丹红注射液促进鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的实验研究

丹红注射液促进鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的实验研究

唐昱;盛国太;钟志英;葛郁芝

【摘要】目的探讨丹红注射液对鸡绒毛尿囊膜(CAM)血管生成的影响.方法种蛋在(37.5±0.5)℃条件下孵育,第7天开窗暴露CAM建立模型.将60枚存活鸡胚随机分为生理盐水组(N组)、正常血清组(C组)、丹红注射液治疗组(T组)、血管内膜损伤组(I组)、血管内膜损伤后丹红注射液治疗组(IT组)以及血管内皮生成因子(VEGF,20 μg/mL)组(V组),每组10枚鸡胚.新西兰大白兔腹主动脉用球囊导管损伤建立血管内膜损伤模型,丹红注射液治疗组及血管内膜损伤后丹红注射液治疗组于大白兔耳缘静脉注射丹红注射液2 mL/kg,各组连续7 d后取血清.第8天,在鸡胚CAM上放一直径为5 mm的滤膜作为载体,分别加样5 μL,每日1次,连续3 d,第11天取CAM,数码相机拍照后平铺于载玻片上,计数载体周围血管数目及滤膜周围0.5 cm范围内的血管分支点数并进行比较.结果比较CAM周围血管数目,T组(31.80±3.08)条与C组(28.40±3.75)条比较,血管以载体为中心呈辐辏状生长,血管总数明显增多,具有统计学意义;I组(47.30±3.27)条与C组相比较,载体周围血管数量明显增多,具有统计学意义;与IT组(47.60±3.89)条相比较,血管总数无统计学意义.结论含丹红注射液的兔血清能够明显促进CAM上血管生成,血管内膜损伤后的血清和内膜损伤丹红治疗组也分别强于血管内膜未损伤时.

【期刊名称】《中西医结合心脑血管病杂志》

【年(卷),期】2010(008)003

【总页数】2页(P310-311)

【关键词】丹红注射液;血管生成;鸡胚绒毛尿囊膜;内膜损伤

【作者】唐昱;盛国太;钟志英;葛郁芝

【作者单位】江西省人民医院,330006;江西省人民医院,330006;南昌大学第四附属医院;江西省心血管病研究所

【正文语种】中文

【中图分类】R285.5;R289.5

血管生成在缺血性疾病的创伤愈合、组织修复和再生及侧支循环建立过程中发挥着重要作用[1,2]。探讨血管新生的发生机制和研制促进血管生成的治疗方法或药物已经成为近年来医学研究的热点之一。丹红注射液具有抗动脉粥样硬化、缩小心肌梗死面积、抗氧化自由基、减轻心肌肥厚、改善血管内皮功能等作用[3]。本研究应用鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)模型,观察丹红注射液对血管生成的影响,进一步探讨活血化瘀中药的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物新西兰大白兔,体重

2.0 kg～2.5 kg,由南昌大学医学院医学实验动物科学部提供。新鲜白皮种蛋重50 g～60 g,由江西省种鸡厂提供。

1.1.2 药品试剂与仪器重组人血管内皮生长因子(VEGF165,英国 Peprotech公司生产),丹红注射液(商品名:倍通,济南步长制药有限公司),孔径0.45 μ m的混合纤维素微孔滤膜(上海华美生物工程公司)。数码相机(日本索尼公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组将60枚存活鸡胚随机分为生理盐水组(N组)、正常血清组(C组)、丹红注射液治疗组(T组)、血管内膜损伤组(I组)、血管内膜损伤后丹红注射液治疗

组(IT组)以及血管内皮生成因子(VEGF,20 μ g/mL)组(V组),其中N 组为阴性对照组,I组为阳性对照组,每组10枚鸡胚。

1.2.2 模型制作血管内膜损伤模型的建立,新西兰大白兔戊巴比妥钠(30 mg/kg～50 mg/kg)静脉麻醉,无菌条件下,分离右侧髂总动脉,用2.5F球囊导管经右髂动脉逆行插入腹主动脉,(2～4)个大气压下,来回拖拉3次,损伤兔腹主动脉约5 cm,再结扎右髂动脉,缝合皮肤,术后每天给予青霉素8×105 U,连续 5 d。

