-94[4]中规定吸收液中加碱可能是为了防止出现空白收液不变色的现象,但是如果空白本身就已经得到非常合适的滴定值,吸收液中加碱反而不利于精密度的提高。本文实验了自动定氮仪法中吸收液酸碱度的影响,1000m L 的硼酸吸收液一份按照国标要求加0.5m L 4%N a O H ,一份不加碱,分别作了空白和回收率实验,结果如表1所示。

表1　吸收液酸碱性实验

硼酸吸收液空白值回收率/%不加碱0.05199.699加碱

0.067

99.532

结果表明,实验中硼酸吸收液中加适量的碱会导致空白值增大,但对结果影响不大,因为吸收液酸碱度对样品和空白的作用是一致的,可以相减扣除。实验中吸收液的酸碱度是否合适,可通过以下方式简单判断:取10m L 硼酸吸收液,加入100m L 蒸馏

水和几滴指示剂,如果指示剂变色说明酸度合适,如果仍为红色,则需要在硼酸吸收液中加入适量的碱。

2.2　消化温度的影响

消化过程采用全自动凯氏定氮仪自备消化装置,样品消化之前用浓硫酸浸泡过夜,升温过程时在200℃保持1小时,并保

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155·2009年37卷第5期广州化工

持经常晃动可消除消化时时泡沫飞溅现象,国标上消化温度为360℃～410℃,实际消化时可根据实际样品采用420℃,但是消化温度不能超过450℃,否则蛋白质会有部分分解。

2.3　消化时间的影响

消化时间对饲料中粗蛋白的测定尤为重要,消化时间太短,饲料中的氮不能充分转化成氨;消化时间过长,会造成氨的损失,实验了消化时间对粗蛋白测定的影响,如表2所示。

表2　消化时间对粗蛋白测定的影响

消化时间(变绿后)/h0.512345S 粗蛋白含量/%42.243545.668645.874745.929546.141346.2052

样品变绿后消化0.5h蛋白含量偏低,随着消化时间的增大,蛋白含量逐渐的增加,从2h开始,蛋白含量增加缓慢,2h的和5h的蛋白含量在允许的1%误差范围之内,可见样品消化时间最好控制在样品变绿后2h以上,对一般样品,3～4h的消化时间已经足够,过长的消化时间对蛋白含量的提高没有显著的影响,反而会造成时间和资源的浪费。

2.4　催化剂用量的影响

催化剂的作用是提高硫酸沸点,加快有机物分解,但是催化剂的用量也有严格限制,含量太低,消化温度偏低,有机物分解速度缓慢,含量太大消化温度过高容易造成氮的损失。实验中发现催化剂含量为6.4g时,样品从420℃开始至变绿时间在20分钟左右,而催化剂含量为3.2g的相同质量的样品从420℃消化至变绿需要大约50分钟,而不含催化剂的样品从420℃开始消化4h样品仍未变绿。由此可见催化剂含量对消化速度的影响非常显著。福斯公司推荐硫酸和催化剂用量之比为1.4～2,对高消耗酸的样品,如高脂肪含量的样品。酸、盐的比例可以达到2.5～2.8和之间。国标规定6.4g催化剂对12m L硫酸可满足大部分样品的需求,如果要增加酸碱的量,可适当对催化剂进行相应调整,同时蒸馏时碱的用量也要进行相应得调整。

2.5　粗蛋白测定中的自我校正

样品测定之前需用纯度>99.5%的硫酸铵(含氮量

21.09%)做回收率进行校正:称取0.15～0.2g(精确到小数点后第四位)硫酸铵,代替样品按同样的分析步骤操作,回收率必须在99.5%～100.5%之间。如果回收率偏大或者偏小则要检查各个步骤有没有错误,回收率满意后再做实际样品可避免时间和资源的浪费。

2.6　凯氏定氮法注意事项

2.6.1　蒸馏时间对测量结果的影响

凯氏定氮法测量蛋白含量时蒸馏时间的控制对实验结果的好坏至关重要。实验了蒸馏时间对蛋白测定含量的影响,蒸馏时间以反应室液体沸腾时计时,如表3所示。

表3　蒸馏时间对测量结果的影响

蒸馏时间/m i n345610

粗蛋白含量/%44.6045.3145.8445.4945.67

蒸馏3m i n和4m i n时蛋白含量偏低,蒸馏时间大于5m i n,蛋白含量相对稳定,其后随着蒸馏时间的增大,蛋白含量无明显增加

,可见适宜的蒸馏时间为5～6m i n,过长的蒸馏时间对结果无显著改善还会造成时间和资源的浪费。

2.6.2　凯氏定氮法注意事项

(1)冷凝水的开启,冷凝水要在蒸馏开始时开启,如果蒸馏一段时间发现未开启蒸馏水,要先停止加热,待冷凝装置冷却后再开通冷凝水,以防爆炸。

(2)系统密闭性检查,整个蒸馏装置所有接口应该密封完全,不能漏气,蒸馏实际样品前先做回收率,以确定系统密闭性,蒸馏步骤以及试剂是否有误。

(3)加样液之前要把蒸馏管浸入吸收液,氢氧化钠要加入密封小玻杯上,然后再缓缓提起小玻杯使氢氧化钠流下,碱液尚未流完时,加3～5m L水,一半流入反应室,一半作为水封,要注意在加碱液的时候,整个反应室除了冷凝管路浸在吸收液里,其余管路都应该保持密封,防止生成的氨气挥发。

(4)水蒸气发生室要保持管路畅通,否则会由于压力大而发生爆炸。

2.7　自动定氮仪法

2.7.1　全自动凯氏定氮仪滴定器中气泡的消除

全自动凯氏定氮仪滴定器里经常有气泡,气泡的消除对滴定准确性影响很大。一般来说如果没有特别多的气泡,用手动功能反复的将滴定器充液排空几次就可以把气泡赶走,但是实际操作中经常会遇到气泡比较多或者不易排走的情况,笔者经过长期实验发现先将输送盐酸的管路拿出盐酸溶液,然后在手动模式下将滴定器充液可彻底解决气泡问题。由于管路不放置在盐酸溶液中,滴定器充液时只能吸入空气,这时滴定器中的气泡也会随之消失到空气中,再将管路放回盐酸溶液重新将滴定器排空充液,可完全解决气泡问题。

2.7.2　全自动凯氏定氮仪的不足

全自动凯氏定氮仪具有快速、准确、灵活和减小人为误差等优点,但是也有不足之处。凯氏定氮法测量粗蛋白的盐酸浓度通常为0.1～0.2m o l/L,因此盐酸溶液不能长期保存,常常需要重新配制,这样就需要把原先管路中的盐酸完全排掉换成新的盐酸溶液。以F O S S2300为例,全自动凯氏定氮仪的滴定器结构如图1所示,

当按e m p t y排空滴定器中原先盐酸溶液的时候,由于滴定器最上方是圆锥形结构,滴定器里面的柱塞只能上升到如图2所示的位置,柱塞上方仍有一部分盐酸不能完全排出,虽然经过多

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