薄层层析操作要点

薄层层析操作要点

铺板

铺板用的匀浆不宜过稠或过稀：过稠，板容易出现拖动或停顿造成的层纹；过稀，水蒸发后，板表面较粗糙。匀浆配比一般是硅胶G:水=1：2～3，硅胶G:羧甲基纤维素钠水溶液=1:2。研磨匀浆的时间，根据经验来定，与空气湿度有关，一般通过拿起研棒时匀浆下滴的情况来判断，越稠越难下滴。匀浆的稀稠除影响板的平滑外，也影响板涂层的厚度，进一步影响上样量。涂层薄，点样易过载；涂层厚，显色不那么明显。通常，板的质量对薄层鉴别的影响不是很大，影响最大的是展开剂的配制和展开系统的饱和。

铺层时防止起泡,可加几滴乙醇.

尝试刮边

点样

尽量用小的点样管。如果有足够的耐性，最好只用1微升的点样管。这样，点的斑点较小，展开的色谱图分离度好，颜色分明。样品溶液的含水量越小越好，样品溶液含水量大，点样斑点扩散大。样品溶液的溶剂一般是无水乙醇、甲醇、氯仿、乙酸乙酯。点好样的薄层板用电吹风的热风吹干或放入干燥器里晾干。

点样是造成TLC定量误差的主要来源。实验证明：定量毛细管更适合较小体积的点样；微量注射器更适合较大体积的点样。这主要是因为微量注射器受小气泡、溶液回爬现象的影响较大。为避免不同定量毛细管间的点样误差、建议一块薄层板上最好用同一只定量毛细管。但应注意更换样品时，应将毛细管用超声波或不同极性溶剂清洗干净。在制备样品时，溶样溶剂黏度不能过高，以便于点样；溶剂沸点过低则进样体积易变，过高则会改变展开剂组成；对样品溶解度过高会使样点发生空心现象；常用的溶剂为甲醇、乙醇、丙酮。经典TLC样点原点一般为直径3mm点间距1-2cm 底边距1.5cm；HPLC样点原点一般为直径1mm点间距5mm 底边距1cm。

展开剂配制

选择合适的量器把各组成溶剂移入分液漏斗，强烈振摇使混合液充分混匀，放置，如果分层，取用体积大的一层作为展开剂。绝对不应该把各组成溶液倒入展开缸，振摇展开缸来配制展开剂。混合不均匀和没有分液的展开剂，会造成层析的完全失败。各组成溶剂的比例准确度对不同的分析任务有不同的要求，尽量达到实验室仪器的最高精确度，比如：取1ml的溶剂，应使用1ml的单标移液管，移液管应符合计量认证要求，尽管多数时候这不是必须的。

展开系统的饱和

一般使用的是双槽的展开缸，一槽用来放展开剂，另一槽可加入氨水或硫酸。把待展开的板放入两槽间的平台，斜架着，盖上展开缸的盖子。让展开剂的蒸气充满展开缸，并使薄层板吸附蒸气达到饱和，防止边沿效应，饱和时间在半个小时左右。展开时难免要打开盖子把薄层板放入展开剂中，不过对薄层板与蒸气的吸附平衡影响不大，当然动作应该尽量轻、快。

温湿度的控制

温湿度对薄层影响都很大。不冻结的前提下，通常温度越低分离越好，较难的分离需在低温下分离，例如人参皂苷。湿度的影响，估计主要是影响薄层板的吸附能力，导致选择性（容量因子）的变化，湿度应根据实际情况确定。温度控制使用空调器或冰柜，湿度控制是通过在另一展开槽放置相应浓度的硫酸。

展开剂的选择

TLC与HPLC相比，一个突出的优点就是流动相的选择具有更大的灵活性。流动相的选择的目的是使绝大部分样品的RF值位于0.1--0.7之间并达到较好的分离，与此对应的是流动相要有适当的强度和组成。流动相强度越大，溶质RF值越大，但很可能降低分离能力；另外单一溶剂很难分离较复杂的混合物，根据相似相溶原理，要使用多元溶剂体

系。一般展开剂体系选择如下：根据分离样品性质、薄层色谱板性质选择一个二元溶剂体系，通过调节溶剂比例以寻求适合RF值，适合的RF值找到后，再寻求极性参数相同的二元溶剂体系两个，以这三个组成为三点组成一个三角形，则可看到：三角形顶点是二元体系，边是三元体系，三角形内是四元体系，并且极性一致，可根据几何原理得出任一点组成。这种方法较为直观，也较简单。