CAM模型的制作,新鲜白皮种蛋0.01%苯扎溴铵擦洗消毒后放入37.5℃±0.5℃恒温箱中孵育,孵至第7天,75%酒精消毒种蛋大头端及开窗,滴加2滴生理盐水使CAM下陷,与壳膜分离,制成假气室。开窗后第2天揭开透明胶,将直径为5 mm的混合纤维素微孔滤膜小碟放于两条前卵黄静脉之间的相对无血管的 CAM 上,分别加5 μ L各待测物,每24 h加1次,连续加3 d。孵育第11天,揭去透明胶,向假气室内加入10%甲醛,固定20 min,剪下CAM,平铺于加有固定液的玻璃平皿中继续固定,数码相机拍照,并将CAM平铺于载玻片上,阴干保存。

1.2.3 血清的制备丹红注射液治疗组及血管内膜损伤后丹红注射液治疗组均于大白兔耳缘静脉注射丹红注射液2 mL/kg,共治疗7 d。正常血清组和血管内膜损伤组注射等剂量的纯净水。第8天从兔耳缘静脉采取静脉血4 mL,在无抗凝剂的试管中离心,取血清并分装,-20℃保存备用。

1.2.4 血管计数在自然光线下,以虑纸为背景,用数码相机拍照,在显微镜(×10倍)下计载体边缘的血管数目。根据管径将血管分为3类:＞0.1 mm为大血管;0.1 mm～0.05 mm为中血管;＜0.05 mm为小血管。凡属趋向性生长的血管,即以载体为中心发出,与滤膜半径的夹角小于45度者均予计数。计数载体周围0.5 cm内的血管分支点数。

1.3 统计学处理实验数据以均数±标准差(±s)表示,用SPSS 13.0统计软件处理数据,方差齐采用组间t检验,方差不齐采用q检验进行统计分析。

2 结果

2.1 鸡胚发育观察鸡胚在温度37.8℃、湿度40%～70%条件下正常发育。通过照卵灯连续观察胚膜发育情况,可见樱桃珠(2日胚)、蚊虫珠(3日胚)、蜘蛛胚(4日胚)等特征,绒毛尿囊膜透明,血管丰富,脉络清晰,生成情况与孵育时间相吻合。

2.2 各组对鸡胚血管生成的影响生理盐水组载体周围血管数量较少,呈正常的树枝状分布。治疗组血管以载体为中心呈辐辏状生长,血管数量明显增多。与生理盐水组比较,正常血清组血管生成数量无明显差异。血管VEGF组血管生成数量明显多于生理盐水组及正常血清组丹红注射液治疗组血管生成数明显高于正常血清组,与血管VEGF组相似。血管内膜损伤后血清组血管生成现象与VEGF相似,血管以载体为中心呈辐辏状生长,且可见血管吸引现象。血管生成数量不仅明显多于正常血清组,而且较血管VEGF组也明显更多,大、中血管数也较正常血清组及血管VEGF 组明显增多。然而,血管内膜损伤后丹红注射液治疗组与血管内膜损伤组相比,两组血管生成数量无统计学意义。详见表1。

表1 各组CAM上载体周围的血管计数比较(±s)条组别大血管中血管小血管血管总数生理盐水组1.5±0.5 3.5±1.1 20.4±3.9 25.4±3.9正常血清组2.2±1.0 4.5±0.9 21.4±3.2 28.6±3.2血管VEGF组3.6±0.91) 4.9±1.2 24.3±2.4

33.9±3.1丹红注射液治疗血清组3.0±1.02) 4.6±1.2 24.1±2.7 31.8±3.0内膜损伤血清组6.7±1.22) 6.1±1.52) 25.9±2.22) 38.7±3.1内膜损伤丹红治疗组

9.8±1.83) 10.5±2.94) 19.6±5.6 39.1±3.5与正常血清组比较,1)P＜0.05;与血管VEGF组比较,2)P＜0.01;与丹红注射液治疗血清组比较,3)P＜0.01;与内膜损伤血清组比较,4)P＜0.05

3 讨论

丹红注射液为丹参和红花的提取物,具有行气活血、解郁化瘀、养血通脉的功效。本研究采用丹红注射液直接静脉给药取血,避免了传统给药途径所造成的外界因素