显色

喷显色剂显色最重要是有好的雾化器。

TLC的通用显色方法

理想的显色希望灵敏度高、斑点颜色稳定、斑点与背景间的对比度好、斑点的大小及颜色的深度与物质的量成正比。在样品组成并不完全已知的情况下，通用显色方法显得成尤为重要。通用显色法主要有：

（1）紫外照射法：方便，不破坏样品；

（2）碘蒸气法：通用性强，与紫外法结合灵敏度高于该两法单独使用；

（3）荧光试剂：制造荧光背景，使原来紫外下无荧光物质被鉴别，有荧光物质更明显；

（4）硫酸溶液：对绝大多数有机物有效，但有破坏性。

薄层层析(thin layer chromatography)，也叫薄层色谱、薄板色谱或薄板层析，属层析技术中的一类，常用TLC 代表。如同柱层析一样，按其作用机理可分为吸附薄层层析，分配薄层层析等。其中应用最广泛的是吸附薄层层析。其原理见第97～100页和第102～104页。薄层层析具有微量、快速、操作简便等优点，但不适合于较大量的样品的分离，通常可分离的量在0.5g以下，最低可达10－９ g。以下介绍吸附薄层层析的相关问题，其他类型薄层层析可参照处理。

1.薄层层析的用途

在实验室中，薄层层析主要用于以下几种目的。

(1)作为柱层析的先导。一般说来，使用某种固定相和流动相可以在柱中分离开的混合物，使用同种固定相和流动相也可以在薄层板上分离开。所以常利用薄层层析为柱层析选择吸附剂和淋洗剂。

(2)监控反应进程。在反应过程中定时取样，将原料和反应混合物分别点在同一块薄层板上，展开后观察样点的相对浓度变化。若只有原料点，则说明反应没有进行；若原料点很快变淡，产物点很快变浓，则说明反应在迅速进行；若原料点基本消失，产物点变得很浓，则说明反应基本完成。

(3)检测其他分离纯化过程。在柱层析、结晶、萃取等分离纯化过程中，将分离出来的组分或纯化所得的产物溶样点板，展开后如果只有一个点，则说明已经完全分离开了或已经纯化好了；若展开后仍有两个或多个斑点，则说明分离纯化尚未达到预期的效果。

(4)确定混合物中的组分数目。一般说来，混合物溶液点样展开后出现几个斑点，就说明混合物中有几个组分。

(5)确定两个或多个样品是否为同一物质。将各样品点在同一块薄层板上，展开后若各样点爬升的高度相同，则大体上可以认定为同一物质，若上升高度不同，则肯定不是同一物质。

(6)根据薄层板上各组分斑点的相对浓度可粗略地判断各组分的相对含量。

(7)迅速分离出少量纯净样品。为了尽快从反应混合物中分离出少量纯净样品作分析测试，可扩大薄层板的面积，加大薄层的厚度，并将混合物样液点成一条线，一次可分离出数十毫克到五百毫克的样品。

2.薄层层析的仪器和药品

(1)薄板薄层层析所用的基板通常为玻璃板，也有用塑料板的，根据用途的不同而有不同的规格。作分析鉴定用的多为7.5cm×2.5cm的载玻片。若为分离少量纯样品，可将普通玻璃板裁成20cm×15cm的大小，将棱角用砂纸稍加打磨，以免割破手指，然后洗净干燥即可使用。近年来，有些厂商将吸附剂涂在大张金属箔片上出售。购回后只需用剪刀剪成合适大小即可点样展开。用完后可以适当溶剂将箔片上样点浸萃掉，经干燥后即可重复使用，但吸附剂涂层很薄，一般只可作分析鉴定用。

(2)展开槽展开槽也叫层析缸，规格形式不一。图3-39绘出了其中的几种，图中的a为立式，b为卧式，c和d为斜靠式，e为下行式，f为制备纯样品所用的大型展开槽，亦为斜靠式。a,b,c,d,f统称上行式。

图3-39 薄层板在不同的层析缸中展开

(3)吸附剂薄层层析中所用吸附剂最常见的有硅胶和氧化铝两类。其中不加任何添加剂的以H表示，如硅胶H，氧化铝H；加有煅石膏(CaSO４·1/2 H２O)为粘合剂的用G表示(gypsum )，如硅胶G，氧化铝G；加有荧光素的用F表示(fluorescein)，如硅胶HF２５４，意思是其中所加荧光素可在波长254 nm的紫外光下激发荧光；同时加有煅石膏和荧光素的用GF表示，如硅胶GF２５４，氧化铝GF２５４。如在制板时以羧甲基纤维素钠的溶液调和，则用CMC表示(carboxymethyl cellulose)，如硅胶CMC。添加粘合剂是为了加强薄层板的机械强度，其中以添加CMC者机械强度最高；添加荧光素是为了显色的方便。习惯上把加有粘合剂的薄层板称为硬板，不加粘合剂的薄层板称为软板。

供薄层层析用的吸附剂粒度较小，通常为200目，标签上有专门说明，如Silica gel H for thin layer chromatography,使用时应予注意，不可用柱层析吸附剂代替，也不可混用。

薄层层析用的氧化铝也有酸性、中性、碱性之分，也分五个活性等级。选择原则与柱层析类同。

(4)展开剂在薄层层析中用作流动相的溶剂称为展开剂，它相当于柱层析中的淋洗剂，其选择原则也与淋洗剂类同，也是由被分离物质的极性决定的，被分离物极性小，选用极性较小的展开剂；被分离物极性大，选用极性较大的展开剂。环己烷和石油醚是最常使用的非极性展开剂，适合于非极性或弱极性试样；乙酸乙酯、丙酮或甲醇适合于分离极性较强的试样，氯仿和苯是中等极性的展开剂，可用作多官能团化合物的分离和鉴定。若单一展开剂不能很好分离，也可采用不同比例的混合溶剂展开。

选择展开剂的一条快捷的途径是在同一块薄层板上点上被分离样品的几个样点，各样点间至少相距1cm，再用滴管分别汲取不同的溶剂，各自点在一个样点上，溶剂将从样点向外扩展，形成一些同心的圆环。若样点基本上不随溶剂移动(见图3-40a)，或一直随溶剂移动到前沿(见图3-40d)，则这样的溶剂不适用。若样点随溶剂移动适当距离，形成较宽的环带(见图3-40b)，或形成几个不同的环带(见图3-40c)，则该溶剂一般可作为展开剂使用。

图3-40 选择展开剂图3-41 载玻片浸渍涂层

3.薄层层析的操作

(1)制板制板也称铺板或铺层，有“干法”和“湿法”两种，由于干燥的吸附剂在玻璃板上附着力差，容易脱落，不便操作，所以很少采用，此处只介绍湿法铺板。

a.供分析、鉴定、监控用的载玻片的铺制。首先将吸附剂用溶剂调成糊状，所用溶剂可以是低沸点有机溶剂，也可以是蒸馏水。有机溶剂中应用较广的是氯仿，一般按照每克硅胶3mL氯仿的比例在广口瓶中调成糊状，立即以带螺旋的盖子盖紧备用。在铺板时用力摇匀，旋开盖子，将两块载玻片叠在一起，以食指和拇指捏住它们的侧面靠近一端处，缓慢平稳地浸入瓶中的糊状吸附剂里，使糊状物浸没至离载玻片顶端约1cm处，然后缓缓提起(见图3-41)，在空气中握持片刻，使氯仿大部分挥发掉。将两块载玻片拆开，浸涂面向上，平放在桌上，干燥后即可使用。每次浸涂后应立即将广口瓶盖紧密封，以免溶剂挥发。这样制得的薄层板机械性能稍差。为了提高薄层强度，可用甲醇代替氯仿，或将甲醇与氯仿按不同的比例混合使用。

以蒸馏水作溶剂时，首先将待铺的载玻片平放在水平台面上，将吸附剂置于干净研钵内，按照每克硅胶G2～3mL 蒸馏水(或3～4mL羧甲基纤维素钠溶液)，或每克氧化铝1～2mL蒸馏水的比例加入溶剂，立即研磨成糊状。用牛角匙舀取糊状物倒在载玻片上迅速摊布均匀，也可轻敲载玻片边缘，或将载玻片托在手中前后左右稍稍倾斜，靠糊状物的流动性使之分布均匀。然后再平放在台面上，使其固化定型并晾干。固化的过程是吸附剂内的煅石膏吸收水形成新固体的过程，反应式为：

CaSO4·1/2H2O + 3/2H2O ＝CaSO4·2H2O

所以研磨糊状物和涂铺薄层板都需尽可能的迅速。若动作稍慢，糊状物即会结成团块状无法涂铺或不能涂铺均匀，即使再加水也不能再调成均匀的糊状。通常研磨糊状物需在1min左右完成，铺完全部载玻片也只需数分钟，最多在十数分钟内完成。每次铺板都需临时研磨糊状物。以蒸馏水作溶剂制得的薄层板具有较好的机械性能，如欲获得机械性能更好的薄层板，可用1%的羧甲基纤维素钠水溶液来调制糊状物。将1g羧甲基纤维素钠加在100mL蒸馏水中，煮沸使充分溶解，然后用砂芯漏斗过滤。用所得滤液如前述方法调糊铺板，这样的薄层板具有足够的机械性能，可以用铅笔在上面写字或作其他记号，但需注意在活化时严格控制烘焙温度，以免温度过高引起纤维素碳化而使薄层变黑。

图3-42 薄层涂布器

1—铺好的薄层板；2—涂布器；3，5—厚玻板；4—玻璃板

b.涂布器制板法。图3-42为薄层涂布器。将几块玻璃板放在涂布器中间摆好，两边是两块比前者约厚0.5mm的玻璃板，向涂布器槽中倒入预先调好的糊状吸附剂，将涂布器自左向右推去即能将糊状物均匀地涂在玻璃板上。待晾干定型之后，将几块玻璃板分开，刮去边上多余的吸附剂即得到一定厚度的薄层层析板。

c.较大薄层板的铺制。供分离纯化用的薄层板具有较大的尺寸，通常都是用蒸馏水来调制糊状物的，方法同前。铺板的方法如下：

倾注法将玻璃板平放在台面上，把研好的糊状物迅速倾倒在玻璃板上，用干净玻璃棒摊平，或手托玻璃板微微倾斜，并轻轻敲击玻璃板背面，使之流动，即可获得平整均匀的薄层。

刮平法将待铺玻璃板平放台面上，在其长条方向的两边各放一条比玻璃板厚1mm的玻璃板条。将调好的糊状物倒在中间的玻板上，用一根有机玻璃尺将糊状物沿一个方向刮平，即形成厚1mm的均匀薄层。待固化定型后抽去两边的玻璃板条即可。

大薄层板的活化及存放方法与载玻片相同。

不管以何种方法铺板，都要求铺得的薄层厚薄均一，没有纹路，没有团块凸起。纹路或团块的产生原因是糊状物调得不均匀，或铺制太慢，或在局部固化的板子上又加入新的糊状物，所以为获得均匀的薄层，应动作迅速，一次研匀，一次倾倒，一次铺成。

(2)活化

将晾干后的薄板移入烘箱内“活化”。活化的温度因吸附剂不同而不同。硅胶薄板在105～110℃烘焙0.5～1h即可；氧化铝薄板在200～220℃烘焙4h，其活性约为Ⅱ级，若在150～160℃烘焙4h，活性相当于Ⅲ～Ⅳ级。活化后的薄层板就在烘箱内自然冷却至接近室温，取出后立即放入干燥器内备用。(3)点样固体样品通常溶解在合适的溶剂中配成1%～5%的溶液，用内径小于1mm的平口毛细管吸取样品溶液点样。点样前可用铅笔在距薄层板一端约1cm处轻轻地画一条水平横线作为“起始线”。然后将样品溶液小心地点在“起始线”上。样品斑点的直径一般不应超过2mm。如果样品溶液太稀需要重复点样时，须待前一次点样的溶剂挥发之后再点样。点样时毛细管的下端应轻轻接触吸附剂层。如果用力过猛，会将吸附剂层戳成一个孔，影响吸附剂层的毛细作用，从而影响样品的Ｒｆ值。若在同一块板上点两个以上样点时，样点之间的距离不应小于1cm。点样后待样点上溶剂挥发干净才能放入展开槽中展开。

(4)展开

展开剂带动样点在薄层板上移动的过程叫展开。展开过程是在充满展开剂蒸气的密闭的展开槽中进行的。展开的方式有直立式、卧式、斜靠式、下行式、双向式等。

直立式展开是在立式展开槽中进行的，如图3-39a。先在展开槽中装入深约0.5cm的展开剂，盖上盖子放置片刻，使蒸气充满展开槽，然后将点好样的薄层板小心地放入其中，使点样端向下(注意展开剂不可浸及样点)，盖好盖子。由于吸附剂的毛细作用，展开剂缓缓向上爬升。如果展开剂选得合适，样点也随之展开。当展开剂前沿升至距薄层板上端约1cm处时取出薄层板并立即标记出前沿位置。分别测量各样点中心及前沿到起始线的距离，计算各组分的比移值。如果样品中各组分的比移值都较小，则应该换用极性大一些的展开剂；反之，如果各组分的比移值都较大，则应换用极性小一些的展开剂。每次更换溶剂，必须等展开槽中前一次的溶剂挥发干净后，再加入新的溶剂。更换溶剂后，必须更换薄层板并重新点样、展开，重复整个操作过程。直立式展开只适合于硬板。

卧式展开如图3-39b所示，薄层板倾斜15°放置，点样端向下，涂层向上，操作方法同直立式，只是展开槽中所放的展开剂应更浅一些。卧式展开既适用于硬板，也适用于软板。

斜靠式展开如图3-39c，d，f所示，薄层板的倾斜角度在30°～90 °之间，一般也只适合于硬板。

下行式展开如图3-39e所示。薄层板竖直悬挂在展开槽中，一根滤纸条或纱布条搭在展开剂和层析板上沿，靠毛细作用引导展开剂自板的上端向下展开。此法适合于比移值较小的化合物。

双向式展开是采用方形玻璃板铺制薄层，样品点在角上，先向一个方向展开，然后转动90°再换一种展开剂向另一方向展开。此法适合于成分复杂或较难分离的混合物样品。

用于分离的大块薄层板，是在起点线上将样液点成一条线，使用足够大的展开槽展开，如图3-39f所示，展开后成为带状，用不锈钢铲将各色带刮下分别萃取，各自蒸去溶剂，即可得到各组分的纯品。

若无展开槽，可用带有螺旋盖的广口瓶代替，如图3-39c所示。若展开槽较大，则应预先在其中放入滤纸衬里，如图3-39 c,d,f所示。衬里的作用是使展开剂沿衬里上升并挥发，使展开剂蒸气迅速充满展开槽。

(5)显色

分离和鉴定无色物质，必须先经过显色，才能观察到斑点的位置，判断分离情况。常用的显色方法有如下几种：

①碘蒸气显色法。由于碘能与很多有机化合物(烷烃和氯代烃除外)可逆地结合形成有颜色的络合物，所以先将几粒碘的晶体置于广口的密闭容器中，碘蒸气很快地充满容器，再将展开后的薄板(溶剂已挥发干净)放入其中并密闭起来，有机化合物即与碘作用而呈现出棕色的斑点。取出薄层板后应立即标记出斑点的位置和形状(因为碘易挥发，斑点的棕色在空气中很快就会消失)，计算Rf值。

②紫外光显色法。如果被分离(或分析)的样品本身是荧光物质，可在暗处在紫外灯下观察到它的光亮的斑点。如果样品并无荧光性，可以选用加有荧光剂的吸附剂来制备薄板，或在制板时加入适量荧光剂，或在制好的薄板上用喷雾法喷洒荧光剂以制取荧光薄板。荧光薄板经点样、展开后取出，标记好前沿，待溶剂挥发干后放在紫外灯下观察。有机化合物在光亮的背景上呈现暗红色斑点。标记出斑点的位置和形状，计算Rf值。

③试剂显色法。除了上述显色法之外，还可以根据被分离(分析)化合物的性质，采用不同的试剂进行显色，一些常用显色剂及被检出物质列在表3-2中。操作时，先将薄层板展开，风干，然后用喷雾器将显色剂直接喷到薄层板上，被分开的有机物组分便呈现出不同颜色的斑点。及时标记出斑点的形状和位置，计算比移值。

(6)计算比移值

*以CMC为粘合剂的硬板不宜用硫酸显色，因为硫酸也会使CMC碳化变黑，整板黑色而显不出斑点位置。